KR20180037597A - 시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

시계 유전자의 발현을 변화시키고, 또한, 해당 발현 변화에 의해 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 예의 검토한 결과, 자귀나무 수피의 수추출물이, 시계 유전자의 발현량과 위상을 변화시킨다는 것을 밝혀내었다. 또한, 자귀나무 수피의 수추출물의 경구투여에 의해, 피험자의 오후의 졸음이 감소하고, 또한 각성도, 의욕, 기분 및 집중력이 증가하여, 아침형인 경향이 강해진다는 것을 밝혀내었다.

Description

시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한 조성물{Composition for modifying a clock gene expression}

본 발명은, 자귀나무 수피(樹皮)의 수추출물(水抽出物)을 유효 성분으로 포함하는, 시계 유전자((時計遺傳子)의 발현을 변화시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 해당 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

지구에 존재하는 대부분의 생물은, 외부 환경(주로 명암 사이클)에 따라, 약 24시간 주기로, 생리 기능(수면 각성, 체온 조절, 섭식 배설, 호르몬 분비 등)을 제어하고 있으며, 이러한 생물학적인 일주 변동을 「일주기 생체 리듬(서캐디언 리듬(circadian rhythms)」이라고 부른다.

최근, 이러한 일주기 생체 리듬의 이상(異常)으로 심신의 다양한 부조(不調)가 일어나는 것이 사회적인 문제가 되고 있다. 예를 들면, 항공기 등의 이동에 의한 시차 후유증, 쉬프트 워크(교대 근무) 등에 의한 불규칙한 생활 패턴에 기인한 수면 장해, 야간형 생활(밤샘, 야근 등)에 의한 수면 각성 리듬 등의 변조 등, 생활 환경·노동 환경의 변화 등에 의한 일주기 생체 리듬의 혼란이 일으키는 문제가 많다. 또한, 노화에 따라, 일주기 생체 리듬을 조정하는 멜라토닌 등의 호르몬 분비량이 저하되기 때문에, 수면 각성, 체온 조절 등의 다양한 리듬이, 고령자에 있어서는 감쇠하게 된다. 노후의 수면 장해 등에 의한 QOL의 저하도, 최근의 급속한 고령화와 함께, 사회적인 문제로서 우려되고 있다. 이러한 현상을 감안하면, 일주기 생체 리듬의 변조나 감쇠 등을 해소하고, 나아가서는 상기 수면 장해등을 치료, 개선할 수 있는 방법이 요구되고 있지만, 이러한 방법은 아직도 확립되어 있지 않는 상황에 있다.

　일주기 생체 리듬은, 포유류에 있어서, 좌우의 눈의 망막에서부터 뻗은 시신경이, 뇌내의 시상하부(視床下部)에서 교차하고 있는 시신경 교차 부위(시 교차) 상에 존재하는 직경이 불과 1밀리 정도의 작은 신경 핵인 시교차상핵(SCN)이 제어의 중심이 되고 있다. 그리고, SCN가 만들어 내고 있는 일주기 생체 리듬은, 시계 유전자(Bmal1, Clock, Period, Cryptochrome 등)라고 하는 유전자군에 의해 형성되고 있다. 보다 구체적으로는, 전사 활성화 인자 BMAL1 및 CLOCK 단백질이, Period 및 Cryptochrome 유전자의 발현을 활성화하고, 이에 따라 전사 번역된 Period(PER1, PER2) 및 Cryptochrome(CRY1, CRY2) 단백질이, BMAL1 및 CLOCK 단백질과 상호작용 하는 것에 의해, 스스로의 전사를 억제한다고 하는 네가티브 피드백을 형성하고 있다. 그 후, PER 및 CRY 단백질은, 인산화 및 유비퀴틴화 수식을 받은 후, 프로테아솜(proteasome)으로 분해되기 때문에, 상기 전사 억제제가 해제되게 된다. 그리고, BMAL1 및 CLOCK 단백질에 의한 다음의 사이클이 개시되어 이 사이클의 1주에 약 24시간을 필요로 하는 것이, 일주기 생체 리듬 형성의 분자 메카니즘이다.

이러한 시계 유전자의 피드백 기구는, 간장이나 근육, 폐, 심장이라고 하는 말초 조직, 뇌 안의 SCN 이외의 조직에도 존재하고 있어, 해당 기구에 의해 말초 조직 등에 있어서도 일주기 생체 리듬을 형성하는 것이 밝혀지고 있다. 또한, 그 리듬은, 제어의 중심인 SCN가, 여러가지 조직을 개입시켜 신경·호르몬 등에 의한 시그널을 내는 것에 의해 제어되고 있다.

이와 같이, 일주기 생체 리듬은, 시계 유전자의 발현에 의해 제어된다. 그 때문에, 해당 발현을 변화시키는 것에 의해, 일주기 생체 리듬을 변화시키고, 나아가서는 이러한 리듬 이상에 의한 수면 장해 등을 치료 할 수 있는 물질의 탐색이 진행되고 있다(특허 문헌 1~2).

[특허 문헌 1]　특개 2008－266319호 공보 [특허 문헌 2]　특개 2015－110564호 공보

본 발명은, 상기 종래 기술이 가지는 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 시계 유전자의 발현을 변화시키고, 또한 해당 발현 변화에 의해 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 자귀나무 수피의 수추출물을 마우스 배아 섬유 아세포에 첨가하는 것에 의해, 해당 세포의 시계 유전자(Per2 유전자)의 발현 리듬에 있어서, 그 진폭의 경과적 감쇠를 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 게다가 상기 추출물은, 세포에 대한 투여의 타이밍 여하에 따라, Per2 유전자의 발현 리듬의 피크(위상)를, 농도 의존적으로 전진시키는 것도, 또는 후퇴시킬 수도 있다는 것을, 본 발명자들은 밝혀내었다.

또한, 자귀나무 수피의 수추출물을 마우스에 경구투여하여, 그 말초 조직(간장)에서의 시계 유전자(Per1, Per2, Bmal1)의 발현을 해석하였다. 그 결과, 상기 추출물에 의해, 말초 조직에 대해서도, 시계 유전자의 발현량 및 위상이 변화하는 것을, 본 발명자들은 밝혀내었다.

또, 자귀나무 수피의 수추출물을 사람에게 경구투여한 결과, 상술한 해당 추출물의 시계 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 반영한 것과 같이, 피험자의 아침형인 경향이 강해지고(수면 상태에 들어가는 것이 빠르고, 아침 일찍 일어나는 것도 쉬움), 오후의 졸음이 감소하며, 활동성(각성도, 의욕, 기분 및 집중력)은 향상된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하를 제공하는 것이다.

＜1＞　자귀나무 수피의 수추출물을 유효 성분으로서 포함하는, 시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한 조성물.

＜2＞　시계 유전자가, Per1 유전자, Per2 유전자 및 Bmal1 유전자로 된 군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자인,＜1＞에 기재한 조성물.

＜3＞　일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 조성물인,＜1＞ 또는 ＜2＞에 기재한 조성물.

본 발명에 의하면, 시계 유전자의 발현을 변화시키고, 또한 해당 발현 변화에 의해 일주기 생체 리듬을 변화시키는 것이 가능하게 된다. 그리고, 이러한 변화에 의해, 일주기 생체 리듬에서의 이상(異常)을 해소할 수가 있기 때문에, 본 발명에 의하면, 해당 이상으로 기인하는 질환(일주기 생체 리듬 장해 등)의 치료, 개선(완화) 또는 예방을 하는 것도 가능하게 된다.

도 1은 시계 유전자의 발현 리듬, 또는 그것에 의해 제어되는 일주기 생체 리듬을 개략적으로 나타낸 파형 그래프이다.
도 2는 자귀나무 수피의 수추출물(50 ㎍/㎖ 혹은 100 ㎍/㎖) 또는 대조로서 증류수(DW)를 첨가한, 마우스 배아 섬유 아세포에서의, Per2 유전자의 발현 리듬을 나타내는, 파형 그래프이다. 도면 중에서 횡축은, 각 세포에서의 Per2 유전자등의 시계 유전자의 발현 사이클을 재설정하여 동조시키기 때문에, 덱사메타손(Dexamethasone)을 배지에 첨가한 후의 일수를 나타낸 것이다.
도 3은 마우스에의 자귀나무 수피의 수추출물 투여 시험의 스케줄을 나타낸, 개략도이다.
도 4는 자귀나무 수피의 수추출물(1 mg 혹은 10 mg) 또는 대조(cont. )로서 증류수를 경구투여한 마우스에서의, Per1 유전자의 발현량을 나타낸, 그래프이다.
도 5는 자귀나무 수피의 수추출물(1 mg 혹은 10 mg) 또는 대조(cont. )로서 증류수를 경구투여한 마우스에서의, Per2 유전자의 발현량을 나타낸, 그래프이다.
도 6은 자귀나무 수피의 수추출물(1 mg 혹은 10 mg) 또는 대조(cont. )로서 증류수를 경구투여한 마우스에서의, Bmal1 유전자의 발현량을 나타낸, 그래프이다.
도 7은　마우스에서의 Per1 유전자의 발현량의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다. 또한, 종축은, Per1 유전자의 발현량을, Gapdh 유전자의 것을 기준으로 한 상대값으로 나타낸 것이다. 횡축은, 명암 조건하에서의 시각(ZT；Zeitgeber　Time, 명기 개시 시간을 ZT0로 함)을 나타낸 것이다.
도 8은　자귀나무 수피의 수추출물을 오전 중에 섭취한 사람이, 수면 검사(관서학원대학식 졸음이 오는 척도, KSS)를 받은 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 자귀나무 수피의 수추출물을 오전 중에 섭취한 사람이, 수면 검사(시각적 아날로그 평가 척도, VAS)를 받은 결과(각성도)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 자귀나무 수피의 수추출물을 오전 중에 섭취한 사람이, 수면 검사(시각적 아날로그 평가 척도, VAS)를 받은 결과(의욕)를 나타낸 그래프이다.
도 11은　자귀나무 수피의 수추출물을 오전 중에 섭취한 사람이, 수면 검사(시각적 아날로그 평가 척도, VAS)를 받은 결과(기분)를 나타낸 그래프이다.
도 12는 자귀나무 수피의 수추출물을 오전 중에 섭취한 사람이, 수면 검사(시각적 아날로그 평가 척도, VAS)를 받은 결과(집중력)를 나타낸 그래프이다.
도 13은　자귀나무 수피의 수추출물을 오전 중에 섭취한 사람이, 수면 검사(아침형·야간형 질문지, MEQ)를 받은 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 자귀나무 수피의 수추출물을 석식 때 섭취한 사람이, 수면 검사(아침형·야간형 질문지, MEQ)를 받은 결과를 나타낸 그래프이다.

후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 있어서, 자귀나무 수피의 수추출물은, 시계 유전자의 발현량 및 위상을 변화시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 시계 유전자의 발현 변화를 통해서, 해당 유전자가 제어하는 일주기 생체 리듬도, 상기 추출물이 변화시킬 수가 있다. 따라서, 본 발명은, 자귀나무 수피의 수추출물을 유효 성분으로서 포함하는, 시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, 해당 추출물을 유효 성분으로서 포함하는, 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 조성물을 제공한다.

자귀나무 수피의 수추출물

먼저, 본 발명의 조성물에 대해, 유효 성분으로 포함하는 「자귀나무 수피의 수추출물」에 대해 설명한다. 「자귀나무」는, 콩과 자귀나무 아과에 속하는 낙엽 고목의 식물(Albizia　julibrissin)를 의미한다. 이 자귀나무의 수피를, 다음과 같이 추출 처리를 하는 경우에는, 수피 그대로도 좋지만, 추출 효율을 보다 높인다고 하는 관점에서, 믹서, 블렌더(blender), 균질기(homogenizer), 약절구, 초음파 파쇄기 등에 의해 파쇄 한 다음, 추출 처리하는 것도 좋다.

본 발명에 있어서, 추출 처리에 이용되는 용매로서는, 물 뿐이어도 좋고, 또는, 물 이외에 다른 용매와의 혼합 용매이어도 좋다. 본 발명에 있어서 추출에 이용되는 물로는, 특히 제한은 없지만, 예를 들면, 증류수, 탈이온수, RO수, 초순수를 들 수 있다. 또한, 물과 혼합되는 다른 용매로는 특히 제한은 없지만, 예를 들면, 에탄올, 메탄올 등의 알콜류, 프로필렌 글리콜 등의 다가 알콜류, 초산메틸 등의 에스테르류를 들 수 있다. 또 혼합 비율도 특히 제한은 없지만, 물：다른 용매 = 90 ~ 50：10 ~ 50(체적비)인 것이 바람직하다.

　추출 조건도 특히 제한은 없고, 상기 이용되는 용매에 따라서 다르지만, 예를 들면, 물 만 이용하는 경우에는, 자귀나무의 수피 1 중량부에 대해서 1 ~ 100 중량부의 물을 이용하여 4 ~ 100℃의 온도로, 10분 ~ 7일에 걸쳐 추출하는 것이 바람직하고, 자귀나무의 수피 1 중량부에 대해서 5 ~ 20 중량부의 물을 이용하여 70 ~ 100℃의 온도에서, 30분 ~ 2시간 동안 추출하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 추출 효율을 보다 높인다는 관점에서, 가압, 교반, 초음파 처리 등을, 추출 처리할 때에 함께 수행해도 좋다. 추가로, 이러한 추출 처리 후에, 여과나 원심분리에 의해 찌꺼기와 분리해도 좋다.

본 발명에 따르면, 「자귀나무 수피의 수추출물」은, 추출액의 형태로 본 발명의 조성물에 이용할 수 있지만, 필요에 따라서, 이온 교환법, 겔 여과법, 막 분획법, 전기 투석법, 용매 유출법, 감압 농축법, 가열 처리법등에 의해, 농축하여도 좋다.

더욱이, 「자귀나무 수피의 수추출물」은, 필요에 따라서, 분무 건조(spray-dry)나 동결 건조(freeze-dry) 등의 처리를 실시하는 것에 의해 건조시켜서, 분말로 해도 좋다.

또한, 안전성의 관점에서, 「자귀나무 수피의 수추출물」에는, 살균 처리를 실시해도 좋다. 이러한 살균 처리로는, 가열 살균, 가압 살균, 방사선 살균, 필터 제균 등을 들 수 있다.

또한, 이와 같이 조제된 「자귀나무 수피의 수추출물」은, 예를 들면, 그대로, 본 발명의 조성물로 사용할 수 있고, 후술하는 바와 같이, 다른 성분과 조합하는 것에 의해, 본 발명의 조성물로 사용해도 좋다.

시계 유전자의 발현 또는 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 조성물

다음에, 본 발명의 조성물의 실시형태에 대해 설명한다. 상술한 자귀나무 수피의 수추출물은, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 시계 유전자의 발현을 변화시키는 것에 의해, 일주기 생체 리듬을 변화시키는 활성을 가진다. 따라서, 이것을 유효 성분으로 하는, 본 발명의 조성물은, 후술하는 일주기 생체 리듬 장해의 치료, 개선(완화) 또는 예방을 위한 의약 조성물, 음식품으로서 이용할 수가 있다. 또, 시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한 시약, 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 시약으로서 이용할 수가 있다.

　본 발명에 있어서, 「시계 유전자」란, 일주기 생체 리듬(체내 시계)을 제어하는 기능을 가진 유전자이면 되는 바, 예를 들면, Period 유전자(Per1, Per2, Per3 등), Bmal 유전자(Arntl, Mop3, Tic, Jap3, Pasd3, bHLHe5으로도 호칭되는 유전자, Bmal1, Bmal2 등), Cryptochrome 유전자(Cry1, Cry2 등), Clock 유전자, Ror 유전자, Reｖ－erb 유전자, E4BP 유전자, GSK3β 유전자, CK1 유전자, Dec 유전자 등을 들 수 있지만, 본 발명에 있어서, 바람직하게는, Per1 유전자, Per2 유전자, Bmal1 유전자이다.

전형적으로, 사람의 Per1 유전자는, RefSeq　ID：NP＿002607으로 특정되는 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 유전자(RefSeq　ID：NM＿002616으로 특정되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자)이며, 사람의 Per2 유전자는, RefSeq　ID：NP＿073728로 특정되는 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 유전자(RefSeq　ID：NM＿003894 또는 NM＿022817으로 특정되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자)이며, 사람의 Bmal1 유전자는, RefSeq　ID：NP＿001025443, NP＿001025444, NP＿001169, NP＿001284648또는 NP＿001284651으로 특정되는 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 유전자(RefSeq　ID：NM＿001030272, NM＿001030273, NM＿001178, NM＿001297719또는 NM＿001297722로 특정되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자)이며, 마우스의 Per1 유전자는, RefSeq　ID：NP＿001152839 또는 NP＿035195로 특정되는 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 유전자(RefSeq　ID：NM＿001159367또는 NM＿011065로 특정되는 뉴클레오티드 서열을 포함한 유전자)여, 마우스의 Per2 유전자는, RefSeq　ID：NP＿035196으로 특정되는 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 유전자(RefSeq　ID：NM＿011066으로 특정되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자)이며, 마우스의 Bmal1 유전자는, RefSeq　ID：NP＿001229977 또는 NP＿031515로 특정되는 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 유전자(RefSeq　ID：NM＿001243048 또는 NM＿007489로 특정되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자)이다. 또한, 자연계에서(즉, 비인공적으로) 뉴클레오티드 서열은 변화한다. 따라서, 본 발명에 따른 시계 유전자에는, 전형예로서 열거한 상기 서열에 특정되는 것은 아니며, 이러한 천연의 변이체도 포함된다.

　본 발명에 있어서, 「시계 유전자의 발현」에는, 전사 레벨에서의 발현(mRNA로의 발현) 뿐만 아니라, 번역 레벨에서의 발현(단백질로의 발현)도 포함된다. 또한, 「시계 유전자의 발현의 변화」에는, 시계 유전자의 발현량의 증가 또는 저감에 추가해서, 시계 유전자의 발현 리듬(진폭, 위상 및 주기 길이 중 적어도 하나 1개)이 변화하는 것도 포함된다.

　「진폭」이란, 도 1에 나타낸 바와 같이, 리듬에 있어서의 피크(peak)에서 바탐(bottom)까지의 길이(진동의 크기)를 말하며, 시계 유전자의 발현 리듬에 대해서는, 그 피크로부터 피크, 또는 바탐으로부터 바탐까지의 기간(일주기)에 있어서의 시계 유전자의 발현량의 폭을 나타낸다. 시계 유전자의 발현 리듬 및 그것에 의해 제어되는 일주기 생체 리듬에 대해서는, 노화에 따라, 그 진폭이 감쇠하는 것으로 알려져 있다. 한편, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 자귀나무의 수피 수추출물은, 이러한 감쇠를 억제할 수 있다.

「위상」이란, 일주기의 특정의 위치(예를 들면, 피크, 보텀)를 말한다. 또한, 「주기 길이」란, 도 1에 나타낸 바와 같이, 리듬에 있어서의 일주기의 길이(기간)를 말하며, 사람이라면 본래(정상) 약 24.3시간이다. 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 자귀나무 수피 수추출물은, 투여하는 또는 섭취하는 타이밍에 의해서, 시계 유전자의 발현 리듬 및 그것에 의해 제어되는 일주기 생체 리듬의 위상을 전진(도 1에 있어서는 파형을 좌측으로 쉬프트) 또는 후진(도 1에 있어서는 파형을 우측으로 쉬프트)시킬 수가 있기 때문에, 본 발명에 의하면, 후술하는 일주기 생체 리듬 장해 등에 대해 어긋난 위상을, 본래(정상)의 위상으로 조절할 수가 있다.

이와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물에 의해, 시계 유전자의 발현 리듬 및 그것에 의해 제어되는 일주기 생체 리듬에 있어서의 이상(진폭의 감쇠나, 위상의 차이 등)을 해소할 수가 있기 때문에, 상기 추출물을 유효 성분으로 하는 본 발명의 조성물에 의하면, 해당 이상으로 기인하는 질환(일주기 생체 리듬 장해 등)의 치료, 개선(완화) 또는 예방을 할 수가 있다.

일주기 생체 리듬 장해로는, 예를 들면, 수면상 전진 증후군(ASPS), 수면상 후퇴 증후군(DSPS), 비24시간 수면 각성 장해, 불규칙형 수면 각성 장해, 시차 후유증(시간대역 변화 증후군, 제트 시차 증후군), 쉬프트 워크에 의한 리듬 변조(교대 근무 수면 장해), 야간형 생활(밤샘, 야근 등)에 의한 생활 리듬의 변조, 고령자의 리듬 소실 등을 들 수 있다. 또한 이들 일주기 생체 리듬 장해에 부수 하는 불면, 컨디션 부진, 주의 결손, 의욕 저하, 피부염 등의 제증상의 치료, 개선(완화) 또는 예방 등에 대해도, 본 발명의 조성물은 유효하다.

　또, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 정상인이었다고 해도, 자귀나무 수피의 수추출물을 섭취시키는 것에 의해, 대상의 아침형 경향은 강해지며, 오후의 졸음은 감소하고, 활동성(각성도, 의욕, 기분 및 집중력)은 증가한다. 따라서, 본 발명의 조성물은, 생활 리듬(생활 습관)을 아침형으로 이행시키기 위한 조성물로서도 유용하다. 또한, 본 발명에 있어서, 「아침형」이란, 아침 일찍에 기상하여, 오전서부터 활동하여, 밤에는 일찍 잠자리에 들어가는 생활 리듬(생활 습관)을 의미하며, 예를 들면, 아침형·야간형 질문지(MEQ；Morningness－Eｖeningness　Questionnaire)에 의해 평가할 수 있다(이시하라 카네요시(石原金由) 등, 「일본어판 아침형-야간형(morningness－eveningness) 질문지에 의한 조사 결과」, 심리학 연구, 1986년, 57권, 87~91 페이지 참조).

본 발명의 조성물은, 공지의 제제학적 방법에 의해 제제화할 수가 있다. 예를 들면, 캡슐제, 정제, 환제, 액제, 산제, 과립제, 세립제, 필름 코팅제, 펠릿제, 트로키(troche)제, 설하제, 저작제(chewable), 구강제(buccal), 페이스트제, 시럽제, 현탁제, 에리키실제(elixir), 유제, 도포제, 연고제, 경고제, 퍼프제(cataplasm), 경피 흡수형 제제, 로션제, 흡인제, 에어졸제, 주사제, 좌제 등으로서 경구적 또는 비경구적으로 사용할 수가 있다. 그렇지만, 투여 대상에 대한 부담을 적게 한다는 관점에서, 본 발명의 조성물은, 경구용 조성물로서 이용하는 것이 바람직하다.

이들 제제화에 대해서는, 약리학상 혹은 음식품으로서 허용되는 담체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 용제, 기제, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향미제, 방향제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제, 희석제, 등장화제, 무통화제, 증량제, 붕괴제, 완충제, 코팅제, 활택제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미 교취제, 용해 보조제 혹은 그 외의 다른 첨가제 등을 적당히 조합할 수가 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 음식품으로서 이용하는 경우, 해당 음식품은, 예를 들면, 건강식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 기능성 표시 식품, 영양 보조 식품, 환자용 식품, 식품 첨가물 또는 동물용 사료일 수 있다. 본 발명의 음식품은, 상기와 같은 조성물로서 섭취할 수가 있는 것 외에, 여러 가지의 음식품으로 섭취할 수도 있다. 음식품의 구체적인 예로서는, 식용유, 드레싱, 마요네즈, 마가린 등의 유분을 포함한 제품；스프류, 유음료, 청량 음료수, 차음료, 알코올 음료, 드링크제, 젤리상 음료, 기능성 음료 등의 액상 식품; 밥류, 면류, 빵류 등의 탄수화물 함유 식품；햄, 소세지등의 축산 가공 식품；어묵, 건어물, 젓갈 등의 수산 가공 식품；채소 절임 등의 야채 가공 식품；젤리, 요구르트 등의 반고형상 식품；된장, 발효 음료등의 발효식품；양과자류, 일본식 과자류, 캔디류, 껌류, 사탕, 냉과, 빙과 등의 각종 과자류；카레, 고명, 중화 스프 등의 리토르트 제품；인스턴트 스프, 인스턴트 된장국 등의 인스턴트 식품이나 전자 렌지 대응 식품 등을 들 수 있다. 또한, 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 액상, 페이스트상 또는 젤리상으로 조제된 건강 음식품도 들고 있다.

본 발명의 조성물은, 어느 생물을 대상으로도 사용할 수가 있지만, 특히 사람을 포함하는 동물에 매우 적합하게 이용된다. 사람 이외의 동물로서는 특히 제한은 없지만, 여러 종류의 가축, 가금, 애완동물, 실험용 동물 등을 대상으로 할 수가 있다. 구체적으로는, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 닭, 오리, 타조, 집오리, 개, 고양이, 토끼, 햄스터, 마우스, 래트, 원숭이를 들 수 있지만, 이것들에 제한되지 는 않는다.

본 발명에 있어서의 음식품의 제조는, 해당 기술 분야에 공지의 제조 기술에 의해 실시할 수가 있다. 해당 음식품에 대해서는, 일주기 생체 리듬 장해 등의 개선 또는 예방에 유효한, 1종 또는 2종 이상의 성분 혹은 다른 기능성 식품을 첨가하여도 좋다. 또, 해당 개선 등 이외의 기능을 발휘하는 다른 성분 혹은 다른 기능성 식품과 조합하여서 되는 다기능성의 음식품이라고 해도 좋다.

본 발명의 조성물을 투여 또는 섭취하는 경우, 그 투여량 또는 섭취량은, 대상의 연령, 체중, 증상, 건강 상태, 조성물의 종류(의약품, 음식품 등) 등에 따라서, 적당히 선택해야 하지만, 사람(성인)을 대상으로 하는 경우, 1일에 1회 혹은 수회로 나누어, 자귀나무 수피의 수추출물을, 10 ~ 1000 mg 투여하는 것이 바람직하고, 50 ~ 200 mg 투여하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명의 조성물의 투여 등의 타이밍은, 일주기 생체 리듬이 어떻게 어긋났는지(전진 또는 후퇴)에 따라야 하지만, 바람직하게는 오전 중, 보다 바람직하지는 오전 7 ~ 10시 사이, 보다 더 바람직하지는 오전 8 ~ 9시 사이이다. 더욱이 본 발명의 조성물은 계속적으로(적어도 3일간 계속해서, 보다 바람직하게는 10일 이상 계속해서) 투여등 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 제품(의약품, 음식품, 시약) 또는 그 설명서는, 시계 유전자의 발현을 변화, 및/또는, 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위해 사용되는 취지의 표시를 붙인 것일 수 있다. 여기서 「제품 또는 설명서에 표시를 붙였다」라는 것은, 제품의 본체, 용기, 포장 등에 표시를 부착하거나, 혹은 제품의 정보를 공개하는 설명서, 첨부 문서, 선전물, 그 외의 인쇄물 등으로 표시를 붙인 것을 의미한다.

또한, 본 발명은, 이와 같이, 본 발명의 의약 조성물을 대상(예를 들면, 일주기 생체 리듬 장해를 앓고 있는 사람)에 투여하는 것을 특징으로 하는, 대상의 일주기 생체 리듬의 변화를 수반하는, 질환의 치료 또는 예방의 방법도 제공한다.

실시예

이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

＜자귀나무 수피의 수추출물의 조제＞

자귀나무의 수피(주식회사 영 포레스트 제)에, 그의 10배의 중량의 증류수를 첨가하고, 오토클레이브(100℃, 60분)에서 처리하였다. 얻어진 추출물을, 스텐레스 메쉬(망 크기：150 ㎛, 토쿄 스크린 주식회사 제, 망체, 품번：635－54－18－41)에 통과시켰다. 얻어진 여과액을 No. 193 여과지(ADVANTEC사 제)에 추가로 통과시켜서, 합계 2회의 여과 처리를 실시한 후, 로터리 증발기(도쿄이화기계 주식회사 제, N－1300형)를 이용하여 고형분이 5%가 될 때까지 농축하였다. 그 다음에, 얻어진 농축액을, 덱스트린(삼화전분공업 주식회사 제, 선테크(Sundek))과 혼합하고, 가열살균 처리(90℃, 60분)에 제공한 다음, 동결 건조기(AGC 테크노 글래스 주식회사 제, FRD－82M)에서, 건조 분말로 하였다.

또한, 이와 같이 하여서 얻어진 건조 분말에서, 자귀나무 수피의 수추출물과 덱스트린과의 비율은 1：3이다. 자귀나무 수피의 수추출물은, 흡습성이 높고 물성이 변화하기 쉽기(굳어버림) 때문에, 상기와 같이 부형제로서 덱스트린을 첨가하였다. 또한, 건조 분말에 있어서의 자귀나무 수피의 수추출물은, 추출 처리에 제공한 자귀나무 수피의 6~8 질량%이었다.

　(실시예 2)

　＜세포 감작 시험＞

　PER2：：LUC　MEF(마우스 배아 섬유 아세포)를, 10%의 소 태아 혈청(FBS), 0.1 mM의 D－루시페린·나트륨염을 함유하는 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)에서 유지 배양하였다. 그리고, 덱사메타손을 상기 배지에 200 nM가 되도록 첨가하고 2시간 동안 배양한 후, 덱사메타손을 함유하지 않는 상기 배지로 교환하여 배양하였다. 이어서, 덱사메타손을 첨가하고, 2.4일 후±2시간 동안, 상기와 같이 제조한 자귀나무 수피의 수추출물을 포함하는 건조 분말을, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖가 되도록 배지에 첨가하여 30분간 배양한 후, 자귀나무 수피의 수추출물을 함유하지 않는 상기 배지로 교환하여 배양을 계속하였다. 또한, 덱사메타손 처리 후 5.5일동안, 세포는, 37℃, 5% CO₂로 설정되어, 루미사이클(LumiCycle32, Actimetrics)이 설치된 배양기 내에서 배양하고, PER2 유전자의 발현 리듬을 해석하였다. 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다.

또한, PER2：：LUC　MEF는, Per2：：루시페라제 녹크 인 마우스(luciferase knock-in mouse)에서 단리된 배아 섬유 아세포이다. 또한, 해당 마우스는, Per2 유전자 하류에 반딧불 루시페라제 유전자가 도입되어 있기 때문에, Per2 유전자의 발현 리듬은 루시페린-루시페라제 반응에 의한 발광 리듬에 따르는 것이 가능하다(Narishige　S. 들, Br　J　Pharmacol., 2014년 12월, 171권, 24호, 5858~5869 페이지 참조).

또한, 합성 부신 피질 호르몬(합성 당질 코르티코이드(corticoid))인 덱사메타손은, 말초 장기(세포)의 일주기 생체 리듬 동조 인자로도 기능하기 때문에, 각 세포에 있어서의 시계 유전자의 발현 사이클을 재설정하고 동조시키기 위해, 상기한 바와 같이, PER2：：LUC　MEF에 첨가하였다.

또한, Per2 유전자의 발현 리듬(발광 리듬)의 해석에 대해서는, 루미노사이클에서의 계측 데이터(RAW 데이터)에서 24시간 분량의 이동 평균값을 만드는 데이트랜드(daytrend) 처리를 실시한 후, 2시간 분량의 이동 평균값을 평활화하는 평활화 처리를 실시하고, 이 파형 데이터의 발광값의 peak값을 산출하였다(Hayasaka N. 들, Endocrinology, 2007년, 148권, 7호, 3316 ~ 3326 페이지, Ohta　H. 들, PLoS　ONE, 2008년, 3：e2601　참조). 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이 peak2 및 peak3의 값의 변화를 해석하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

　(실시예 3)

　＜마우스에의 투여 시험＞

　도 3에 나타낸 바와 같이, 7주령 암컷 ICR 마우스에, 자귀나무 수피의 수추출물(상기한 바에 따라 제조한 건조 분말 1 mg 혹은 10 mg를 증류수에 용해한 것) 또는 증류수를, ZT4(12：00)의 타이밍에, 3일간 존데(체내의 진단이나 치료에 쓰이는 막대기 모양의 기구)를 이용하여 강제적으로 경구투여하였다. 그리고, 투여 마지막 날의 ZT5.5에, 이러한 마우스를 해부하고, 간을 적출하였다. 그 다음에, 적출한 간으로부터 토탈 RNA를 추출하고, cDNA에 역전사한 후, Per1, Per2 및 Bmal1 유전자의 발현량을 리얼타임 PCR에서 해석하였다. 얻어진 결과를 도 4 ~ 6에 나타내었다.

(실시예 4)

＜사람에의 투여 시험＞

아래와 같은 조건으로, 자귀나무 수피의 수추출물을 10일간 매일 사람에게 섭취하도록 하고, 수면 검사를 받도록 하였다(수면 검사법에 대해서는, 마츠우라 마사토(松捕雅人) 편집, 「수면 검사학의 기초와 임상」, 주식회사 신흥 의학 출판사, 2009년 8월 10일 발행, 149~155 페이지 참조만 함).

피험자：29~49세, 정상인(남성 5명, 여성 4명, 합계 9명)

섭취：상기한 바와 같이 제조한 건조 분말 100 mg를 캡슐(주식회사 힐하프 종합연구소제, 젤라틴 캡슐)에 넣은 것을, 10일간, 오전 8：30 ~ 9：00시 사이에 경구로 물과 함께 섭취하도록 하였다.

수면 검사：자귀나무 수피의 수추출물의 섭취 전날 및 10 일째의 13 ~ 16시의 타이밍에, 아래와 같이 KSS 및 VAS를 실시하여, 졸음을 평가하였다. 또, 자귀나무 수피의 수추출물의 섭취 전날 및 10 일째에, 아래와 같은 MEQ에서의 아침형·야간형의 경향을 조사하였다.

간세이 학원대학식 졸음 척도(KSS；Kwansei－Gakuin　sleeping　scale)

KSS는, 스탠포드 졸음 척도를 참고해서 일본어판으로 작성된 졸음의 질문지로서 22개 항목으로부터 구성되어 있다. 각각의 항목에는 0~7점의 척도값이 부여되고 있으며, 숫자가 클수록 강한 졸음을 나타낸다. 선택한 항목(복수 선택가능)의 평균 척도값을 졸음 점수로 산출한다(이시하라 카네요시(石原金由) 등, 「수면의 척도와 그 실험적 검토」, 심리학 연구, 1982년, 52권, 362 ~ 365 페이지 참조). 얻어진 결과(합계 9명의 피험자의 평균값)를, 도 8에 나타내었다.

시각적 아날로그 평가 척도(VAS；Visual　analog　scale)

시각적 아날로그 평가 척도(VAS)에 의해, 피험자의 주관적인 수면을 평가한다. 보다 구체적으로는, 100 mm의 직선의 좌우 양단에 「전혀 졸리지 않다」, 「매우 졸리다」등의 단어를 적어 두었다가 지금의 상태에 가깝다고 생각되는 위치에 수직선을 그어 주는 방법으로 한다. 0의 지점으로부터 수직선까지의 거리를 mm 단위로 측정하고, 그 수치를 졸음 점수로 한다. 점수는 1 mm 당 1점으로 하고, 0 ~ 100점의 점수로 한다. 이번에는 각성도 이외에 의욕, 기분, 기대, 신체적 피로, 집중력, 식욕, 자신도의 총 8개 항목으로 조사를 실시하였다. 얻어진 결과(총 9명의 피험자의 평균값)를, 도 9 ~ 12에 나타내었다.

아침형·야간형 질문지(MEQ；Morningness－Eｖeningness　Questionnaire)

MEQ는, 수면·각성 리듬의 개인차, 생활 스타일의 리듬 지향을 검토하는 질문지이며, 19개 항목의 질문으로 구성되어 있다. 각각의 항목에 대한 답변에 따라 점수가 부여되고, 그 총 점수가 높을수록 아침형의 경향이 있다고 평가한다(이시하라 카네요시(石原金由) 등, 「일본어판 아침형-야간형(morningness－eveningness) 질문지에 의한 조사 결과」, 심리학 연구, 1986년, 57권, 87~91 페이지 참조). 얻어진 결과를, 도 13에 나타내었다. 또한, MEQ에 관해서는, 오전중(8:30 ~ 9：00)에 섭취하는 대신에, 석식 시에 자귀나무 수피의 수추출물을 섭취하는 피험자도 준비하고, 이 검사를 받아달라고 하였다. 얻어진 결과(총 9명의 피험자의 평균값)를 도 14에 나타내었다.

도 2에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물을 마우스 배아 섬유 아세포에 첨가하는 것에 의해, 해당 세포의 시계 유전자(Per2 유전자)의 발현 리듬에 있어서, 그 진폭의 경과적 감쇠를 억제하였다(Per2의 유전자 발현 레벨을 유지하였다). 또한, 표 1에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물을 Per2 발현 리듬의 점차 감소 과정에서 세포에 첨가했을 경우에는, 이 발현 리듬의 피크(위상)는 농도 의존적으로 전진하였다. 한편, 도면에는 표시되어 있지 않지만, 이 추출물을 Per2 발현 리듬의 점차 증가 과정에서 세포에 첨가했을 경우에는, 이 발현 리듬의 피크(위상)는 농도 의존적으로 후퇴하는 것으로 밝혀졌다.

　따라서, 투여의 타이밍에 의한 위상을 전후 어느 쪽으로도 작동시킬 수 있다는 것에서 부터, 자귀나무 수피의 수추출물은, 시계 유전자의 발현량 및 위상의 조절에 이용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

　또한, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물을 마우스에 경구투여한 결과, 말초 조직(간)의 Per1 유전자 및 Per2 유전자의 발현량은, 투여량 의존적으로 감소하였다. 한편, 도 6에 나타낸 바와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물 투여에 의해 말초 조직에서 Bmal1 유전자의 발현량은 증가하였다.

또한, 포유동물에 있어서, BMAL1 단백질은 CLOCK 단백질과 헤테로 이량체를 형성하고, Period 유전자(Per1, Per2)의 전사를 촉진한다. 또한, 다른 한편으로, PER 단백질은 CRYPTOCHROME 단백질과 헤테로 이량체를 형성하고, BMAL1 단백질 및 CLOCK 단백질의 활성을 억제한다. 그리고, 이러한 피드백 루프에 의해 일주기 생체 리듬은 조정되고 있으며, 또 Period 유전자와 Bmal1 유전자의 발현 리듬은, 거의 12시간 어긋나 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 도 4 ~ 6에서 나타내는 시계 유전자(Per1 및 Per2와 Bmal1)의 발현량에서의 변화의 불일치는, 발현 리듬에서, Per1 및 Per2와 Bmal1가 역상의 관계에 있다는 것을 반영한 것으로 생각된다.

또한, 마우스(자귀나무 수피의 수추출물 비투여)에서의 ZT0 ~ 24의 3시간 마다의 Per1 유전자 발현량의 변화(도 7 참조)를 참작하면, 자귀나무 수피의 수추출물 투여 마우스에 있어서 ZT5.5의 Per1 유전자 발현량은 감소하고 있었기 때문에, 이 유전자의 발현 리듬의 위상은 후퇴하고 있음을 시사한다.

이상의 마우스에 있어서의 결과로부터, 자귀나무 수피의 수추출물을 경구섭취하는 것에 의해, 말초 조직의 시계 유전자의 발현량 및 위상의 조절에 이용할 수 있다는 것도 밝혀졌다.

또한, 도 8 ~ 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물을 사람에 경구투여한 결과, 해당 추출물에 의해 오후의 졸음은 개선되었고(KSS 스코어의 감소), 또 각성도, 의욕, 기분, 집중력에 대해도 의미가 있게 개선된 것(VAS 스코어의 증가)이 밝혀졌다.

또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 자귀나무 수피의 수추출물을 오전중, 사람에게 경구투여한 결과, 아침형 경향이 보다 강해지는 것(MEQ 스코어의 증가)이 밝혀졌다. 다른 한편으로, 도 14에 나타낸 바와 같이, 이 추출물을 오후(석식 때)에 투여하여도, MEQ 스코어의 의미가 있는 변화는 관찰되지 않았다.

이상대로, 자귀나무 수피의 수추출물의 경구투여에 의해, 오후의 졸음은 감소하고, 또 각성도, 의욕, 기분 및 집중력이 증가하여, 아침형 경향이 강해졌다. 이 때문에, 해당 추출물의 섭취에 의해, 시계 유전자의 발현 리듬이 변화하고, 한층 더 일주기 생체 리듬이 변화한 결과, 잠자리에 빨리, 아침 일찍 일어나기 쉬워져, 한층 더 오후의 졸음이 감소하는 한편, 활동성이 향상된 것으로 추측된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 시계 유전자의 발현을 변화시키고, 또한 해당 발현 변화에 의해 일주기 생체 리듬을 변화시킬 수가 있다. 또한 이러한 변화를 일으키는 것에 의해, 일주기 생체 리듬의 이상을 해소할 수가 있기 때문에, 본 발명의 조성물은, 해당 이상으로 기인하는 질환(일주기 생체 리듬 장해 등)의 치료, 개선(완화) 또는 예방을 하기 위한 의약품, 식품 등으로 유용하다. 또한, 본 발명의 조성물은, 시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한, 또한, 해당 발현 변화에 의해 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 시약으로도 유용하다.

Claims (3)

1. 자귀나무 수피의 수추출물을 유효 성분으로서 포함하는, 시계 유전자의 발현을 변화시키기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서, 시계 유전자가, Per1 유전자, Per2 유전자 및 Bmal1 유전자로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자인, 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일주기 생체 리듬을 변화시키기 위한 조성물인, 조성물.

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