CN111480841A - 具有神经营养功能的植物提取物，其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种来自咖啡树的具有神经认知功能调节作用的咖啡果天然提取物极其制备方法和应用。本发明的咖啡果天然提取物包含多种绿原酸组分和植物分类化合物，相对于咖啡因和单一的绿原酸，含量高于咖啡豆，具有更强的抗氧化性，可显著提高受试者血浆中和外来体重的BDNF水平，显著提高志愿者细胞外O2形成，降低ROS生成，显著改善大脑的默认模式网路和任务很概念网络测试结果，试验表明，本发明咖啡果天然提取具有改善神神经认知功能和情绪健康的效果，可用于辅助治疗记忆减退、老年痴呆症、多动症、孤独症、抑郁症等多种疾病的辅助食疗，具有广阔的商业前景。

Description

具有神经营养功能的植物提取物，其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及保健食品技术领域，具体涉及一种对记忆力具有神经营养功能的植物提取物及其制备方法和应用。
背景技术
人在出生后，在青少年发育时期，认知能力、信息接受能力和记忆力和情绪健康调节能力开始增强，在30岁时达到高峰值，随后开始下降，50岁后记忆力急剧下降。目前我国已经进入了老龄化的社会。65 岁以上人群约为5％，85岁以上人群约为20％。目前大约有6000万的痴呆患者。痴呆的总患病率为2.9％，而在65岁以上患病率达到了5.22％。预计到2025年我国比例将占全国人口的20％左右。记忆力衰退，老年痴呆，严重威胁着我们的生活质量，也将给社会发展带来沉重的负担。随着社会生活节奏加快，新事物的不断出现，社会环境也对人类的情绪健康提出了更高的要求。部分人群情绪健康调节能力低下，给自身和社会造成了极大的负面影响，甚至危害社会安全。
认知能力、信息接受能力和记忆力和情绪健康调节能力都是以神经细胞的生理活动为基础。神经细胞是一种终极分裂细胞，在0-6岁人脑发育定了以后，几乎不会再增加一个脑细胞，也就是死一个少一个，长期以来，人们简单地理解为神经不可再生，在很大程度上制约了脑病后遗症的康复和治疗。实质上，神经系统恢复支配能力，肢体功能才能恢复。近年来，人们发现了一种全称“脑源性神经营养因子”(BDNF) 所述，分子量为12.3KD的碱性蛋白化合物，其氨基酸序列含量为55％～60％。它不但对多种神经元的发育分化和生长再生具有维持和促进作用，也能挽救损伤的脊髓运动神经元和感觉神经元。BDNF首先在中枢神经系统的神经元中发现，它主要在下丘脑、皮质及前脑基底部的突触部位表达。调查显示，大脑产生越多的BDNF,也就会产生越多的脑细胞。不仅如此，它还会帮助大脑建立新的连结。这些增长的脑细胞和连结，不仅可以增强你的记忆力、专注力和警惕性，它还可以提升你的技能，就像驾驶一辆小汽车，或者是一架飞机。
目前市面上针对老年痴呆的药物不少，但改善效果一般，尚无特效药物。由美国政府资助的科研小组正在研发的“忘忧药”，实际上就是脑源性神经营养因子(BDNF)。国内的万通口服液，也就是脑蛋白水解物口服液，包括BDNF，主要用于用于因脑神经受损或发育不全引起的各类脑病，如帕金森、小儿脑瘫、脑中风、老年痴呆、脑外伤后遗症等，具修复脑神经细胞，恢复神经系统功能的作用。
这些药物都是外源性补充BDNF。通过外源性补充BDNF具有容易在消化道环节被降解的缺陷。市场上急需开发新型的可从内源性机制有效提高人体内BDNF水平，同时可克服BDNF体内降解缺陷的产品。
发明内容
本发明的发明人惊奇的发现咖啡树果实提取物这个全自然提取物，是有效的抗氧化剂，将咖啡树果实在机械或超声等条件下提取并用水溶性有机溶剂回流提取，能够获得具有较高抗氧化活性的果实提取物，该提取物具有提高人体血液中的BDNF含量，从而营养神经改善脑认知活动的功能，解决了从咖啡树果实提取具有较高抗氧化活性的脑功能调节组合物的技术问题，得到了本发明。
本发明的目的，是提供一种包括神经元保护、神经营养、支持改善感知和认知功能、改善记忆、调节情绪、提高警觉性、改善注意力和大脑的任务执行能力的新型产品极其制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种具有神经营养功能的植物提取物的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)取咖啡果实，破碎进后行渣滓分离，过滤后得到果浆；
(2)高温下加入水溶性溶剂浸提，得到浸提液；
(3)浓缩；
(4)干燥；
(5)过筛；
其中，
步骤(1)所述破碎包括机械破碎和超声波破碎，或所述破碎选自机械破碎和超声波破碎中的一种。
在一实施方式中，步骤(2)所述水溶性溶剂包括水和乙醇，所述浸提包括高温水浸泡煎煮和水溶性有机溶剂回流提取后浓缩。减压蒸馏；其中，相对于1kg咖啡果实，所述水溶性有机溶剂的用量为5-12L；
在一实施方式中，所述水溶性有机溶剂为乙醇。本发明第一方面所述制备方法的目标产物为水溶性，乙醇属于亲水性有机溶剂，对各类化学成分的溶解度都较好，提取成分全面，适于提取多种植物来源的组分。而且乙醇挥发性强，相对于水提取效率高，同时可挥发完全，在产物中无残留，是最佳的水溶性有机提取溶剂。
在本发明一实施方式中，步骤(2)所述浸提方法为乙醇加热回流提取。加热回流提取优点为提取效率高，可最大程度提取咖啡果实中的脑神经营养功能组分。
所述高温浸泡煎煮的温度为40℃～60℃，所述高温浸泡煎煮的时间为1-2小时；40℃～60℃是植物特别是水果中大多数组分可最高程度溶出到水溶性提取溶剂又不会造成目标组分破坏和过度损失的温度范围。 1-2小时的浸泡煎煮时间和回流提取时间为可最高程度溶出到水溶性提取溶剂又不会造成目标组分破坏和过度损失的时间长度范围。
在本发明一实施方式中，步骤(3)所述浓缩为真空减压浓缩。
真空度为为
Figure RE-GDA0002549715070000021
45℃～55℃下真空旋在水浴温度
Figure RE-GDA0002549715070000022
待浓缩液进液流速为
Figure RE-GDA0002549715070000023
的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇转减压蒸发浓缩6～12min，得到咖啡果实粗提液；
在本发明一实施方式中，步骤(3)所述浓缩为减压蒸馏。减压蒸馏可以控制真空度和温度以得到不同的馏分。减压蒸馏的目的在于提纯产物，适合于温度高会分解的目标组分的浓缩。对于高温容易分解的组分采用减压浓缩可避免目标组分的损失。
在一具体实施例中，所述减压浓缩的条件为在水浴温度
Figure RE-GDA0002549715070000025
真空度
Figure RE-GDA0002549715070000026
待浓缩液进液流速为
Figure RE-GDA0002549715070000024
的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇。
在一实施方式中，旋转蒸发浓缩也是除掉溶剂的较佳方式。一般低沸点的溶剂选择旋蒸。在一实施方式中，乙醇作为回流提取溶剂，乙醇为低沸点溶剂，因此选择旋转蒸发去除残留乙醇。
步骤(4)所述干燥为-45℃～-55℃下进行冷冻干燥16—48h，得到咖啡果实的干燥粗提物，所述咖啡果实的干燥粗提物的含水量为2～5％重量百分比；
冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中。其原理是利用升华的原理进行干燥的一种技术，是将被干燥的物质在低温下快速冻结,然后在适当的真空环境下,使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出的过程.冷冻干燥得到的产物称作冻干物(lyophilizer)，该过程称作冻干(lyophilization)
冷冻干燥具有如下特点：
(1)在低温下进行，可保留新鲜食品的色香味及维生素C等营养物质，特别适合易氧化食品的干燥。
(2)由于物料中水分存在的空间在水分升华后基本维持不变，故干燥后制品不失原有的固体框架结构，保持原有形状；
(3)升华时候原来均匀溶于水的无机盐就地析出，避免了因物料内部水分向表面扩散时候携带无机盐而造成表面硬化现象，制品复水后容易回复原有性质和形状。
(4)升华所需的热可用常温提供，热能利用经济性好。、
(5)操作在高真空和低温进行，需要高真空专用设备和制冷设备，生产成本高。
冷冻干燥过程中的冻结过程非常重要，因为在冻结中形成的冰晶形态和大小以及玻璃化程度不仅影响后继的干燥速率，而且影响冻干药品的质量。因此在冻结过程中必须考虑配方、冻结速率、冻结方式、以及是否退火等问题。全域过冷结晶按冻结速率的快慢可分为慢速冻结和快速冻结。快速冻结的冰晶细小，而且没有冻结浓缩现象，但是存在不完全冻结现象。相反，慢速冷却产生较大的冰晶，并且存在冻结浓缩的现象。本领域常用的冷冻干燥冻结方式包括定向结晶和全域过冷结晶
定向结晶是指一小部分目标产物液处于过冷状态下进行冻结的方式。
采用定向结晶方式的冻结产物的干燥速率比全域过冷结晶的快。
步骤(5)所述过筛为将步骤(4)所得咖啡果实干燥粗提物过150-300目筛，得到改善记忆力的植物提取物终产物细粉。
本发明第一方面所述的具有神经营养功能的植物提取物的制备方法，其特征在于，步骤一所述的咖啡果实为鲜果或冷冻贮藏的果实，其中所述冷冻贮藏的果实需在室温下放置40min～90min后再进行破碎。
本发明第一方面所述的具有神经营养功能的植物提取物的制备方法，其特征在于，所述水溶性有机溶剂为水或50％-90％的乙醇，所述回流提取的温度为50-65℃，所述减压蒸馏回收乙醇的压力为0.05-1MPA, 所述减压蒸馏回收乙醇的温度为55-65℃
本发明第一方面所述的制备方法得到的咖啡果实提取物。
本发明第一方面所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述咖啡果实提取物富含抗氧化组分绿原酸类化合物和植物酚类化合物。
本发明第一方面所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述绿原酸类化合物包括5-咖啡酰奎宁酸 (CQA)、咖啡因和3，5-阿魏酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸和5-阿魏酰奎宁酸，所述绿原酸类化合物具有抗氧化能力。
所述植物酚类化合物包括槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、原花青素二聚体、儿茶素、槲皮素-O-芸香糖苷、表儿茶素和原花青素A型三聚体。
本发明第一方面所述的咖啡果实提取物，其中，所述绿原酸类化合物优选5-咖啡酰奎宁酸，咖啡因，所述植物酚类化合物优选槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法得到的咖啡果实提取物。
本发明第二方面所述的咖啡果实提取物，其中，所述咖啡果实提取物富含抗氧化组分绿原酸类化合物和植物酚类化合物。
本发明第二方面所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述绿原酸类化合物包括5-咖啡酰奎宁酸 (CQA)、咖啡因和3，5-阿魏酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸和5-阿魏酰奎宁酸，所述绿原酸类化合物具有抗氧化能力，所述植物酚类化合物包括槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、原花青素二聚体、儿茶素、槲皮素-O-芸香糖苷、表儿茶素和原花青素A型三聚体。
本发明第二方面所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述绿原酸类化合物优选5-咖啡酰奎宁酸，咖啡因，所述植物酚类化合物优选槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。
第三方面，本发明提供过了一种包含第一方面所述咖啡果实提取物的调节和改善神经营养功能相关的大脑生理活动的膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品，其中，所述膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品包含本发明第二方面所述的咖啡果实提取物2-4重量份，所述膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品还包括核桃2-4重量份，花生4-8重量份，茯苓1-2重量份，枸杞1-2重量份，山药1-2重量份，五味子1-2重量份，淀粉8-10重量份中的一种或多种，所述膳食补充剂的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、口服液，所述用于特定健康用途的功能食品包括固体食品、半固体食品和凝胶、饮料、滴剂、糖果、口香糖、橡皮糖、酸奶、冰淇淋、布丁、软小豆胶、果冻、饼干、茶、软饮料、果汁、牛奶、咖啡、谷类，所述固体食物包括巧克力和营养棒，所述半固体食物包括奶油和果酱，所述饮料包括清凉饮料、乳酸菌饮料；所述膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品还包括一种或多种药学上或饮食上可接受的赋形剂、载体和稀释剂组合，所述赋形剂、载体和稀释剂包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、黄糊精、白糊精、氧相二氧化硅、微晶纤维素、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山梨糖醇、甜菊糖、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、L-抗坏血酸、dl-α-生育酚、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖、脂肪酯、脱水山梨糖醇脂肪酯、丙二醇脂肪酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、维生素B群、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、蛋白质、钙盐、色素、香精、防腐剂、蒸馏水、盐水、葡萄糖水溶液、酒精、丙二醇和聚乙二醇、各种动植物油、白色软石蜡、石蜡、食用香料、着色剂和蜡。
第四方面，本发明提供了第三方面所述咖啡果实提取物在制备调节和改善神经营养功能相关的大脑生理活动的膳食补充功能食品中的应用。
本发明第三方面所述的功能食品或第四方面所述的应用中，所述调节和改善神经营养功能相关的大脑生理活动包括神经元保护、神经营养、支持改善感知和认知功能、改善记忆、调节情绪、提高警觉性、改善注意力和大脑的任务执行能力，老年痴呆症和阿尔茨海默症、多动症、儿童孤独症、控制体重和控制能量代谢等多种生理活动。问题
第五方面，本发明提供了本发明第二方面所述咖啡果实提取物的抗氧化能力的测定方法，其中，所述测定方法包括直接测量法和间接测量法，所述直接测量法是基于自由基损失的生物标志物，所述直接侧脸发包括电化学法和电子自旋共振(ESR)；所述间接测量法包括抗氧化活性测量法、荧光法。
将此提取物以两个50mg胶囊形式给每个对象施用以提供900mg/天咖啡果实提取物(商购自)。在第0天施用前及在施用后2小时和4小时(急性评估)以及实验最后一天即第30天施用前和施用后2小时和 4小时(慢性评估)评估对象。回答主观整体改善问卷，对象报告在30天后主观改善。对于三个可能的组·任一组的分析，在30天期间平均个体或复合胃肠耐受性评分无显著差异。
使用多种认可的记忆、推理、注意/专注和计划的测试评估对象。基于急性评估，对象组，调整意向治疗和符合方案的(both modified intent to treat and per protocol)二者均示出在推理、注意和计划方面显著改善(p<0.1)，基于慢性评估，调整意向治疗和符合方案的二者均示出记忆、推理、专注和计划的显著改善(p<0.1)。目前的结果表明咖啡果实提取物在人体中对于记忆、推理、注意/专注和计划具有有益作用，无副作用。
有益效果：
1.经食用和食用试验疗效证明，本发明的具有神经营养功能的植物提取物可通过内源性促进体内BDNF 的血液水平的升高把BDNF水平显著提高，平均提高143％，，具有保护神经元，营养神经、支持改善感知和认知功能、改善记忆、提高学习效率，调节情绪、提高警觉性、改善注意力和大脑的任务执行能力。本发明的具有神经营养功能的植物提取物示出在自我报告记忆缺损(急性或慢性)的人中改善记忆、推理、注意/专注和计划行为。
2.本发明植物提取物应用广泛，可制成注射液、胶囊剂、浓缩丸、颗粒剂、片剂、散剂、口服液等药物制剂。本发明的技术方案具有良好的市场前景，有望产生巨大的商业空间。
附图说明
图1.实施例1的咖啡果实提取物中的包含组分的液相色谱测定结果
图2.实施例1的咖啡果实提取物中的主要绿原酸组分化学构象图。
图3.整体咖啡果提取物含40％(CGA)的ORAC-MR(ORAC 6.0)分析图。
图4.咖啡果实及其提取物的ORAC 6.0分析
图5.DHR 6G作为探针测量总自由基的反应式
图6.安慰剂和WCFC治疗后的血浆中BDNF含量的比较
图7.安慰剂和WCFC治疗后的外来体中BDNF含量比较
图8.安慰剂组和单剂量(100mg)CBE治疗组给药后血清自由基浓度的变化
图9.标准早餐对人类志愿者ROS生成/代谢活动的影响(n＝6)
图10.标准早餐对人类志愿者ROS生成/代谢活动的累积影响(n＝6)
图11.CBE对人类志愿者ROS生成/代谢活动的影响(n＝6)
图12.CBE对人类志愿者细胞外H2O2形成的影响(n＝6)
图13.CBE对人类志愿者细胞外O2形成的影响(n＝6)
图14.在健康受试者中，咖啡果提取物在细胞质水平上对脑源神经营养因子(BDNF)的调节作用
图15.服用Neurofactor后60和120分钟时BDNF的血液水平
(T0值＝100％。结果显示为高于或低于T0的值)
图16.小鼠食用NeuroFactor后默认模式网络活性平均增加了12.9％的脑功能成像图
图17.小鼠食用NeuroFactor后任务正面网络(TPN)活性平均增加了4.7％的脑功能成像图。
具体实施方式
定义
如在本申请中所用，如下术语具有所示含义：
认知健康：认知健康是指总体脑、组织和血液供应的健康以及其在各种条件下适当发挥功能的能力。良好的认知健康对于脑以最佳表现进行所有意识过程是至关重要的；这些过程统称为认知，包括但不限于学习、直觉、判断、语言、注意、警觉、集中注意(focus)和记忆(长期和短期记忆)。由于衰老、疾病和 /或其它认知损害导致的不良认知健康降低脑适当发挥功能的能力，导致认知功能和性能显著衰退。
认知功能：包含的神经学或符号运算的任何精神或智力过程，包括但不限于沟通、知觉、理解、推理、记忆、思考、意识、集中注意、注意、警觉、动机、下结论、执行功能、产生意象及判断能力。在动物模型系统中，认知功能可以本领域已知的各种常规方式测量，包括使用Morris水迷宫(MWM)、Barnes环形迷宫、高架放射臂迷宫、T-迷宫或者任何动物使用空间信息的其它迷宫。本领域已知的其它检测也可用于评定认知功能，如新物体识别和气味识别任务。
执行功能：调节、控制和处理其它认知过程的认知过程，如计划、工作记忆、注意、问题解决、语言推理、数学能力、抑制、心理灵活性、任务转换、起始、灵活性、视觉注意、算术技能、对新的及改变的环境的适应性以及行为监视。
学习：获得知识或技能的行为、过程或经验，特别是通过经验或条件的心理或行为修正。
记忆：得自贮存在个人意识中的过去的学习或经验的信息集合。一个信息片段，如经验的意识图像，贮存在记忆中。记住过去的经验或学习的信息的能力，包括高级的意识过程如学习、保留、回忆和识别以及得自在一些不同的脑部区域包括海马中神经元之间的化学改变。包括：(1)陈述学习或记忆，这是指可以自觉地回忆如事实或知识，(2)工作记忆，这是指主动操纵可操纵的意识中的多个瞬时信息片段，(3) 参考记忆，这是指得自先前的(最近或遥远的)经验的信息，(4)识别记忆，这是识别先前遇到的事件、物体或人的能力，及(5)
联想记忆，这是学习和记住不相关项目之间关系的能力。这些记忆均具有即时、短期和长期成分。即时记忆仅持续几秒钟。短期记忆贮存已经最低限度加工的信息，且只可持续几分钟，如记住电话号码只够使用其的时间长度。只有当重复使用该信息促进神经化学改变使其保留时，短期记忆被转移至长期记忆，其可持续多年。
实施例1.咖啡果实提取物的制备(高浓度，温度)
一.称取阿拉比卡咖啡树果实
Figure RE-GDA0002549715070000053
(购自亚马逊DAVIDOFF大卫杜夫咖啡)60g，于榨汁机搅碎成浆榨汁，然后进行渣滓分离，过滤后得到果浆。
二.向步骤一得到的果浆中加入600g体积分数为90％的乙醇,于回流提取仪器索氏提取器中45℃回流提取40小时；
三.、对步骤二得到的回流提取产物减压蒸馏进行乙醇溶剂回收，然后于0.1MPa、55℃下真空旋转仪 (C-2L-MRE旋转蒸发器(2L手动))蒸发12min,得到粗提液；
四.将步骤三得到的粗提液置于55℃下进行冷冻干燥30h，得到咖啡果实的干燥粗提物，所述咖啡果实的干燥粗提物的含水量为5％重量百分比，将所得干燥提取物过筛300目筛，得到咖啡果实提取物终产物。
实施例2.咖啡果实提取物的制备方法(低浓度，低温度)
一.称取阿拉比卡咖啡树果实
Figure RE-GDA0002549715070000054
(购自亚马逊DAVIDOFF大卫杜夫咖啡)60g，于榨汁机搅碎成浆榨汁，然后进行渣滓分离，过滤后得到果浆。
二.向步骤一得到的果浆中加入300g体积分数为60％的乙醇,于回流提取仪索氏提取器中55℃回流提取45min；
三.对步骤二得到的回流提取产物减压蒸馏进行乙醇溶剂回收，然后于0.085MPa、45℃下真空旋转蒸发6min,得到粗提液；
四.将步骤三得到的粗提液置于45℃下进行冷冻干燥45h，得到咖啡果实的干燥粗提物，所述咖啡果实的干燥粗提物的含水量为2.5％重量百分比，将所得干燥提取物过筛150目筛，得到咖啡果实提取物终产物。
实施例3.咖啡果实提取物的制备方法(中浓度，中等温度)
一.称取阿拉比卡咖啡树果实
Figure RE-GDA0002549715070000063
(购自亚马逊DAVIDOFF大卫杜夫咖啡)60g，于榨汁机搅碎成浆榨汁，然后进行渣滓分离，过滤后得到果浆。
二.向步骤一得到的果浆中加入400g体积分数为70％的乙醇,于回流提取仪器索氏提取器中50℃回流提取1小时；
三.、对步骤二得到的回流提取产物减压蒸馏进行乙醇溶剂回收，然后于0.095MPa、53℃下真空旋转蒸发8min,得到粗提液；
四.将步骤三得到的粗提液置于50℃下进行冷冻干燥35h，得到咖啡果实的干燥粗提物，所述咖啡果实的干燥粗提物的含水量为3.5％重量百分比。将所得干燥提取物过筛240目筛，得到咖啡果实提取物终产物。
实施例4.含咖啡树果食提取物的增强记忆的功能饼干的制备方法
本实施例的含咖啡树果食提取物的增强记忆的功能的制备方法，包括以下步骤：
1)、配料：
以面粉100g、白砂糖10g、碳酸氢胺0.15g、碳酸氢钠0.5g份、全脂奶粉3g、鸡蛋3g、黄油10g、水 15g、1g实施例3的咖啡树果实提取物0.1g、核桃2g、花生4-8g和山药1-2g作为原料。
2)、调粉：
先将咖啡树果实提取物加入水中溶解，然后再加入黄油和白砂糖混合，最后加入奶粉、鸡蛋、面粉、碳酸氢胺和碳酸氢钠进行均匀混合；即，于20～30℃调粉10分钟，得面团。
3)、静置成型(常规技术)：
将步骤2)所得的面团压制成厚度为3mm；静置20min成型，得厚度为3mm的面坯。
4)、烘烤：
将面坯置于170℃中烘培15分钟；得增强记忆功能饼干。
5)、冷却、包装：
将增强记忆功能饼干于室温下自然冷却，当增强记忆功能饼干冷却至≤45℃，进行真空充气包装。
实施例5.含咖啡树果实提取物的固体功能饮料的制备方法
取实施例3所得的咖啡树果实提取物干粉1份，核桃2-4重量份，花生4-8重量份，茯苓1-2重量份，枸杞1-2重量份，山药1-2重量份，五味子1-2重量份，加入白砂糖30份、柠檬酸1.0份，再加入糊精至总量为1000份，混匀；制成颗粒，干燥。
实施例6.含咖啡树果实提取物的液体功能饮料的制备方法
取实施例3所得的咖啡树果实提取物干粉1份，核桃2-4重量份，花生4-8重量份，茯苓1-2重量份，枸杞1-2重量份，山药1-2重量份，五味子1-2重量份，加入白砂糖30份、柠檬酸1.0份，混匀再加水至总量为1000份，搅拌，静置；过滤，灌封，灭菌,装瓶。
实施例6.实施例1的咖啡果实提取物的测定结果
Figure RE-GDA0002549715070000064
中检出的主要绿原酸混合物如附图1所示，包括组分如下：
1.3-O-咖啡酰奎宁酸(-3-O-CQA)；
2.4-O-咖啡酰奎宁酸(4-O-CQA)；
3.5-O-咖啡酰奎宁酸(5-O-CQA)；
4.3-O-阿魏酰奎宁酸(-3-O-FQA)；
5.5-O-阿魏酰奎宁酸(5-O-FQA)；5.5-O-p-CoQA；
6.4-O-阿魏酰奎宁酸(4-O-FQA)；
7.3-O-咖啡酰奎宁酸内酯(3-O-CQA lactone)；
8.4-O-咖啡酰奎宁酸内酯(4-O-CQA lactone)；
9.3-O-阿魏酰奎宁酸(5-O-FQA)；10未知；
11.3,4-O-二咖啡酰奎宁酸(3,4-O-DiCQA)；
12.3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(3,5-O-DiCQA)；
13.4,5-O-二咖啡酰奎宁酸(4,5-O-DiCQA)；
14.3-O-F-4-O-CQA；
15.4-O-p-Coumaroylquinic acid(4-O-p-香豆酰基奎尼酸)
16.5-O-p-Coumaroylquinic acid(5-O-p-香豆酰基奎尼酸)
Figure RE-GDA0002549715070000074
中检出的主要绿原酸混合物中的组分立体结构式如附图2所示。
Figure RE-GDA0002549715070000073
品牌咖啡果实提取物的抗氧化剂和与绿咖啡豆提取物中绿原酸含量检测结果见表1
表1
Figure RE-GDA0002549715070000075
品牌咖啡果实提取物的抗氧化剂和与绿咖啡豆提取物中绿原酸含量检测结果
Figure RE-GDA0002549715070000071
Figure RE-GDA0002549715070000081
表2.咖啡果实提取物和咖啡豆中酚类物质含量的比较
Figure RE-GDA0002549715070000082
含40％(CGA)的整体咖啡果提取物的ORAC-MR(ORAC 6.0)分析图见附图3。
咖啡果实及其提取物的ORAC 6.0分析见附图4，其中
1.Arabica咖啡果实(巴西)；2..Arabica咖啡果实(Costa Rica)；
2.Arabica咖啡果实(墨西哥)；4.Kona咖啡果实Husk(Hawaii)；
5.Kona咖啡果实(Hawaii)；6.Arabica咖啡果实(印度)；
7.Robusta咖啡果实(印度)；8.Arabica咖啡果实(中国)；
9.Robusta咖啡果实(中国)；10.咖啡果实提取物85％；
11.咖啡果实提取物40％.
由表1和表2可见，咖啡果食提取物中，5-咖啡酰奎宁酸(CQA)、咖啡因和3，5-阿魏酰奎宁酸、4- 咖啡酰奎宁酸和5-阿魏酰奎宁酸，所述绿原酸化合物具有抗氧化能力，所述植物酚类化合物包括槲皮素 -3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、原花青素二聚体、儿茶素、槲皮素-O-芸香糖苷、表儿茶素和原花青素A型三聚体的含量显著高于咖啡豆。咖啡果的抗氧化能力检测检测结果见表3
由表3可知，HORAC和ORAC在咖啡果提取物40％、咖啡果提取物85％中含量相当高，在罗布斯塔咖啡水果(印度)、科纳咖啡水果(夏威夷)、阿拉比卡咖啡果(巴西)中也有较高含量，
表3咖啡果的抗氧化能力检测检测结果
Figure RE-GDA0002549715070000091
Figure RE-GDA0002549715070000101
检测表明，HORAC和ORAC是咖啡果提取物的主要组分。
实施例7.咖啡果提取物的自由基测量(荧光法)
用二氢罗丹明6G(DHR 6G)作为探针测定总自由基
试验包含如下步骤：
1.样品制备：
·使用720μL甲醇提取240μL血清样品。
·涡旋30秒，然后以10,000rpm离心5分钟。
·将上清液蒸发至干燥，并在60μL PBS中重构。
2.与DHR 6G反应
·将50μL样品溶液和50μL 100μM DHR-6G溶液在96孔读板中混合。
·荧光读数持续15小时，间隔15分钟(激发：485nm，发射545nm)。
·使用Rhodamin-6G作为参考标准，计算自由基的最终浓度
DHR 6G作为探针测量总自由基的反应的化学反应式如图5所示。
图5所示的化学反应明DHR 6G对活性氧(ROS)超敏感
两种ROS将DHR 6G氧化成荧光罗丹明6G
荧光强度的增加是ROS的指标
ROS数量可以通过形成的罗丹明6G的量来计算
该方法是非特定的，可以高通量运行。
食用试验试验例
试验例1.受试者中测得的BDNF的血液水平
在健康受试者中食用咖啡果提取物(WCFC),阳性对照组食用绿原酸，
食用方案：20g/50kg体重/次，1次/日，食用一个月。
阴性对照组用二氧化硅为安慰剂或不处理。
采集的数据结果如图6显示，实验条件下N31和N667将血浆BDNF水平提高了近31％，其中，采用WCFC (全咖啡果浓缩粉末)将该水平从极限水平提高了143％。该结果表面，WCFC可用于调节BDNF依赖的健康状况。
选取服用安慰剂的阴性对照组受试者和服用50mg的绿原酸或100mg的WCFC的食用受试者，从极限水平的志愿者和WCFC治疗60分钟和120分钟后血清中分离获得外来体检测血液BDNF中测得的BDNF的血液水平比较结果如图7所示。图7中数据提交表示与基线(T0)水平比较的平均百分比差异。和安慰剂比较，根据t检验，平均值与安慰剂服用的BDNF(％)具有显著差异(P<0.05)。
WCFC治疗后的外来体中BDNF的测试结果如图7所示
初步结果显示，治疗后BDNF水平升高显著。
试验例2.安慰剂组和单剂量(100mg)CBE治疗组给药后血清自由基浓度的变化
研究方案：
年龄在25-48岁之间的11名志愿者参加了这项研究，。这些参与者的BMI(体重指数)为20-28。志愿者在早上向实验室报告，禁食。签署同意书后，他们补充了单剂量的CBEN580。在补充之前和补充后1,2,3小时采集静脉血液(8ml)。(n＝11)
安慰剂组和单剂量(100mg)CoffeeCherry提取物(CBE)治疗组给药后血清自由基浓度的变化如图8 所示。
附图8显示，单剂量CoffeeCherry提取物(CBE)组给药后，随给药时间增加从60分钟到180分钟，血清自由基浓度下降。本试验例表明，单剂量CoffeeCherry提取物(CBE)可显著降低血清自由基。
试验例3.使用EPR光谱仪对CoffeeCherry提取物的食用试验研究
目的：膳食补充剂CoffeeCherry Extract(CBE)对人类参与者氧化应激标记物(OSM)的影响进行交叉，双盲，安慰剂对照的单剂量(100mg)研究(n＝6)。
设计：使用EPR光谱仪Oxyscan，旋转探针CMH测量OSM(全血中活性氧(ROS，O2-，H2O2，OH-)的前体和细胞外形成，血细胞呼吸活动，以及线粒体依赖性ROS形成和呼吸活动)。
该研究是双盲，单剂量，交叉，安慰剂对照。
研究设计方案为：
6名健康参与者(3名女性，3名男性)，平均年龄41岁(范围25-58)，平均体重76公斤
该研究是根据人类食用试验试验的建议，赫尔辛基宣言进行的。通过体格检查和实验室检查证实，所有受试者的身体状况良好
全部6个参与者在年龄和性别匹配的两组中分开，以达到最佳实践和/或可能的程度。
在第0天，在静止期12小时后取血，用于进行实验室测试和分析葡萄糖以及延长的活力测试。在第 0天以及第1天用安慰剂100mg胶囊和第2天用CBE 100mg胶囊服务标准化早餐(1杯用一杯水)。
在胶囊给药后的时间0以及1,2和3小时后，收集毛细血管血液以进行延长的活力测试。标准早餐对人类志愿者的ROS生成/代谢活动的影响(n＝6)试验测试结果如图9所示，标准早餐和安慰剂对人类志愿者的ROS生成/代谢活动的积累影响(n＝6)试验测试结果如图10所示
CBE对人类志愿者ROS生成/代谢活动的影响(n＝6)如图11所示
CBE对人类志愿者细胞外H2O2形成的影响(n＝6)如图12所示
使用EPR光谱仪E-Scan，旋转探针CMH(200μM)和过氧化氢酶(50U/ml)在人体中分析H2O2的形成。数据是平均值+/-SEM p<0.05vs.“之前”的值。CBE对人类志愿者细胞外O2形成的影响(n＝6) 如图13所示。
使用EPR光谱仪E-Scan，旋转探针CMH(200μM)和SOD(50U/ml)在人血液中分析O2形成。数据是平均值+/-SEM p<0.05vs.“之前”的值.
图9-图13表明，服用CBE后，ROS生成和代谢活动随时间降低比阴性对照明显。
试验例4.在健康受试者中，咖啡果提取物在细胞质水平上对脑源神经营养因子(BDNF)的调节作用
全咖啡果浓缩粉对健康受试者血浆总水平和外来体的BDNF水平的刺激作用：急性受试者内食用试验研究
实施单剂量，安慰剂对照的受试者体内研究以确认并进一步研究这种效应。
年龄在25至35岁之间的20名健康受试者参与了这项研究。所有禁食和休息的受试者在第1天接受安慰剂，在第2天接受WCFC，并在第3天接受一杯新煮的咖啡。在健康受试者中，咖啡果提取物在细胞质水平上对脑源神经营养因子(BDNF)的调节作用如图14所示。
与安慰剂(p＝0.0073)或酿造咖啡(p＝0.0219)相比，在最初的60分钟内，用WCFC治疗导致血浆BDNF的中度显着增加。此外，从血清中分离出外泌体，发现它们含有BDNF。此外，或者WCFC消耗急剧增加了血清外泌体中的BDNF水平。第二次，双盲，安慰剂对照，交叉研究(N＝20)。
治疗后60和120分钟时BDNF的血液水平如图15所示。如图15所示，证实研究#1结果显示摄入后 60分钟血液平均BDNF水平增加，超过91％v基线值。
(T0值＝100％。结果显示为高于或低于T0的值)
总之，所有呈现的结果证明，WCFC作为管理BDNF依赖性健康状况的工具的进步表明食用试验研究是合理的。
我们的新研究还表明，摄入NeuroFactor优先增加血清中的外泌体BDNF。
这表明NeuroFactoris刺激的BDNF穿过血脑屏障并且可以通过脑控制的食欲和饱腹感机制调节脑 TrkB-BDNF介导的功能，例如认知，神经变性条件和代谢。
只有NeuroFactor显示出显着增加BDNF，绿咖啡豆提取物不起作用。咖啡因不起作用.绿原酸不起作用。
试验例6.脑功能核磁成像研究
我们通过fMRI研究了实时观察到的NeuroFactoron大脑活动的影响
试验方法
·使用100mg NeuroFactor进行急性单剂量治疗
·测量脑血流量
-DMN(默认模式网络)——联合皮层系统
默认模式网络(Default Mode Network)，在神经科学中，默认模式网络(DMN)也是默认网络或默认状态网络，是已知具有彼此高度相关的活动并且与大脑中的其他网络不同的活动大脑区域的大规模脑网络。
默认网络的初衷在于研究大脑代谢水平的基准线(Baseline)，从而据此研究大脑在处理注意力的、目的性的、外源性的任务时候的代谢水平。但是PET研究发现，人类大脑在处理这些任务时候，一些区域的代谢水平会降低。因此Baseline并不存在一个全局的值，而是对不同的区域有不同的Baseline.这些区域代谢水平降低在不同的人和不同的注意力任务中体现了较好的一致性，反应出的是固定的模式，这个模式被称为默认网络
当一个人不关注外部世界，大脑处于清醒的休息状态时，例如在做白日梦和思维游移的时候，默认的模式网络是最常见的。但是，当人们在思考别人，思考自己，回忆过去，规划未来时，它也是活跃的。当一个人没有参与任务时，网络会“默认”激活。虽然DMN最初被注意到在某些目标导向任务中被停用，有时被称为任务负面网络，但它可以在其他目标导向型任务(例如社交工作记忆或自传任务)中起作用。已经显示DMN与注意网络等大脑中的其他网络呈负相关。
已知默认模式网络涉及许多看似不同的功能。
(1)这是自我的神经基础；
(2)思考别人；
(3)记住过去和思考未来
有证据表明，阿尔茨海默病和自闭症谱系障碍患者的DMN受到干扰。
主要脑区：
内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex:mPFC)
扣带回前部
后扣带回与楔前叶(posterior cingulate/precuneus:PCC)
两侧顶下小叶(angular gyrus)
-TPN(任务正激活网络)
人脑在处理注意力的、目的性的、外源性的任务时候，DMN的代谢水平会降低，与此同时，另一些区域的代谢水平会升高，这些区域被称为任务正激活网络TPN。
在进行任务时候，大脑中的TPN活跃，DMN受抑，在休息时候则DMN活跃，TPN受抑。也就是，这两个网络的代谢水平一般呈负相关关系。
大脑皮层每一个区域从来都不是单功能，或者说任务特定的。也就是，每个区域都会参与多种任务。大脑中的社交任务相关区域与DMN区域重合很大，而理性分析(数学的、机械的)的区域则跟TPN区域基本重合。
试验方法
采用MRI测量DMN和TPK内的活动
-TCD(经颅多普勒)测量血流量
·测量时间点
-T0和T90分钟
·受试者
-4个老年健康的个体受试者
默认模式网络(DMN)是衡量大脑互连性的指标。
·DMN的特定组件是
-记忆检索和计划(以及许多其他功能)的必要条件，
-痴呆症和/或抑郁症的正面影响
据报道，DMN的损伤发生在症状前的个体中，因此可能代表旨在促进食用试验前或症状前个体的大脑健康的干预目标。DMN在情绪自我意识，社会认知和道德决策中发挥着核心作用。它还与创造力和洞察力的问题解决密切相关。
任务正面网络(TPN)是当大脑执行涉及注意力，记忆和计划的任务时被激活的解剖路径。TPN在患有抑郁症和/或抑郁症的人中受损，并且其损伤是患有抑郁症和/或痴呆症风险的人中最早的特征之一。因此，针对TPN可以提供用于设计补充/干预的机制，所述补充/干预旨在促进食用试验前或症状前个体的大脑健康。TPN在广泛的非社会任务中被激活，被认为对解决问题，关注焦点，做出决策和控制行动很重要，换句话说就是完成任务。
NeuroFactor将默认模式网络活性测定结果如图16所示，平均增加了12.9％。NeuroFactor将任务正面网络(TPN)活性如图17所示。图17所示结果表明NeuroFactor将任务正面网络(TPN)活性平均增加 4.7％。
本试验例这意味着NeuroFactor在一种独立于血流的机制中增加这两种网络的活性。因此， NeuroFactor的作用必须通过神经递质摄取或神经递质释放来介导。这些观察到的DMN和TPN的增加与“局部作用因子如BDNF”的作用非常一致。
试验例7.认知功能和情绪调节效果测试
记忆分为两种主要类别，陈述性记忆(或外显记忆)和程序性记忆(或內隐记忆)。陈述性记忆进一步分为语义记忆(事实或含义)和情景记忆(特定经历)。语义记忆通常得自情景记忆。陈述性记忆被认为是由海马编码的，而程序性记忆被认为是由纹状体内的尾状核结构编码的。程序性记忆或內隐记忆来自学习应答与奖励之间的关联。程序性记忆通常以陈述性记忆开始直至其成为根深蒂固或习惯。
早餐前和晚餐前分别服用100mg剂量的实施例1的产物,食用三个月。
测定项目
·1.霍普金斯语言学习测试-修订版(HVLT-R)：评估口头记忆。
服用本发明实施例1制备所得的前后HVLT-R量表评分提高,有显著性差异(P0.05)
·2.持续性能测试(CPT)：评估注意力和抑制力。
·3.Spatial Sternberg：评估空间短期记忆。
·4.字母编号排序：评估工作记忆。
·5.注意力网络任务：评估注意力和抑制力。
·6.言语流利：评估执行功能。
·7.手指敲击：评估精神运动速度。
咖啡果实提取物改善了记忆。
材料和方法
对象
在治疗开始时，实验对象是11个自我报告记忆缺损的50-70岁男性和女性。合格的参与者是73％女性和27％男性，平均年龄和体重指数(BMI)分别为58.7岁和27.4kg/m2。在进行这些研究。
研究设计
非盲研究包括一项电话筛选；一项筛选访问(访问1a/b；第-7天)；一项基线访问(访问2；第0天)；及一项测试访问(访问3；第30天)。所有食用试验访问均具有±3天窗口期。在电话筛选，给予纸质记忆障碍调查问卷(MAC-Q；Crook 1992)以评估自我报告记忆缺损。合格的对象(MAC-Q评分≥25；Dunbar 2007) 进入测试(访问1a，第-7天)，空腹(在开始抽血前10-14小时，仅饮水)，提供知情同意书并给予纸质简易精神状态量表(MMSE；参照Folstein 1975,Mitrushina 1991)。合格对象(MMSE评分≥24；Dunbar 2007) 继续进行访问1b(第-7天)，经历其余的筛选访问程序，包括评估用药史、纳入和排除标准、之前和现有的药物/补剂使用情况、身高、体重及生命体征。如果对象正常服用降压药，该药物应在抽血之前在测试地点服用。在施用降压药之后至少30分钟评估生命体征。在早晨收集空腹(10-14小时，仅饮水)血样，进行化学、血液学和脂质分析，样品备份以进行可能的进一步非遗传性代谢指征分析。小于60岁的女性对象在食用试验进行尿妊娠检测。对象进行至少两次计算机认知测试组合，每次～1小时，间隔≥1小时，以进行训练。允许最多四次测试组合，以在基线访问(访问2，第0天)时在第一次计算机认知测试之前保证对象熟悉测试程序及保证最佳性能水平。提供书面研究说明[在每次测试访问之前和期间(访问2和3；第0和 30天)遵守禁食(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)，避免摄取酒精饮料(24小时)，避免咖啡因摄取(10-14小时)和使用烟草(1小时)，及维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体活动模式、睡眠时间以及服用睡眠辅助药物/补剂]。此外，如果对象正常服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象保持在每次测试访问(访问2和3；第0和30天)之前的晚上一致服用睡眠辅助药物/补剂。在离开测试地点之前要求对象按期进行访问2(第0天)。
11个合格对象登记为50-100mg咖啡果提取物组，随后给予纸质胃肠道(GI)耐受性问卷()及第一次计算机认知测试t＝-1.0小时±5分钟，其中t＝0小时是研究产品摄取时间。在t＝0小时，给对象施用所述研究产品，随后立即给予标准早餐食物。对象在15分钟内摄入全部食物。在访问3(第30天)重复这个标准早餐食物/量(即提供在第0天访问2的早餐的精确食物/量)。在完成标准早餐食物之后，为对象提供标准量的水。在整个测试访问期间允许对象任意饮水，除了正在进行计算机认知测试时。记录实际的水摄入量。
在t＝2.25和4.0小时±5分钟，其中t＝0小时是摄入研究产品时间，给予计算机认知测试(参照 Owen 2010)。在t＝4小时±5分钟认知功能测试后，评估AE，及提供书面研究说明书[在随后的访问之前和期间(访问3；第30天)遵守禁食(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)，避免摄取酒精饮料(24小时)，避免咖啡因摄取(10-14小时)和使用烟草(1小时)，及维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体活动模式、睡眠时间以及服用睡眠辅助药物/补剂]。如果对象夜间平均睡眠时间有高于±2 小时的偏差，测试访问改期。此外，如果对象在访问2(第0天)之前服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象在访问3(第30天)前夜间保持一致服用。
为对象分发具有说明书的研究产品瓶(从其中给予早晨服用剂量)，在早餐时服用两粒胶囊/天直至下一次访问(访问3，第30天)。也指导对象在每日研究日记中记录研究产品摄入和睡眠时间，并提供一药丸盒以帮助每天遵守执行。此外，提醒对象在整个实验期间每周通过电话联系以保证遵守研究产品、研究说明书，及评估每日行为习惯的任何AE和/或改变(即药物/补剂、饮食、睡眠，和/或锻炼)。如果在随后测试访问的3天内错过服用研究产品剂量，则改期进行测试访问。
在访问3(第30±3天)，对象在06:00-09:30时间到达测试地点。在t＝-1.25小时±5分钟收集空腹(10-14小时，仅饮水)血样，以进行化学、血液学和脂质分析。如果对象在早晨正常服用药物，该药物在生命体征测量之前30分钟在测试地点服用。进行食用试验访问程序(即评估纳入和排除标准、相伴药物/ 补剂使用情况、体重和生命体征)，询问对象的研究说明书遵守情况及评估AE。收集研究产品和研究日记，并确定遵守情况。在t＝-1.0小时±5分钟给予纸质GI耐受性问卷、纸质对象整体改善问卷(SGI；参考 Dunbar 2011,Lieberman 2013)及计算机认知测试()，其中t＝0是研究产品摄入时间。在t＝0小时，给对象施用指定的研究产品，随后立即给予标准早餐食物(提供在访问2第0天的食物/量)。对象在15分钟内摄入全部食物，包括研究产品。在访问3(第30天)的研究产品和标准早餐食物是在访问2(第0天)确定的t＝0小时的±30分钟内给予。在t＝2.25和4.0小时±5分钟，其中t＝0小时是研究产品摄入时间，进行计算机认知测试。在完成标准早餐食物后为对象提供标准量的水。允许对象在整个测试访问期间随意饮水，除了正在进行计算机认知测试时。记录实际水摄入量。在t＝4.0小时±5分钟认知测试之后，评估AE。
研究样本
每个对象均需要符合在基线所有如下纳入标准及无一排除标准以参与这项研究。
纳入标准
1.对象是男性或女性，年龄为50-70岁，包括50和70岁；
2.对象符合基于MAC-Q(评分≥25；Crook 1992)自我报告记忆缺损的标准；
3.在访问1b(第-7天)时对象体重指数(BMI)为18.5-35.0kg/m2，包括端点；
4.对象具有至少高中毕业或同等学历；
5.在研究期间对象愿意保持习惯饮食(包括咖啡因和酒精)和身体活动模式，除了在每次测试(访问2和3，第0和30天)之前24小时；
6.对象无阻止其实现研究要求的健康问题，由研究人员基于病史和常规实验室检测结果判断；
7.在测试访问之前至少1小时及整个期间[访问2和3(第0和30天)直至7小时]对象愿意舒适地戒除烟草制品；
8.对象愿意在测试访问时(访问2和3；第0和30天)及在整个研究期间在家每天吃早餐；
9.对象在所有食用试验访问(访问1b、2和3；第-7、0和30天)之前(10-14小时)及整个期间愿意且能舒适地戒除咖啡因；
10.对象在所有食用试验访问(访问1b、2和3；第-7、0和30天)之前24小时愿意戒除摄入酒精及避免剧烈身体运动；
11.对象由研究人员基于病史判断处于一般良好健康状况；
12.对象理解研究程序并在提供的知情同意书上签字以参与研究，及授权研究人员发布相关受保护的健康信息。
排除标准
1.对象具有食用试验意义的异常实验室检查结果，包括但不限于在访问1b(第-7天)时肌酐≥1.5mg/dL 及ALT或AST≥1.5×正常高水平。食用试验相关实验室检测结果基于研究人员判断作为AE。劝告对象由其初级保健医生随访；
2.对象不能理解和/或完全进行实际测试；
3.对象在访问1b(第-7天；Folstein 1995；Mitrushina 1991,Dunbar 2007)的MMSE评分≤23；
4.对象经历精神错乱、思维混乱或者其它意识紊乱的迹象；
5.对象在访问1b(第-7天)之前2年具有经诊断的抑郁症；
6.对象具有可以产生认知退化的任何神经病学疾病，包括但不限于阿尔兹海默病、帕金森症、中风、颅内出血、局部脑损伤包括肿瘤，以及正常压力脑积水；
7.对象具有任何感染性或炎症性脑病病史，包括病毒、真菌或梅毒病原性脑病；
8.对象具有反复轻微脑损伤(例如在拳击中)或者单一损伤导致意识不清1小时或以上时间的病史；
9.对象在研究期间具有预约住院治疗计划(例如预约整容手术；
10.对象具有不可控的高血压(收缩压≥160mm Hg或者舒张压≥100mm Hg，根据在访问1b(第-7天)时测量的平均血压限定)。对于其血压超过在访问1b时的任一截止点的对象允许在访问2(第0天)之前单独一天进行重新检测，由研究人员判断进行；
研究产品
描述
每天100毫克实施例1获得的咖啡果提取物提取物。
食用试验测量
筛选记忆问卷
在电话筛选期间(访问1a第-7天的2周内)，给予对象纸质MAC-Q，设计6-点问题以评定自我报告记忆缺损(排除评分≤24的对象)。合格对象继续进行访问1a(第-7天)，提供知情同意书，随后给予纸质 MMSE(访问1a；第-7天)。
MMSE是简单的30-点问卷测试，用于筛选认知缺损。该问卷将筛选排除具有痴呆的个体(排除评分≤23；)。该问卷花费大约10分钟用算术、记忆和方向领域支配和测量认知功能。
研究说明/问询
在每次食用试验访问结束时提供书面研究说明[在每次食用试验访问(访问1a、2和3；第-7、0和30 天)之前及期间遵守空腹(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)、避免摄入酒精饮料(24 小时)、避免咖啡因摄入(10-14小时)和烟草使用(1小时)，维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体运动模式、睡眠时间和摄入睡眠辅助药物/补剂]为随后的食用试验访问做准备。如果夜间对象平均睡眠时间具有超过±2小时偏差(根据筛选访问报告)，改期进行测试访问。此外，如果对象在访问2(第0天) 前夜服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象在访问3(第30天)保持一致服用。在每周一次电话联系回顾该研究说明书。
认知测试熟悉
每期实践测试费时大约1小时，每个间隔≥1小时。实践测试是为训练目的，以使得每个对象熟悉测试程序。
认知测试
Cambridge Brain Sciences计算机测试是可公开获得的认知评估工具，由Medical Research Council and Brain Sciences Unit认证(Cambridge,UK；Owen 2010)。
认知测试包括在t＝-1.0、2.25和4.0小时±5分钟评定记忆(数字广度和成对关联)，推理(Double Trouble and Odd One Out)，注意/专注(旋转和多边形)及计划(空间搜索和空间滑块)，共三次认知测试组合，其中t＝0小时是研究产品摄入时间。每次测试给予和测试访问，对象在相同房间内检测。测试及测试访问期间的环境条件如灯光、供热和噪音尽可能保持一致。
研究产品/标准早餐给予
在测试当天(访问2和3；第0天和30天)，合格的对象空腹(10-14小时)在06:00-09:30时间到达测试地点。在食用试验访问程序和认知功能测试/问卷调查之后，在t＝0小时给予对象其指定的研究产品，随后立即给予标准早餐食物。对象在15分钟内摄入全部食物，包括研究产品。在访问3(第30天)的研究产品和标准早餐食物在访问2(第0天)确定的t＝0小时时间的±30分钟内给予，菜单是重复的(即访问3 的精确食物/量是第0天的早餐)。在标准早餐食物之后，为对象提供标准量的水。允许对象在整个测试访问期间随意饮水，除了当进行计算机认知测试时。记录实际水摄入量。
研究日记
对象完成每日的研究日记以记录睡眠时间和研究产品摄入(在访问2第0天直至研究结束)。
对象整体改善问卷
在访问3(第30天)在t＝-1.0小时±5分钟给予对象纸质SGI问卷(Dunbar 2011,Lieberman 2013)，其中t＝0小时是研究产品摄入时间。要求对象回答与记忆、注意和思考速度相关的整体改善的问题。
分发研究产品
为对象分发研究产品(从中给予早上剂量)与说明书，在30天治疗期每天与早餐一起服用两粒胶囊。在访问2(第0天)为对象分发每日研究日记。指示对象记录研究产品摄入情况。为每个对象提供药丸盒以帮助每日遵守方案。
电话联系
在实验期间每周一次与对象电话联系，以保证遵守研究产品、研究说明，及评定每日行为习惯中的任何AE和/或改变(即药物/补剂、饮食、睡眠和/或运动)。电话联系的文件记录在对象源文件和个案报告形式中(CRF)。
测试当天时间表
第0天(表4)
Figure RE-GDA0002549715070000171
第30天(表5)
Figure RE-GDA0002549715070000172
数据分析和统计学方法
结果分析
除非特别指出，所有测试的统计学意义均在α<0.1、双侧进行。
在所有时间点和所有变化(在检验当天和期间)的数值进行描述性统计。使用配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验，根据情况检验所述变化是否具有统计学意义。然而，这是先导性研究，应理解这个检验功效对于统计学检验是不足够的。目的是获得关于在研究终点的平均数/中位数和变异性的信息。
结果
总之，在这个实验中筛选20个参与者，11个对象符合纳入标准且无一符合排除标准。在研究中登记的11个对象中，一个对象在基线测试访问后由于不能理解认知功能测试而撤回同意书，从PP样本中除去。第二个对象由于134％摄入研究产品而从PP样本中除去。
一个不利事件-背痛-在治疗期间报告，编码为与研究产品摄入无关。
探索性结果分析中包含的MITT样本(N＝11)和对象子集(n＝5)的基线特征包括在表6中。
表6：总体和子集样本中对象的基线特征
Figure RE-GDA0002549715070000181
样本包含27％男性和73％女性，平均年龄和BMI分别为58.7±1.6岁和27.4±1.0kg/m2。对于MITT 和子集样本，研究产品摄入平均整体顺从性分别为103.2±1.6％和98.3±1.0％。在MITT样本中符合 MAC-Q和MMSE的平均得分分别为29.7±1.0％和28.9±0.4％。
在三个认知领域(记忆、注意和思考速度)评定从基线的变化的SGI问卷的平均得分在表7中示出。
表7：在治疗结束时应答实施例1获得的咖啡果提取物补剂的对象认知问卷整体印象量表得分
参数 平均数(SEM) P-值
记忆 3.8(0.2) 0.502
注意 3.6(0.2) 0.125
思考速度 3.5(0.3) 0.125
平均得分 3.6(0.3) 0.065
缩写：SEM，平均数标准误差。
在30天治疗结束时给予对象认知问卷整体印象量表(SGI)，要求对象对比其目前状况与纳入研究之前的状况。得分编码为：1＝非常多的改善，2＝较多改善，3＝最低程度改善，4＝无变化，5＝最低程度恶化，6＝较多恶化，7＝非常多的恶化。
2P-值从Wilcoxon符号秩检验中计算，检验在治疗结束时与4(无变化；n＝10)的差异。
在实施例1获得的咖啡果提取物提取物治疗30天后SGI问卷的平均合成分数略微改善(3.5±0.3，得分4表示“无变化”；P＝0.063)。在PP样本中平均合成分数中的差异不再显著(与得分4相比)(P＝ 0.125)。在SGI问卷中个体评级中无显著差异。
在基线与治疗测试访问结束期间给予的急性及急性-慢性(acute-on-chronic)给予后认知功能任务的平均分和中位数得分在表8中示出。
表8：在给予实施例1获得的咖啡果提取物测试后在基线的认知功能得分和在30天实施例1获得的咖啡果提取物补剂结束时的认知功能得分
Figure RE-GDA0002549715070000191
Figure RE-GDA0002549715070000201
缩写：EOT，治疗结束。
1P-值在给药前(t＝-1小时)与给药后2.25小时原始得分之间从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验计算。
2P-值在给药前(t＝-1小时)与给药后4小时原始得分之间从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验计算。
在基线测试访问时，注意/专注1任务的平均分在给药前与给药后时间点(2.25和4小时)分别增加 19.0±8.2点(P＝0.042)和29.1±6.6点(P＝0.001)。相似地，在基线测试访问时，注意/专注 2任务的平均分在给药前与给药后时间点(2.25和4小时)评定分别增加16.8±6.4点(P＝0.025) 和21.8±5.3点(P＝0.002)。在基线测试访问时，在给药后4小时时间点相对于给药前评定的计划2 任务的平均分也显著增高至11.7±3.2(P＝0.004)。在基线测试访问时，在PP样本中推理1任务的平均分在给药前和给药后评定(2.25和4小时)之间仅分别增加3.4±1.7点(P＝0.082)和4.9±2.0 点(P＝0.041)。这些认知功能的急性改善在急性-慢性给予测试之后不明显。然而，急性-慢性效果在给药后4小时评定推理1任务中是显著的，得分相对于给药前评定改善4.40±2.1点(P＝0.070)。这种差异在PP样本中不再显著(P＝0.115)。
对象认知功能的适度改善在补充30天后是明显的。这个实验的结果提示实施例1获得的咖啡果提取物提取物补剂可以改善认知功能，包括在慢性补充时改善推理、注意/专注及计划，及急性改善注意/专注和计划。

Claims (10)

1.一种具有神经营养功能的植物提取物的制备方法，其包括如下步骤：
（1）取咖啡果实，破碎进后行渣滓分离，过滤后得到果浆；
（2）高温下加入水溶性溶剂浸提，得到浸提液；
（3）浓缩；
（4）干燥；
（5）过筛;
其特征在于，
步骤（1）所述破碎包括机械破碎和超声波破碎，或所述破碎选自机械破碎和超声波破碎中的一种；
步骤（2）所述水溶性溶剂包括水和乙醇，所述浸提包括高温水浸泡煎煮和水溶性有机溶剂回流提取后减压蒸馏；其中，相对于1kg咖啡果实，所述水溶性有机溶剂的用量为5-12L；
所述高温浸泡煎煮的温度为40℃~60℃，所述高温浸泡煎煮的时间为1-2小时；
步骤（3）所述浓缩为0.085～0.1MPa、45℃～55℃下真空旋转蒸发浓缩6～12min，得到咖啡果实粗提液；
步骤（4）所述干燥为-45℃～-55℃下进行冷冻干燥16—48h，得到咖啡果实的干燥粗提物，所述咖啡果实的干燥粗提物的含水量为2~5%重量百分比；
步骤（5）所述过筛为将步骤（4）所得咖啡果实干燥粗提物过150-300目筛，得到改善记忆力的植物提取物终产物细粉。
2.根据权利要求1所述的具有神经营养功能的植物提取物的制备方法，其特征在于，步骤一所述的咖啡果实为鲜果或冷冻贮藏的果实，其中所述冷冻贮藏的果实需在室温下放置40min～90min后再进行破碎。
3.根据权利要求1所述的具有神经营养功能的植物提取物的制备方法，其特征在于，所述水溶性有机溶剂为水或50%-90%的乙醇，所述回流提取的温度为50-65℃，所述减压蒸馏回收乙醇的压力为0.05-1MPA,所述减压蒸馏回收乙醇的温度为55-65℃。
4.权利要求1任一项所述的制备方法得到的咖啡果实提取物。
5.根据权利要求4所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述咖啡果实提取
物富含抗氧化组分绿原酸类化合物和植物酚类化合物。
6.根据权利要求5所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述绿原酸类化合物包括5-咖啡酰奎宁酸(CQA)、咖啡因和3，5-阿魏酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸和5-阿魏酰奎宁酸，所述绿原酸类化合物具有抗氧化能力，所述植物酚类化合物包括槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、原花青素二聚体、儿茶素、槲皮素-O-芸香糖苷、表儿茶素和原花青素A型三聚体。
7.根据权利要求5所述的咖啡果实提取物，其特征在于，所述绿原酸类化合物优选5-咖啡酰奎宁酸，咖啡因，所述植物酚类化合物优选槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。
8.一种包含权利要求4-7任一项所述咖啡果实提取物的调节和改善神经营养功能相关的大脑生理活动的膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品，其特征在于，所述膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品包含权利要求5-7任一项所述的咖啡果实提取物2-4重量份，所述膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品还包括核桃2-4重量份，花生4-8重量份，茯苓1-2重量份，枸杞1-2重量份，山药1-2重量份，五味子1-2重量份，淀粉8-10重量份中的一种或多种，所述膳食补充剂的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、口服液，所述用于特定健康用途的功能食品包括固体食品、半固体食品和凝胶、饮料、滴剂、糖果、口香糖、橡皮糖、酸奶、冰淇淋、布丁、软小豆胶、果冻、饼干、茶、软饮料、果汁、牛奶、咖啡、谷类，所述固体食物包括巧克力和营养棒，所述半固体食物包括奶油和果酱，所述饮料包括清凉饮料、乳酸菌饮料；所述膳食补充剂或用于特定健康用途的功能食品还包括一种或多种药学上或饮食上可接受的赋形剂、载体和稀释剂组合，所述赋形剂、载体和稀释剂包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、黄糊精、白糊精、氧相二氧化硅、微晶纤维素、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山梨糖醇、甜菊糖、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、L-抗坏血酸、dl-α-生育酚、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖、脂肪酯、脱水山梨糖醇脂肪酯、丙二醇脂肪酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、维生素B群、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、蛋白质、钙盐、色素、香精、防腐剂、蒸馏水、盐水、葡萄糖水溶液、酒精、丙二醇和聚乙二醇、各种动植物油、白色软石蜡、石蜡、食用香料、着色剂和蜡。
9.权利要求4-7任一项所述咖啡果实提取物再制备调节和改善神经营养功能相关的大脑生理活动的膳食补充功能食品中的应用。
10.权利要求4-7任一项所述咖啡果实提取物的抗氧化能力的测定方法，50-65℃其所述测定方法包括直接测量法和间接测量法，所述直接测量法是基于自由基损失的生物标志物，所属直接侧脸发包括电化学法和电子自旋共振（ESR）；所述间接测量法包括抗氧化活性测量法、荧光法。
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