CN105960171A - 绿咖啡豆提取物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的来自绿咖啡豆的提取物，其含有浓度(70‑80％)显著高于现有技术方法的提取物的浓度(40‑50％)的多酚和生物活性化合物如绿原酸。所述提取物具有更强的猝灭氧化应激和破坏自由基的能力，并且由于其抗肥胖、抗糖尿病、抗高血压、抗肿瘤以及抗酸特性而提供健康益处。通过使用极性低于用于提取的醇，即甲醇或乙醇的极性溶剂获得更高浓度的生物活性化合物。使用这样的更低极性的溶剂如正丁醇、乙酸乙酯或丙酮导致提取出提取物中富集绿原酸部分的提取物，留下在水介质中的极性杂质。获得的提取物具有显著更高的多酚含量和含量为70‑80％的绿原酸，并且具有如图2所示的区别性的HPLC分布。

Description

绿咖啡豆提取物及其方法

技术领域

本发明涉及植物化学领域。更具体地说，其涉及具有有益的健康效果的天然产物提取物，即绿咖啡豆提取物及其方法。所述提取物具有比迄今为止任何市场上获得的提取物中公开的显著更高含量的生物活性化合物，即绿原酸，并且可应用于食品和饮料、药品、化妆品等的成分。本发明还公开了其生产方法，尽管该方法同样适用于任何富含绿原酸(包括烘焙咖啡豆)的天然来源，但该方法使用绿咖啡豆作为来源。

背景技术

咖啡传统上主要由于其味道和香气以及咖啡因的刺激作用而被消费。两种主要的商业栽培物种是中粒咖啡(Coffea canephora)(主要为被称为“罗布斯塔(robusta)”的形式)和阿拉比卡咖啡(Coffea arabica)。

咖啡和其健康益处

众所周知，咖啡是好几百种化合物的复杂混合物，其中有数种是酚类化合物，这些酚类化合物组合形成许多消费者希望的独特的和令人愉悦的香气和味道(WO 2006108578 A1)。此外，咖啡不仅由于其希望的香味，而且还往往由于其他原因，如增强短期精神警觉性而被消费。对咖啡的积极的健康影响已经研究了几十年，并且长时间以来已经熟知这些咖啡化合物中的某些能够通过咖啡因的摄取给消费者提供益处，特别是更强的精神警觉性。然而，消费者少有知道，某些咖啡化合物是优异的抗氧化剂，并且在相同重量的情况下，咖啡可能潜在地向消费者提供比例如熟知的抗氧化剂来源如绿茶显著更多的抗氧化剂。

由植物化学物质衍生的咖啡豆的潜在健康益处包括预防数种慢性疾病和退行性疾病，例如癌症、心血管障碍、糖尿病和帕金森病以及还控制肥胖症。无论何种提取剂，可以不止一次提取咖啡豆以增强过程并获得更大的酚类化合物产量。

不但绿咖啡豆是有益的酚类化合物的来源，而且与以绿茶提取物形式所获得的相比，每单位重量绿咖啡豆产生更多的单位重量的有益酚类化合物，并且具有更有益的成分。

酚类化合物是一组大并且多样化的分子，其包括在植物中的许多不同家族的芳香族次级代谢产物。已知从绿咖啡豆衍生的酚类化合物是抗氧化剂和抗肿瘤剂。酚酸，即绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和丁子香酚已经显示在动物模型中发挥癌症预防活性。

尽管酚类化合物存在于咖啡豆中，以及它们的已知的有益特性，但酚类化合物通常以提取物从绿茶获得。这似乎是因为咖啡豆烘焙过程减少了咖啡豆中40％至80％的酚含量，并且迄今没有人考虑从绿咖啡豆获得酚类化合物。本发明人的分析表明最初含有4％酚酸的绿咖啡豆分别包含，浅烘焙时含2％酚酸，中度烘焙时含1％酚酸，以及深烘焙时含小于0.5％酚酸。这清楚地表示经过烘焙过程有益化合物显著损失。

因此，由于具有显著更高含量(70-80％)的决定治疗益处的生物活性化合物，即绿原酸，因此提供本发明的绿色咖啡豆提取物形式的、具有强大的抗氧化、抗肿瘤和抗肥胖特性的新的治疗制剂对人类有巨大的益处。提供这样的改进的制剂和/或新的和更丰富的获得和产生商业水平的这样的制剂的方法，包括从富含绿原酸的其他来源(包括烘焙咖啡豆)也将是有益处的。

咖啡豆中的绿原酸含量

US 2002/0160067 A1公开了绿阿拉比卡豆的总绿原酸(不同类型绿原酸存在于提取物种并且它们的组合浓度被称为总绿原酸含量)的含量典型地是6.9％，以及在罗布斯塔变种中其典型地是10％。存在许多不同的绿原酸——5-咖啡酰奎宁酸以最大量存在。二咖啡酰奎宁酸和阿魏酰奎宁酸还与单咖啡酰奎宁酸的3-异构体和4-异构体共同存在。绿咖啡豆典型地在阿拉比卡种中含有1.3％二萜，而在绿罗布斯塔种中含有0.2％二萜。所述二萜是咖啡醇和咖啡豆醇。多种甾醇和生育酚也存在于绿咖啡豆的脂质部分。在绿咖啡豆外表面上的蜡状物中的烷酰基化的5-羟色胺(日本化合物)以500-1000mg/kg(或0.5-1％)存在。葫芦巴碱在阿拉比卡种中以1.1％存在，而在罗布斯塔种中以0.65％存在。葫芦巴碱少数转化为烟酸。除了绿原酸，以显著量存在的主要的酸是奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸，丙酮酸，琥珀酸和乙醇酸。

咖啡中绿原酸的重要性

绿原酸是咖啡中的主要酚酸，以及是非常重要的抗氧化剂。咖啡中的绿原酸主要是结合在不同位置的奎宁酸和酚基(例如咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、甲氧基肉桂酸)的单酯和二酯。它们具有如下的重要健康益处：

i.抗氧化活性-已经表明绿原酸在体外具有抗氧化活性(例如清除自由基、抗LDL氧化、保护DNA损伤)

ii.抗诱变作用-已经表明这些酸在体内对大鼠和仓鼠的大肠、肝脏和舌的显著的抗诱变作用。

iii.抗酸：绿原酸也能够减少胃中的系统性的酸分泌以保护胃黏膜免受可能造成烧心的刺激。

iv.抗肥胖：科学研究已经表明，富含绿原酸的速溶咖啡似乎对从饮食中吸收和利用葡萄糖具有显著效果。如果长时间使用咖啡，这种效果当与使用标准速溶咖啡相比时，可以导致体重和体脂的降低(J Int MedRes.2007Nov-Dec；35(6):900-8)。多种研究表明，绿原酸减慢从食物中摄取的脂肪的吸收，也激活多余脂肪的代谢。一项对富含绿原酸的绿色咖啡豆提取物的抗肥胖作用的研究在2012年1月发表于糖尿病、代谢综合征和肥胖症杂志。研究者用12周时间跟踪一组用不同剂量(每天700或1050mg)的特别的含绿原酸的绿咖啡豆提取物补充饮食的16名成人。如通过BMI大于25(正常BMI为18.5至25)所证实的，所有16名成人被认为超重。受试者平均减少几乎18磅-这是它们全部体重的10％以及是它们全部体脂的4.4％。

v.抗高血压：降低高血压病并帮助保持血压在正常范围内(Zhao,Y.；Wang,J.；Ballevre,O.；Luo,H.；Zhang,W.(2011)."绿原酸的抗高血压作用和代谢(Antihypertensive effects and mechanisms of chlorogenic acids)."Hypertens Res.35(4):370-4.doi:10.1038.1/hr.2011.195.PMID 22072103)。

vi.抗糖尿病：帮助保持血糖在正常范围内。绿原酸特别显示了抑制促进肝脏中葡萄糖(糖)形成的酶(葡萄糖-6-磷酸酶)。因此，通过长期消耗咖啡，咖啡中的绿原酸可以至少部分地用于降低血糖失调如糖尿病的风险。

从健康和营养观点来看，希望的是，消费者应该能够从上述确定的咖啡的积极健康方面获益，所以使咖啡产品可用的绿原酸的量最大化将是非常有利的。在此背景下，本发明实现了显著的技术优势，即与现有提取物中存在的只有20-50％的绿原酸含量相比，绿咖啡豆提取物的绿原酸含量显著提高至70％-80％。

阐述和公开使这样的增长成为可能的具体机制的方法提高了其在改进从其他来源的提取物的绿原酸含量中的适用性。

US 2002/0160067 A1公开了绿原酸疑似在防止心血管疾病中是有益的，对大鼠胃癌具有化学预防作用以及抑制仓鼠的甲基氧化偶氮甲醇诱导的大肠肿瘤。体内试验表明三分之一的绿原酸和几乎所有的咖啡酸在人的小肠被吸收。这意味着来自食品的部分绿原酸会进入血液循环，但多数会到达结肠。咖啡酸似乎是具有更高的生物可利用性(Olthof et al JNutr 2001 January；131(1):66-71)。咖啡包含主要是带有不同量的结合在奎宁酸的不同位置的咖啡基基团的奎宁酸的酯的酚酸。绿原酸是咖啡中主要的酚酸，能够保护胃黏膜免受刺激，并且因此，改善了食物、饮料和药物的可消化性。通过系统性的酸分泌大量减少(例如导致烧心等)来表现出改善的可消化性，已经发现这种系统性的酸分泌的大量减少直接依赖于烘焙咖啡中绿原酸水平的增加。

咖啡加工期间绿原酸的损失：其中所有有助于终产物的咖啡豆被烘焙的常规咖啡加工方法是熟知的。特殊的味道和香气很大程度是在咖啡豆的烘焙期间形成的。然而，已经发现烘焙过程降解了烘焙前存在的大量的绿原酸。不过，实现希望的“烘焙的”咖啡口味对消费者是如此重要，使得到目前为止有必要烘焙咖啡豆到显著的程度，即使知道这会导致某些有益化合物的不希望的降低。绿咖啡的天然绿原酸的含量可以在常规烘焙过程中最多减少按重量计约40-90％。

因此提供一种既保留比传统上与烘焙咖啡相关的更高水平的绿原酸，但又提供了可接受的甚至更希望的烘焙咖啡口味的咖啡产品是高度希望的。理想地，咖啡产品应该至少提供消费者希望的感官特性和/或避免或最小化任何不希望的感官特性。

本发明公开了一种绿咖啡豆提取物，其中绿原酸的浓度显著高于公开的市场上获得的样品中公开的浓度或现有技术方法所公开的浓度(70-80％对比20-50％)。

因此，本发明的提取物在“加强”含大量通常在烘焙过程中损失的绿原酸的现有咖啡制备物或食品和饮料、药物、化妆品等上具有相当大的商业重要性。

绿咖啡豆-术语“绿咖啡豆”是指尚未烘焙的未成熟的咖啡豆或甚至成熟的咖啡豆。绿咖啡豆中的非挥发性化合物和挥发性化合物，例如咖啡因，阻止许多昆虫和动物食用它们。它们也有助于烘焙时咖啡豆的口味。非挥发性的含氮化合物(包括生物碱、葫芦巴碱、蛋白质和游离氨基酸)和碳水化合物对产生烘焙咖啡的全部香气以及其生物作用是至关重要的。绿咖啡豆是绿原酸和其他与数种有益健康作用相关的植物化学物质的丰富来源。植物化学物质的大部分在咖啡豆的加热和烘焙期间被破坏。由研磨并烘焙的咖啡豆生产的咖啡饮料中的关键化合物是产生独特香气的挥发性成分，生物碱咖啡因和葫芦巴碱、绿原酸，二萜咖啡醇和咖啡豆醇和类黑精，它们是美拉德反应(Millard reaction)的产物。

绿原酸-这是文献中用于描述植物材料中发现的一系列酚酸的稍微粗略地使用的俗名。例如，在某些参考文献中，5-咖啡酰奎宁酸单独被称为“绿原酸”。然而，本文所使用的术语绿原酸用于描述在某些顺式或反式肉桂酸和奎宁酸之间形成的酯族中的一个或多个。

为了本发明的目的，术语“绿原酸”是指7种绿原酸同系物的总和，即3-咖啡酰奎宁酸(3-CQA)、4-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)、5-咖啡酰奎宁酸(5-CQA)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(3,4-diCQA)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(3,5-diCQA)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(4,5-diCQA)、4-阿魏酰奎宁酸(4-FQA)和5-阿魏酰奎宁酸(5-FQA)。可以通过在320nm处紫外检测的HPLC，使用5-CQA作为外部标准以计算浓度来测定绿原酸异构体。通过对本发明的绿咖啡豆提取物的分析获得的HPLC图谱显示七个特征峰，如图2所示。

分子式：C₁₆H₁₈O₉；摩尔质量：354.31g/mol以及密度：1.28g/cm³

酸的结构在图1中给出。

绿原酸的健康益处

生绿咖啡豆中发现的绿原酸与几种健康益处有关，所述健康益处包括控制高血压、控制血液葡萄糖，还有减轻体重。虽然绿原酸在绿咖啡豆中以高浓度存在，但是当咖啡豆被“烘焙”时会破坏绿原酸。生咖啡豆是绿原酸最丰富的天然植物来源。含有约40-50％绿原酸的粉末形式的绿咖啡豆提取物通常作为补充剂(以胶囊的形式)消费，因为饮用由未烘焙的咖啡豆制作的液体咖啡会有苦的令人不快的味道，并且不会提供期望剂量的绿原酸。

最近的某些研究认为绿原酸可以改善视网膜健康。其他的研究表明，绿原酸抑制葡萄糖向血流中释放，日本研究人员在2005年做了一项研究，对某些参与者使用安慰剂，对其他人使用绿咖啡豆提取物，测试物质对有轻度高血压的人的潜在影响。其结果是血压降低并且没有负面副作用。目前正在进行大量针对使用绿咖啡豆提取物作为抗肥胖剂和治疗生活方式相关疾病，如可能由于肥胖导致的糖尿病的研究。

按照商业制造商的推荐(http://healthfoodpost.com/green-coffee-extract/green-coffee-bean-dosage/)的推荐剂量的绿咖啡豆提取物是一个400mg的胶囊每日服用三次。应该在早餐、午餐和晚餐前30分钟服用补充剂。制造商警告该剂量每日不超过4个胶囊(1600mg)。绿咖啡豆提取物包含50％绿原酸。因此，绿原酸的建议的安全日剂量为600mg(如果服用3个胶囊，每个胶囊400毫克，含50％绿原酸)。本发明的提取物具有更高含量的绿原酸(70-80％)，因此所需的胶囊数量少或对于相同数量的胶囊，消费者可以获得更好的治疗效果。

关于咖啡因的存在的关注：除绿原酸以外，提取物还包含痕量的咖啡因。一个胶囊可能包含大约8mg咖啡因(因此3个胶囊将包含约24mg咖啡因)。典型的一杯普通咖啡平均包含150mg咖啡因。某些烘焙的咖啡每杯包含多达400mg咖啡因。因此，膳食胶囊中咖啡因的量比直接以咖啡饮料消费的咖啡因少很多，因此该量是不不被关注的原因，除非一个人对最少量的咖啡因非常敏感。

因此，绿色咖啡豆提取物中的生物活性成分是除其他植物化学物质外的“绿原酸”。根据绿原酸的含量，例如绿色咖啡豆提取物包含40％绿原酸、50％绿原酸等执行膳食补充剂的标准化。因此提取物的绿原酸的含量具有相当大的治疗和商业价值。

本发明的绿原酸含量-除了存在其他在加热和烘焙咖啡豆期间被破坏，但由于提取在不加热下完成而存在于本发明的部分中的有用的植物化学物质以外，本发明的提取物具有显著高于现有技术或市场上获得的产品的绿原酸的浓度(几乎两倍)。本发明的部分的绿原酸的含量是约70-80％，而市场上获得部分的绿原酸的含量是约40-50％。

本发明的提取物因此表示具有在抗氧化活性方面相当高的生物活性的独特产物，并且还存在另外在绿咖啡豆受到烘焙和加热时会被破坏的有价值的植物化学物质。因此，根据含有的显著更高含量的绿原酸(70-80％)，本发明的提取物是新颖的，没有在现有技术中公开，以及连同实现该提取物的方法在本发明中是首次阐述。进一步地，本发明的方法适用于获得自其他天然来源(包括烘焙的咖啡豆)的提取物。

现有技术专利

US专利号8197875B2公开了使用绿原酸作为抵消添加至食品或饮料中的人工增甜剂的令人不愉快的味道或异味的药剂以及其提取方法。公开了绿原酸的提取方法。它包括使用完整的绿咖啡豆或研磨的咖啡豆，它们通过在由水和极性有机溶剂组成的溶剂中连续搅拌进行提取。可以使用的所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮和丙二醇。咖啡豆可以是常规的咖啡豆或脱去咖啡因的咖啡豆。它们可以以完整的咖啡豆提取或在研磨后提取。既可以单独用水也可以用水与一种或多种以上列出的溶剂结合进行提取。优选的溶剂是甲醇和乙醇。溶剂的组成可以为100/0水/有机溶剂(w/w)至10/90水/有机溶剂(w/w)。提取温度可以为30℃至80℃，并且提取时间可以为4小时至40小时。获得最大提取效率而不导致显著的5-CQA的异构化的优选的温度为45℃至60℃。提取可以使用本领域技术人员已知的设备进行，例如逆流提取器或具有恒溶剂循环的提取器。

通过该发明的方法获得的提取物中的绿原酸含量仅为35-52％，而在本发明提取物中的绿原酸含量是约70-80％。

EP1674106A1公开了一种饮食组合物，其包括绿咖啡的提取物，该提取物通过以下方式制备：使用正己烷提取和分离来自绿咖啡豆中的油以产生脱脂绿咖啡豆和用乙醇浓度为40至90％(wt./wt.)的含水乙醇制备由脱脂绿咖啡豆衍生的极性溶剂提取物。

通过该发明的方法获得的提取物中的绿原酸含量仅为20-40％，而在本发明提取物中的绿原酸含量是约70-80％。

WO 2006/108578公开了一种通过烘焙咖啡和绿咖啡的结合制备的咖啡产品，其使绿咖啡中的高水平的抗氧化剂和烘焙咖啡的味道和香气结合在一起。

最终组合物仅包含8-10％绿原酸，其远低于如本发明所公开的70-80％。

EP 2 512 260 B1公开了生产咖啡提取物的方法，包括a)在100℃至180℃的温度下加热处理绿咖啡豆至少5分钟，保持水分水平占咖啡豆总重量的6％至20％以及b)提取步骤a的处理过的咖啡豆以产生液体咖啡提取物；其中所述咖啡豆和/或咖啡提取物不经受烘焙。可以通过任何合适的方法提取经处理的绿咖啡豆，所述方法例如，使用水、乙醇、或任何其他合适的溶剂。在一种优选的实施方式中，加热处理的绿咖啡豆用含水液体如水或基于水的咖啡提取物提取。

如该专利所公开的提取物中的绿原酸的最大浓度为5-11％，而在本发明中的绿原酸含量为70-80％。

US 4938978描述了一种这样的方法通过该方法绿咖啡豆的含水量提高至基于湿咖啡豆的重量，按重量计至少25％至30％。然后在基本上惰性的气体气氛存在下，在正压力和足够的温度下加热润湿的咖啡豆足够的时间，以水解并热解咖啡豆，同时基本上避免咖啡豆碳化。然后使处理的咖啡豆干燥。所公开的固体的提取物收率为35-41％。

假设50％的固体是绿原酸，那么绿原酸的收率仅是约17.5％至约20.5％，而本发明的绿原酸含量为70-80％。

US 2002/0160067 A1公开了由绿咖啡豆制备提取物的提取方法。所述方法涉及研磨咖啡豆以形成粉末，然后将粉末用醇(甲醇/其他醇)的水溶液提取。该发明的焦点是公开了富含具有有益健康作用的化合物即酚或多酚化合物的提取物，该提取物通常从绿茶中提取，也可以从绿咖啡豆中提取。所公开的方法是简单的。然而，该专利没有提及最终提取物中的绿原酸的浓度，而本发明的提取物除了其他有用的酚类化合物外，包含高含量(>70％)的绿原酸。

US 2011/0189313 A1公开了由绿咖啡豆制备的提取物，其使用含水醇溶剂和非极性化合物即己烷使咖啡豆脱脂。使咖啡豆脱脂提高了提取的多酚化合物的收率，因此提供了有益的健康作用以及更有效的提取物。根据该专利的发明人进行的研究，脱脂绿咖啡豆的极性溶剂提取物包含相当大的量的绿原酸和咖啡因。特别地，其中的饮食功能的绿原酸被浓缩。更特别地，包含浓度为20wt％或更多的绿原酸的提取物以及包含浓度为45wt％或更多的绿原酸类(绿原酸、阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸等)的提取物可以大大改进节食方法的作用。该发明的提取物中的绿原酸的浓度是45％，而本发明的提取物除了其他有用的酚类化合物外，包含高含量(>70％)的绿原酸。

从前面的讨论中，明显的是没有现有的用于绿咖啡豆提取的方法导致产生提取物中绿原酸的含量多于50％的提取物。本发明的发明人已经能够成功制备这样的提取物，其中绿原酸含量非常高即70-80％，从而提高了所产生的提取物的营养以及治疗价值。

发明目的

鉴于上文，本发明的一个目的是提供来自绿咖啡豆的提取物，其对健康有益。

本发明的另一个目的是提供具有生物成分的提取物，其被认为当人消费时具有有益的抗氧化特性。

本发明的另一个目的是提供具有生物成分的提取物，其被认为当人消费时具有有益的健康特性，即抗肿瘤、抗糖尿病、抗高血压和抗肥胖特性。

本发明的另一个目的是提供促进健康的提取物，其含有的成分当可获取自替代来源时，以比目前可通过常规源材料或通过常规方法的实践获得的成分更有益的量或比率存在。

本发明的另一个目的是提供一种生产富含酚类化合物的新方法。

本发明的另一个目的是提供一种从绿色咖啡豆生产富含酚类化合物的新方法，其中活性化合物即绿原酸的浓度显著高(70-80％)于通过常规方法获得的绿原酸(20-50％)。

本发明的另一个目的是提供一种生产富含酚类化合物的提取物的新方法，该提取物含有的成分当可获取自替代来源时，以比目前可通过常规源材料或通过常规方法使用获得的成分更有益的量或比率存在。

本发明的另一个目的是提供一种生产富含酚类化合物的提取物的新方法，其从目前还没有被认为是这样的化合物的实用来源的源材料生产。

本发明的另一个目的是提供一种用于从绿咖啡豆中提取酚类化合物的新方法。

本发明的另一个目的是提供一种新的提取物，其可以用作包含绿咖啡豆提取物的膳食补充剂、增味剂或功能性食品，所述绿咖啡豆提取物含有多酚酸和其他有益化合物如二萜。

本发明的另一个目的是提供一种改进的提取物加工方法，其产生比存在的多酚提取物更健康的多酚酸和其他有益化合物的提取物。

本发明的另一个目的是提供一种改进的提取物，其比常规方法加工的多酚提取物更有生物可利用性。

本发明的进一步目的是提供一种改进的生绿咖啡豆提取物，其由于更高的绿原酸含量而产生比存在的多酚提取物更多的健康终产物。

本发明的最终目的是提供一种改进的来自绿咖啡豆的提取物，由于显著比现有技术公开的含量为约40-50％的绿原酸高的含量为>70％的绿原酸，因此其具有比通过常规方法加工的多酚提取物更大的猝灭氧化应激和破坏自由基的能力。

作为这些和相关目的的补充，本发明是来自咖啡豆的提取物，该提取物包括酚酸的有益措施，还有生产这样的提取物的方法。

显著地。本文教导的简单方法生产一种提取物产物，其具有更多的生物可利用性，比任何其他存在的集中于酚化合物的产物含有更健康的抗氧化剂谱(酚化合物和绿原酸)和更多的二萜(具有解毒特性)(70-80％绿原酸含量对比市场上获得产品中20-50％绿原酸含量)。

发明内容

本发明提供了来自绿咖啡豆的提取物，由于其抗氧化、抗肿瘤、抗肥胖、抗高血压、抗酸和抗糖尿病特性而对健康有益。该新型提取物可以用作包含绿咖啡豆提取物的膳食补充剂、增味剂或功能性食品。所述提取物包含多酚和生物活性化合物，如绿原酸，其浓度(70-80％)显著高于通过现有技术方法获得的提取物中存在的绿原酸浓度(仅含有约20-50％绿原酸)。这通过在绿咖啡豆提取物的提取/纯化的特定阶段使用特定的极性低于醇和/或水不混溶的溶剂如正丁醇、乙酸乙酯或丙酮完成。作为结果，最终提取物高度富集了绿原酸部分，因为当绿原酸被提取至低极性溶剂中时，极性杂质留在含水介质中。因此防止了在中间阶段，即含水阶段活性成分的损失。这导致在最终提取物中绿原酸的浓度(70-80％)显著高于在仅使用水和醇的现有技术方法获得的绿原酸的浓度(20-50％)。

具体实施方式

绿原酸是存在于绿咖啡豆提取物中的生物活性化合物，并且是提取物的有益健康作用的原因。这样的提取物可以以胶囊剂或片剂的形式作为膳食补充剂在市场上获得。因此，高含量的单次剂量形式的生物活性化合物是希望的，以替代服用过多剂量形式例如片剂、胶囊剂等，一个人可以服用单个片剂或胶囊剂，导致对患者的便利，还有更好的服用膳食补充剂的依从性和规律性。

现存的市场上可获得的绿咖啡豆提取物的限制：然而，市场上可获得的绿咖啡豆提取物(用水和醇混合物提取)不具有含量高于50％的绿原酸。事实上，范围在20-50％。绿咖啡豆提取物中具有高含量的生物活性化合物即绿原酸是需要和希望的，以得到更好的治疗谱，还有对服用所述提取物作为膳食补充剂的一部分人更好的依从性。然而，尽管尽了最大努力，在商业水平上没能达到使提取物中绿原酸含量的富集超过50％。

在本发明中克服了限制的方式：在本发明中以创新的方式克服了绿原酸含量不超过50％的技术问题。这已经通过在提取的特定阶段使用特定的极性低于醇的溶剂达到，这是由于提取效率大量提高以及被浪费且不会被提取的绿原酸也被提取出来。这导致绿咖啡豆提取物的大量富集至70-75％，而在现有技术方法中其仅仅是20-50％。大多数现有技术方法利用水-醇混合物来提取，并且不能获得绿原酸含量高于50％的提取物，这是因为完全没有使用对绿原酸具有更好亲和力的低极性的特定溶剂。

本方法使用的溶剂的极性如下表1给出。该表清晰地展示了使用极性低于醇的溶剂(对绿原酸具有更好和特异的亲和力)，导致绿咖啡豆提取物更好的富集，导致最终提取物中绿原酸的含量(70-75％)远高于仅使用水和醇混合物时所获得的绿原酸含量。

表1.用于绿原酸提取的溶剂的极性

数据来源：Christian Reichardt,有机化学汇总的溶剂和溶剂作用(Solventsand Solvent Effects in Organic Chemistry),Wiley-VCH Publishers,3rd ed.,2003(http://sites.google.com/site/miller00828/in/solvent-polarity-table)

从除绿咖啡豆以外的其他天然来源提取绿原酸：除了绿咖啡豆，也可以容易地将本发明的方法用于由其他富含绿原酸的植物来源，即马铃薯、竹子(毛竹(Phyllostachys edulis))、桃、帚石楠(calluna vulgaris)(石楠属植物)的剪枝和嫩枝制备浓缩的绿原酸提取物。也可以在某些通常使用的药用草本植物中发现绿原酸作为重要成分(http://www.itmonline.org/arts/cholorogenic.htm)。在中药中，首要来源是忍冬花(金银花(jinyinhua))；杜仲皮和栀子果也是主要来源，其提取物标准化为20％绿原酸。其他已知用于中草药的绿原酸含量的中草药包括菊花、山楂果、艾叶和淫羊藿叶。在西方草本药物中，尤其因草药的绿原酸含量而已知的草药是洋蓟叶(artichoke leaves)；提取物通常标准化为15％的该化合物。其他因绿原酸含量而已知的药用草本包括牛蒡根、蒲公英根和紫锥花根。当使用任何这些草药(西方国家的或中国的)以及浓缩的草药提取物时，其他有助于治疗效果的化合物也存在。例如，洋蓟叶含有咖啡酰奎宁酸(如在烘焙咖啡中发现的)和洋蓟酸(cynarin)，其因缓解腹气和腹胀、伴随胆结石发生的症状和低胆汁流量(poor bile flow)而闻名。

本发明用于制备浓缩的绿原酸提取物的方法

可以单独使用极性低于醇的水不混溶/溶剂(因此完全地消除了对水醇溶剂的需求)或与含水醇溶剂一起使用以提高从绿咖啡豆或其他富含绿原酸的天然来源获得的提取物中绿原酸的收率。在提取/纯化的不同阶段在使用不同溶剂(极性低于醇)方面，本领域技术人员可以容易地执行变化的方法，并且可以将变化的方法视作在本发明的范围和公开内容之内。

最佳的方法，其中提取通过使用特定的溶剂乙酸乙酯(具有0.228的极性，该极性低于甲醇的极性0.762)来进行提取，通过实施例1的方法在下面给出完全消除了醇的使用。特定溶剂(极性低于醇)与水-醇混合物一起使用的实施方式可以导致富集的绿咖啡豆提取部分，如实施例2至实施例4所描述。

实施例1

不使用醇情况下的提取

在该方法中，提取中完全没有使用醇。而是在第一阶段本身使用水不混溶性溶剂，即乙酸乙酯进行绿原酸的提取。然后，通过使用溶剂去除油脂和咖啡因以纯化提取物。因此该方法在整个过程中仅使用了三种溶剂，水、乙酸乙酯和氯化溶剂(氯仿、二氯甲烷用于去除咖啡因)，

提取：将粉状的咖啡豆(1kg或1000g)装入配有搅拌器的5.0升烧瓶中。在40-50℃下添加2升酸性水并逐渐升高至45-55℃，连续搅拌4小时。然后，添加4倍于水的量(即4升)的乙酸乙酯，并在稍微提高的温度50-55℃下进行搅拌。将水和溶剂混合物过滤，并且将粉末转移回烧瓶。将用水和溶剂提取的步骤重复2-3次，直到草本完全耗尽，将溶剂层与水分开并浓缩以干燥。

纯化：将获得的干物质(干提取物)溶解于500ml水中。然后用250mL氯化溶剂(氯仿、二氯甲烷等)洗涤水溶液两次，以去除咖啡因，如果咖啡因浓缩至过高的量可能是有害的。因此，咖啡因的去除是必需的。然后蒸发水以获得本发明的干粉末绿咖啡豆提取物。脱脂步骤或使用溶剂去除油脂是不需要的。

收率和绿原酸含量：110-120g，即11-12％淡黄色细粉末形式的提取物。通过HPLC得到的绿原酸的含量为70-80％。提取物的分析分布显示出绿原酸的七个特征峰，于图2中给出。

实施例2至4

使用醇提取

也可以分别在提取和纯化的不同阶段使用涉及含水醇混合物和水不混溶/溶混的低极性溶剂的步骤的组合获得高收率。使用水-醇混合物提取。通过用己烷(用于去除油脂)和氯化溶剂如氯仿、二氯甲烷(用于去除咖啡因)等洗涤提取物进行纯化。在纯化的最后步骤中，使用极性低于甲醇或乙醇的水不混溶性/水溶混性极性溶剂即正丁醇、丙酮或乙酸乙酯。这导致提取物含有70-80％的高含量的绿原酸。

实施例2

用水-醇混合物和正丁醇提取

提取：将粉状的咖啡豆(1kg或1000g)装入配有搅拌器的5.0升烧瓶中。在40-50℃下添加4倍于咖啡豆粉末的量(即4升)的水-醇(甲醇)混合物，并逐渐升至45-55℃，连续搅拌4小时。过滤水和醇混合物，并且将粉末转移回烧瓶。将用水和醇提取的步骤重复2-3次，直到草本完全耗尽。极性化合物因此被提取至水-醇混合物中。然后通过真空浓缩混合物，且容器内的体积减少至800-1000mL。

纯化：通过每次用500mL己烷洗涤获得的水层两次进行水层的脱脂。去除油脂后，每次用600mL氯化溶剂如氯仿、二氯甲烷等洗涤水层三次，以去除咖啡因。现在不含油脂和咖啡因的水层中富含绿原酸。将该水层酸化并每次使用600mL正丁醇提取三次，以提取绿原酸。将提取物结合并浓缩至干燥以获得最终的具有高含量绿原酸的绿咖啡豆提取物。

产量和绿原酸含量：获得的产量为90-100g，即9-10％淡黄色细粉末形式。通过HPLC得到的绿原酸的含量为70-80％。分析谱与图2给出的类似。

实施例3

用水-醇混合物和丙酮提取

提取：使用水-醇混合物进行，如实施例2所述。

纯化：使用另一种极性低于醇的极性溶剂即丙酮替代正己烷。其他步骤保持一致。

产量和绿原酸含量：获得的产量为100-110g，即10-11％淡黄色细粉末形式。通过HPLC得到的绿原酸的含量为70-80％。分析谱与图2给出的类似。

实施例4

用水-醇混合物和乙酸乙酯提取

提取：使用水-醇混合物进行，如实施例2所述。

纯化：使用另一种极性低于醇的极性溶剂即乙酸乙酯替代正丁醇。其他步骤保持一致。

产量和绿原酸含量：获得的产量为75-90g，即7.5-9％淡黄色细粉末形式。通过HPLC得到的绿原酸的含量为70-80％。分析谱与图2给出的类似。

HPLC分析条件

对于如上面的实施例中所获得的提取物的分析遵循的HPLC分析条件在下面进行阐述。

参比溶液制备：在50mL容量瓶中装入30mg绿咖啡豆提取物工作标准品。添加40mL稀释液并进行超声处理10min。用稀释液补至终体积。摇匀溶液并用0.45μ滤器过滤。

测试溶液制备：在50mL容量瓶中装入30mg绿咖啡豆提取物样品。添加40mL稀释液并进行超声处理10min。用稀释液补至终体积。摇匀溶液并用0.45μ滤器过滤。

纯度的色谱评价：溶剂流速、分析柱类型、流速条件等如下所述：

样品编号	描述	色谱条件
			1	柱	Luna 5μC 18(2)250×4.6mm
2	流速	1.5ml/min
			3	检测器	UV,330nm
4	运行时间	40.0min
			5	柱箱温度	25℃
6	稀释液相	乙腈:甲酸:水(10:2:9)

计算：

从以上的表和实施例中，明确的是本发明的改良的方法导致绿咖啡豆提取物，其中生物活性化合物即总绿原酸的含量即70-80％远高于任何现有技术专利中提及的提取物，并且由于使用了独特的和区别性的极性低于提取过程中使用的醇溶剂即甲醇或乙醇的极性溶剂，因此所述提取物具有独特的和区别性的组成。在本发明中，使用极性低于醇的溶剂导致提取富含绿原酸的部分而将极性杂质留在含水介质中。由于在本发明的提取物中存在更高浓度的生物活性化合物(绿原酸和其他多酚化合物)以及从绿原酸的清晰峰可以看出的更高纯度(图2)，因此本发明的提取物具有大大改进的治疗谱。相反地，当分析市场上可获得的绿原酸提取物样品时不仅显示远远更低的绿原酸的含量，而且有数个其他另外的峰(图3)，从而表明存在其他化合物，这些其他化合物在本发明的提取物中是不存在的。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.添加等量的水并在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.以4倍于原料的量添加极性低于醇的极性溶剂乙酸乙酯，并且在50-55摄氏度下搅拌直至提取完成；

iv.分离并干燥溶剂层以获得干物质，然后通过将该干物质溶解于水中并用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤以去除咖啡因来纯化所述干物质；

v.将水蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

2.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用极性低于醇的极性溶剂正丁醇提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

3.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用极性低于醇的极性溶剂丙酮提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

4.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用极性低于醇的极性溶剂乙酸乙酯提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

5.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用任何适当的极性低于醇的极性溶剂提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

6.通过如权利要求1所述的方法获得的富含绿原酸和多酚，并且具有如图2所示的HPLC指纹图谱的绿咖啡豆提取物。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

声明u/A.19(1)Rule 46

以下声明解释了提交的权利要求的修改细节。

修改原因：根据在其WO的Re Item V中由ISA关于新颖性和创造性进行的评述进行修改。

修改：

未决权利要求1-9已经被替换为修改后的权利要求1-6。

解释：

Ibtisam公开了一种提取方法，包括瞬间控制压降(DIC)辅助的溶剂提取来自绿色咖啡豆的总酚以及使用回流溶剂系统。没有提及提取物的纯化或脱咖啡因以获得高达70-80％的绿原酸含量。

因此，如在本发明中公开的绿咖啡豆的提取和纯化方法相对于Ibtisam的方法是新颖的并且不能被认为是通过由Ibtisam的公开内容预期到的。

Chien等人的美国专利申请号2012/0189750没有明确公开包括使用极性溶剂提取的方法。此外，如实施例所记载的纯化方法完全不同于本发明中使用的方法。

实施例1使用沉淀方法，其公开了仅高达35％的绿原酸含量(参见0043段第20行和第5页的表)，而本发明的方法公开了绿原酸含量为高达70-80％。

实施例2使用洗涤方法，其公开了使用乙酸乙酯/乙醇混合物洗涤并且得到的提取物包含仅高达约40.88％的绿原酸含量(0045段13-15行，以及表)。

实施例3和4使用微滤和吸附方法，在本发明中没有使用这样的方法。

实施例5采用离心/过滤法也导致最终的绿原酸含量高达约51.4％(0051段和表)。

实施例6-11与本发明记载的不相关。

因此，不能被认为通过Chien等人的美国专利申请号2012/0189750中公开的内容预期到本发明。

Morrison等人的美国专利号4409253暗示了脱咖啡因的各种方法，但这些方法涉及使用烘焙咖啡豆提取物并进一步对其进行脱咖啡因。

本发明使用生咖啡豆提取总酚，然后进行纯化步骤以获得高达70-80％的绿原酸含量，该含量在所述美国专利中的任何地方均没有公开。

由上述清楚的是，本发明的方法是完全不同的，并且不能通过上述现有技术文献预期到。

修改的效果：

通过该解释和修改，本发明的新颖性和创造性特征充分地突出显示出来，并引入权利要求中。现在看来本发明符合新颖性和创造性的标准。

Claims (6)

1.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.添加等量的水并在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.以4倍于原料的量添加极性低于醇的极性溶剂乙酸乙酯，并且在50-55摄氏度下搅拌直至提取完成；

iv.分离并干燥溶剂层以获得干物质，然后通过将该干物质溶解于水中并用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤以去除咖啡因来纯化所述干物质；

v.将水蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

2.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用极性低于醇的极性溶剂正丁醇提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

3.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用极性低于醇的极性溶剂丙酮提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

4.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用极性低于醇的极性溶剂乙酸乙酯提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

5.一种用于从干燥的咖啡豆产生具有含量为70-80％的绿原酸的浓缩提取物的方法，其中，所述方法包括如下的提取和纯化步骤：

i.使源材料如干燥的咖啡豆变成粉末；

ii.以4倍于原料的量添加水-醇混合物，并且在45-55摄氏度的温度下搅拌4小时；

iii.重复提取2-3次直至所述原料完全耗尽；

iv.通过蒸发减少体积至四分之一；

v.通过用己烷洗涤去除油脂；

vi.通过用氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷洗涤去除咖啡因；

vii.最后通过使用任何适当的极性低于醇的极性溶剂提取绿原酸；

viii.将溶剂蒸发以获得本发明的干粉末提取物，其中绿原酸的含量为70-80％。

6.通过如权利要求1所述的方法获得的富含绿原酸和多酚，并且具有如图2所示的HPLC指纹图谱的绿咖啡豆提取物。