JP2023139073A - 微小液滴の操作方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】油等の非混和性の担体液において、生物学的細胞を含む水性微小液滴を操作する改良された方法を提供する。【解決手段】少なくとも１つの生物学的成分と、１未満の水分活性ａｗ１を有する第１の水性媒体とを含み、０．５フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有する微小液滴を操作する方法であり、前記微小液滴を、第２の水性媒体を含み、前記微小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む水非混和性の担体液中に維持するステップを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：１より大きい、方法である。該方法は、例えば、液滴ベースの核酸配列決定装置において調製されるような生物学的細胞を含む微小液滴又は単一ヌクレオシドリン酸を含む微小液滴とともに使用されてもよい。【選択図】図１

Description

本発明は、油等の非混和性の担体液において、任意で生物学的細胞を含む水性微小液滴
を操作する改良された方法に関する。それは、微小液滴のサイズを制御又は調整すること
を可能にし、そこで生じる任意の酵素反応又は化学反応を、所定時間の間、維持又は最適
化することを可能にする。
我々の以前の特許出願、例えば、国際公開第２０１４／１６７３２３号、国際公開第２
０１５／１２１６７５号、国際公開第２０１６／０１２７８９号、国際公開第２０１７／
１４０８３９号、及びＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６６５７４において、ＤＮＡ及びＲＮＡ
の配列決定、並びに細胞及びウイルスの検出及び特徴付けを含む一連の分析を実施する目
的で、細胞、酵素、オリゴヌクレオチド、さらには単一ヌクレオチド等の生物学的成分を
微小液滴内で操作する方法を記載した。いくつかの実施形態において、これらの方法は、
エレクトロウェッティング推進力を用いるか、又は担体液でコーティングされた基板上に
微小液滴を直接印刷することによって、分析装置内のマイクロ流体経路に沿って非混和性
の担体液中に分散した微小液滴を移動させることを含む。微小液滴の体積分率が比較的低
い多くの例において、これらの微小液滴は時間の経過とともに大幅に収縮する傾向にあり
、これは、時に、内部で進行する酵素プロセスの一部又はすべてを妨げる可能性があるこ
とを我々は見出した。また、他の例では、所与の分析が実行されるときに、デバイスの一
部において微小液滴のサイズを意図的に収縮又は拡大させることが望ましい場合がある。
今回、我々は、これらの問題を克服する微小液滴の操作方法を開発した。それは、例え
ば、微小液滴の内容物のサイズ及び／又は反応性を操作するために、又はそこで生じる化
学反応又は酵素反応を制御するために使用されてもよい。本発明は、添付の特許請求の範
囲に定義されるとおりである。本発明の第１の態様によれば、少なくとも１つの生物学的
成分と１未満の水分活性ａｗ１を有する第１の水性媒体とを含む０．５フェムトリットル
から１０ナノリットルの範囲の平均体積を有する微小液滴を操作する（微小液滴の内容物
のサイズ及び／又は化学組成を制御する）包括的な方法であり、微小液滴を、微小液滴の
平均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大４フェムトリットルまでの第２の水性媒体
の二次液滴をさらに含む水非混和性の担体液中に維持するステップを特徴とし、全体の単
位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：１より大きい方法が
提供される。
図１は、油の水和なしの０時間及び２４時間でのベースライン測定に対して、２４時間培養後に得られた結果を比較している。 図２にヒストグラムとして示されるデータは、水和していない油（「ドライオイル」）、水で水和した油（「水のみ」）、又は液滴の緩衝液濃度の３倍で水和した油（「３×緩衝液」）でインキュベートした６μｍ液滴の平均蛍光強度を示す。
本発明の範囲を限定することを望まないが、本発明は、微小液滴の全体的な特性又は微
小液滴に適用される任意の検出方法の有効性に悪影響を及ぼすことなく微小液滴と相互作
用することができる非常に小さな二次液滴を含む担体液を用いることにより、課題を解決
すると考えられる。担体媒体が油である場合、このような複合媒体を「水和油」と称する
ことがある。この点で重要な特徴は、微小液滴と二次液滴との相対的な水分活性が特定の
パラメーター内で制御されていることであり、任意で、継続的な監視及び／又はフィード
バックループにより制御されている。ここで、水性媒体の水分活性（ａｗ）は、ＳＴＰ条
件下での純水の部分蒸気圧に対する調査中の水性媒体の部分蒸気圧の比率として定義され
る。水は、高水分活性から低水分活性への勾配に沿って拡散する傾向があるため、我々の
システムの制約内で、第２の水性媒体の水分活性（ａｗ２）が第１の水性媒体の水分活性
（ａｗ１）よりも高い場合、正味の効果は、２つの成分の水分活性が等しくなるまで微小
液滴が膨張することであることを我々は見出した。逆に、第２の水性媒体の水分活性が第
１の水性媒体の水分活性よりも高い場合、微小液滴は、これらの水分活性が等しくなるま
で収縮する傾向にある。１つの有用な実施形態において、第１及び第２の水性媒体の水分
活性は、微小液滴が収縮又は膨張する任意の傾向が連続的に打ち消されるように、同じ又
は実質的に同じであってもよい。したがって、微小液滴のサイズは常に維持されていても
よい。また、これらの二次液滴を用いることによって、例えば、この方法を採用する任意
の装置の１つ又は複数の点で細胞増殖成分を微小液滴に供給するために二次液滴を用いる
ことによって、微小液滴中で生じるあらゆる酵素反応又は化学反応を保存する又はさらに
強化するのを補助できることを、我々はこれらの手段により見出した。第１及び第２の水
性媒体は、一実施形態では同一である組成物を有していてもよい。
したがって、本発明の１つの実施形態において、第１及び第２の水性媒体の水分活性は
、独立して、０．９～１の範囲にある。別の実施形態では、第１の水性媒体の水分活性は
、０．９以上１未満である。さらに別の実施形態では、第１及び第２の水性媒体の水分活
性の比（ａｗ１：ａｗ２）は、０．９：１～１：０．９の範囲にある。
操作を行う便利な方法の１つは、緩衝液である第１及び第２の媒体を用いることであり
、必要に応じて、２つの相対組成を変えることによって行う。例えば、１つの適用では、
第１の水性媒体のイオン強度は、第２の水性媒体のイオン強度から１～５の範囲にあり、
好ましくは３～５倍である。別の適用では、第２の水性媒体のイオン強度は、第１の水性
媒体のイオン強度の１～５倍の範囲にあり、好ましくは３～５倍である。さらに別の適用
では、イオン強度は同じか又は実質的に同じであり、イオン強度の比は３：１～１：３の
範囲にある。１つの特に有用な実施形態では、第１及び第２の水性媒体のいずれか又は両
方が、成分としてグリセロールを、例えば異なる濃度で含んでいてもよい。別の実施形態
では、第１及び第２の水性媒体のｐＨは同じか又は類似しており、６．５～８の範囲内で
ある。
二次液滴に関しては、これらは微小液滴の平均値よりもはるかに小さい平均体積を有し
、限界においては、担体液内で乳化され、非イオン性界面活性剤等の相溶性の界面活性剤
分子の鞘（ｓｈｅａｔｈ）によって安定化された第２の水性媒体のフェムトサイズの液滴
又はミセルからなっていてもよい。１つの実施形態において、これらの二次液滴のサイズ
は、使用される微小液滴の体積の１０％未満であり、好ましくは５％未満である。別の実
施形態では、二次液滴の平均体積は、微小液滴の平均体積の１０～１％の範囲内にある。
適切には、二次液滴は、１つの実施形態では非混和性油である担体液中で安定なエマルジ
ョンの一部を形成する。適切には、担体液は、鉱油、シリコーン油、又はフルオロカーボ
ン油から選択される。油には、必要に応じてさらに界面活性剤及び安定剤が含まれていて
もよい。適切には、微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比は、３：１より大きく
、好ましくは５：１以上である。
本発明の方法は、生物学的細胞が分析されているいくつかの用途に有用である。一例は
、タンパク質発現又は特定の遺伝形質等の望ましい特性について細胞の個々のクローンコ
ピーをスクリーニングする目的で、不死化された哺乳動物細胞の培養物を微小液滴内で増
殖させている場合である。したがって、本発明の第２の態様では、１つの実施形態におい
て、４フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有し、水性緩衝液を含
む微小液滴内に含まれる１つ又は複数の細胞型の細胞増殖を引き起こす方法であり、液滴
内の細胞を適切な環境条件でインキュベートし、その後、各液滴内の細胞数を検出するス
テップを含み、微小液滴が、微小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大４
フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む非混和性の担体液に懸濁されていることを
特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：
１より大きい方法が提供される。
別の実施形態では、検討中の細胞の１つ又は複数の表現型形質、遺伝形質、又はタンパ
ク質発現プロファイルを検出する方法であり、細胞は、４フェムトリットルから１０ナノ
リットルの範囲の平均体積を有し、水性増殖培地を含む微小液滴内に含まれており、細胞
に由来する標的を蛍光プローブで標識し、その後、プローブからの出力を検出するステッ
プを含み、細胞含有微小液滴が、微小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有し、最
大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む非混和性の担体液に懸濁されているこ
とを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が
２：１より大きい方法も提供される。この目的に適した蛍光プローブ分子はよく知られて
おり、標的タンパク質の存在下で分解される蛍光標識抗体、ＦＲＥＴレポータープローブ
、及び酵素標識抗原が挙げられる。
別の実施形態では、４フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有し
、さらに水性緩衝液を含む微小液滴内に含まれる生物学的細胞に由来するオリゴヌクレオ
チドを分析する方法であり、オリゴヌクレオチドを蛍光ハイブリダイゼーションプローブ
で標識し、その後、対応する蛍光を検出するステップを含み、微小液滴が、微小液滴の平
均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに
含む非混和性の担体液に懸濁されていることを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液
滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：１より大きい方法が提供される。
この目的に使用できる蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、当技術分野でよく知ら
れており、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録
商標）プローブ、及びＬＮＡ（登録商標）プローブが挙げられる。これらすべての実施形
態で生じる蛍光を検出するための方法は、当業者によく知られており、例えば、入射電磁
放射線源（レーザー、ＬＥＤ等）、及び蛍光光子を検出するための対応する光検出器を使
用し、マイクロプロセッサアルゴリズムを用いて分析することができるデータストリーム
を出力する方法がある。
したがって、これらの方法における標的は、細胞自体、それに由来する１つ又は複数の
オリゴヌクレオチド、又は微小液滴自体の中で培養されたときに細胞によって発現される
タンパク質等の産物であってもよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、溶解によって細
胞から生成されてもよい。
本発明の方法はまた、非細胞性又は無細胞性である生物学的成分に関連して適切に使用
され得るが、１つの実施形態において、以前に生物学的細胞に由来していた核酸又はその
成分を操作するために使用されてもよい。したがって、本発明の第３の態様では、０．５
フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有する微小液滴の内容物のサ
イズ及び／又は反応性を操作する方法であり、微小液滴は、少なくとも１つの生物学的成
分と、１未満の水分活性ａｗ１を有する生物学的細胞を含まない第１の水性媒体とを含み
、微小液滴を、第２の水性を含み、微小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有し、
最大０．５フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む水非混和性の担体液中に維持す
るステップを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体
積の比が２：１より大きい方法が提供される。
本発明の第３の態様の方法は、生物学的成分が単一ヌクレオチド、例えば、単一ヌクレ
オシド三リン酸又は単一ヌクレオシド一リン酸である多くの用途に有用である。例えば、
この方法は、我々が以前に記載した配列決定方法の１つ、例えば、これらに限定されない
が、欧州特許出願公開第３０１３９８７号明細書又は読者が向けられる他の上記の特許出
願に記載されたもの等の１つとともに有利に使用され得る。したがって、第３の態様では
、核酸分析物をヌクレオシド三リン酸分子の秩序ある流れに加ピロリン酸分解によって次
第に消化し、そこから、０．５フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積
を有し、ヌクレオシド三リン酸分子の１つと水性緩衝液とを各々含む微小液滴の対応する
秩序ある流れを生成するステップと、各微小液滴内の各ヌクレオシド三リン酸分子と核酸
塩基に特異的な蛍光プローブとを反応させ、その後、各微小液滴に関連する対応する蛍光
を検出し、それにより核酸塩基を同定するステップとを含み、微小液滴が、微小液滴の平
均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大０．５フェムトリットルまでの二次液滴をさ
らに含む非混和性の担体液中に懸濁されていることを特徴とし、全体の単位体積あたりの
微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：１より大きい方法が提供される。
この用途での使用に適した蛍光プローブは、我々の以前の特許出願、例えば、国際公開
第２０１６／０１２７８９号及び読者が向けられるその後公開された出願において説明さ
れている。これらのプローブは、（ａ）未使用の状態では非蛍光性であること、及び（ｂ
）単一ヌクレオシド一リン酸に結合した検出可能な状態のフルオロフォアを生成するため
に一度使用されると、エキソヌクレオリシスを受けることができることを特徴とする。生
じる蛍光は、上記のように検出及び分析することができる。
本発明のこれらすべてのさらなる態様において、微小液滴及び二次液滴にそれぞれ関連
する第１及び第２の水性媒体の水分活性の比は、０．９：１～１：０．９、好ましくは０
．９５：１～１：０．９５の範囲にあり、例えば、１：１であることが好ましい。
上記のように担体相を水和することの有利な効果は、以下の実施例により示される。
実施例１（細胞増殖）
フッ化水素エーテル連続相９９部とフッ素化界面活性剤１部とを混合することにより連
続油相材料を調製する。等容量の油／界面活性剤混合物と少量のＲＰＭＩ １６４０培地
（サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）とを混合し、混合物を３７℃で２４
時間撹拌して多分散エマルジョンを形成することにより、増殖培地処理担体相を調製する
。次いで、このエマルジョンを静置し、それが自発的に分画して、水性増殖培地の大きな
液滴及び分散していないプラグを含む上相と、溶解した水性培地で今やさらに飽和されて
いる油相中に懸濁された増殖培地の最小の小胞のみを含む下相とを形成するまで放置する
。この下相は、ピペットを用いて容器から取り出し、後で使用するために保管する。
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１ Ｔ細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州、米国）を、
８Ｅ６細胞／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ培地に懸濁する。次に、この培地及び細胞を乳化装置
に流して直径５０μｍの液滴を形成し、細胞を液滴全体に分散させる。エマルジョンの外
側の担体相は、溶液中の液滴を安定化するために１％の適切な界面活性剤と混合されたフ
ッ化水素エーテル油である。このように形成されたエマルジョンは、自発的に分画して、
連続的な油／界面活性剤混合物のカラムの頂部に浮遊する、密に充填された単分散水性液
滴の層を形成する。次に、このエマルジョンを穏やかに混合することによって均一に分散
させ、液滴と担体相とを含む３つのアリコートに分割する。
１つのアリコート（初期の参照）を直ちに血球計算盤フローセルに移し、その中の液滴
を２０倍の拡大光学顕微鏡を用いて検査する。各液滴の細胞占有率を、各液滴内の別個の
細胞の数を数えることによって記録する。空の液滴は無視する。
２つ目のアリコートをもう一度分画させ、ピペットを用いて下方の担体相を除去する。
除去した未処理の担体相を置換するために、等量の前に処理した担体相をサンプルに導入
する。３つ目のアリコートは変化させないままとする。次に、２つ目と３つ目のアリコー
トをいずれも、容器とその周囲との間の気体透過を可能にする部分的に密閉された容器に
移す。両方の容器を、５％のＣＯ２／空気混合物、９５％の湿度、３７°Ｃの設定温度を
含むように設定した環境制御ＣＯ２インキュベーターに配置する。アリコートを２４時間
インキュベートする。
次に、これらのアリコートをインキュベーターから取り出し、参照アリコートと同じ方
法で検査及び分析のために血球計算盤に導入する。その後、インキュベーション後の細胞
集団分布の変化（細胞増殖の特徴）を、異なる油処理間で比較することができる。
図１は、油の水和なしの０時間及び２４時間でのベースライン測定に対して、２４時間
培養後に得られた結果を比較している。ここで、細胞増殖は、複数の細胞を含む液滴の割
合として表される。ベースラインの細胞増殖と比較して、油が細胞培養培地で水和される
と改善されることが分かるであろう。
実施例２（反応性）
９９重量部の軽油と１重量部のペグ化界面活性剤とを混合することにより、連続水和油
相を調製する。油と界面活性剤とを完全に混合するために、油をローテーターに一晩置く
。５部の油と３部の水性水和相とを混合することにより水和油を調製する。水性水和相は
、分散エマルジョン相で使用するのと同じ生理食塩水緩衝液又は水のみのいずれかからな
る。混合物を５０℃で一晩回転させ、その後、７０℃で６０分間回転させる。エマルジョ
ンを１５分間放置する。エマルジョンの上部を分注（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）し、次いで、
アリコートを遠心分離して油の水和レベルを調整する。遠心分離時間が長いほど水和レベ
ルは低くなる。水和レベルを、カールフィッシャー滴定装置を用いて測定する。適正な水
和レベル（通常、５００～１０００ｐｐｍ）に達したら、アリコートの上清をピペットで
新しいチューブに移し、使用するまで凍結する。
８体積部の油（水和又は非水和）と１体積部の分散水相とを混合し、続いてボルテック
スミキサーで５分間混合し、４００ＲＰＭで１分間遠心分離することにより、液滴の多分
散エマルジョンを製造する。混合物の上半分をピペットで新しいチューブに入れ、５秒間
遠心分離する。エマルジョンを、さらなる使用のためにチューブの底からピペットで移す
。
酵素活性の測定のため、上記の分散水相は、欧州特許出願公開第３０１３９８７号明細
書に既に記載及び例示されているように、単一ヌクレオチド検出化学からなる。
蛍光強度の測定のため、エマルジョンを、平均エマルジョン液滴サイズに対応するスペ
ーサーによって分離された２つの透明基板の間に挟む。適切な波長範囲の光で励起すると
、各エマルジョン液滴から放出される蛍光信号が、エマルジョンの明視野画像から収集さ
れる液滴の直径とともに測定される。
図２にヒストグラムとして示されるデータは、水和していない油（「ドライオイル」）
中、水で水和した油（「水のみ」）中、又は液滴の緩衝液濃度の３倍で水和した油（「３
×緩衝液」）中でインキュベートした６μｍ液滴の平均蛍光強度を示す。水和していない
油中でインキュベートした液滴は、これらのサンプルでは約１０００カウントであるバッ
クグラウンドよりは上の非常に低い強度を示す。水で水和した油中でインキュベートした
液滴は、水和していない油中でインキュベートした液滴と比較して、強度の増加を示す。
緩衝液濃度の３倍で水和した油中で液滴をインキュベーションすると、平均強度がさらに
増加することが分かる。これは、両方の油の水和が、これらの液滴における酵素反応性を
維持するために使用できることを示している。
実施例３（液滴サイズ効果）
微小液滴は、例えば、読者が向けられる欧州特許出願公開第３００８２０７号明細書に
既に記載されるように、連続油相に浸漬された基板上に堆積する。
９９重量部のパラフィン油と１重量部のペグ化界面活性剤とを混合することにより、連
続水和油相を調製する。油と界面活性剤とを完全に混合するために、油をローテーターに
一晩置く。５部の油と３部の水性水和相とを混合することにより水和油を調製する。水性
水和相は、４％グリセロールを含む又は含まない水のいずれかからなる。混合物を５０℃
で一晩回転させ、その後、７０℃で６０分間回転させる。エマルジョンを１５分間放置す
る。エマルジョンの上部を分注し、次いで、アリコートを遠心分離して油の水和レベルを
調整する。遠心分離時間が長いほど水和レベルは低くなる。水和レベルを、カールフィッ
シャー滴定装置を用いて測定する。適正な水和レベル（通常、５００～１０００ｐｐｍ）
に達したら、アリコートの上清をピペットで新しいチューブに移し、使用するまで凍結す
る。
分散水相は、４％グリセロールを含む又は含まない水からなる。堆積した液滴を、７０
℃で１１５分間のインキュベーションサイクルにかける。次に、エマルジョンの液滴の直
径を明視野顕微鏡画像から測定し、インキュベーションサイクルの前に測定した直径と比
較して、液滴の収縮又は成長を推測する。
以下に示すデータは、高温インキュベーションステップでの液滴の平均体積の変化を、
それぞれ油の水和物（ｏｉｌ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）中及び液滴中のグリセロールのパー
センテージの関数として示す。参照サンプルにおいて、グリセロールが油の水和物にも液
滴にも存在しない場合、液滴は平均して収縮する。グリセロールを液滴は含むが油の水和
物は含まない場合、液滴へのグリセロールの添加により油中の水分活性が液滴中の水分活
性よりも高くなるため、液滴は参照と比較して成長する。グリセロールが油の水和物には
添加されているが、液滴には添加されていない場合、逆のことが起こる。油と比較して液
滴の水分活性が高いため、液滴は参照と比較して収縮する。これは、特定の含有量の液滴
と油の水和物とを用いて、液滴の収縮及び成長を制御できることを示している。

Claims (17)

  1. 少なくとも１つの生物学的成分と、１未満の水分活性ａｗ１を有する第１の水性媒体と
    を含み、０．５フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有する微小液
    滴を操作する方法であり、前記微小液滴を、第２の水性媒体を含み、前記微小液滴の平均
    体積の２５％未満の平均体積を有し、最大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含
    む水非混和性の担体液中に維持するステップを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液
    滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：１より大きい、方法。
  2. ０．５フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有する微小液滴の内
    容物のサイズ及び／又は化学反応性若しくは酵素反応性を操作する方法であり、前記微小
    液滴は、少なくとも１つの生物学的成分と、１未満の水分活性ａｗ１を有する生物学的細
    胞を含まない第１の水性媒体とを含み、前記微小液滴を、第２の水性媒体を含み、前記微
    小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大０．５フェムトリットルまでの二
    次液滴をさらに含む水非混和性の担体液中に維持するステップを特徴とし、全体の単位体
    積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が２：１より大きい、請求項１
    に記載の方法。
  3. ４フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有する微小液滴における
    化学反応性若しくは酵素反応性及び／又は微小液滴サイズを制御する方法であり、前記微
    小液滴は、少なくとも１つの生物学的細胞と、１未満の水分活性ａｗ１を有する第１の水
    性媒体とを含み、前記微小液滴を、第２の水性を含み、前記微小液滴の平均体積の２５％
    未満の平均体積を有し、最大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む水非混和性
    の担体液中に維持するステップを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積
    に対する担体液の体積の比が２：１より大きい、請求項１に記載の方法。
  4. 前記二次液滴がａｗ１よりも大きい水分活性ａｗ２を有することを特徴とする、請求項
    １～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記二次液滴がａｗ１よりも小さい水分活性ａｗ２を有することを特徴とする、請求項
    １～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記水分活性ａｗ１及びａｗ２が同じであることを特徴とする、請求項１～３のいずれ
    か一項に記載の方法。
  7. ａｗ１及びａｗ２が独立して０．９～１の範囲にあることを特徴とする、請求項１～６
    のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第２の水性媒体のイオン強度が、前記第１の水性媒体のイオン強度の１～５倍の範
    囲にあることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  9. 前記第１の媒体のイオン強度が、前記第２の水性媒体のイオン強度の１～５倍の範囲に
    あることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  10. 前記二次液滴の平均体積が前記微小液滴の平均体積の１０％未満であることを特徴とす
    る、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１及び第２の水性媒体のうちの少なくとも１つがさらにグリセロールを含むこと
    を特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記生物学的成分が、標的核酸に由来する単一ヌクレオシド三リン酸、細胞のＤＮＡ若
    しくはＲＮＡに由来するオリゴヌクレオチド、酵素、又は細胞から選択されることを特徴
    とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 第１及び／又は第２の水性媒体が緩衝液であることを特徴とする、請求項１２に記載の
    方法。
  14. ４フェムトリットルから１０ナノリットルの範囲の平均体積を有し、水性緩衝液を含む
    微小液滴内に含まれる１つ又は複数の細胞型の細胞増殖を引き起こす方法であり、前記液
    滴内の細胞を適切な環境条件でインキュベートし、その後、各液滴内の細胞数を検出する
    ステップを含み、前記微小液滴が、前記微小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有
    し、最大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む非混和性の担体液に懸濁されて
    いることを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積
    の比が２：１より大きい、方法。
  15. 検討中の細胞の１つ又は複数の表現型形質、遺伝形質、又はタンパク質発現プロファイ
    ルを分析又は検出する方法であり、前記細胞は、４フェムトリットルから１０ナノリット
    ルの範囲の平均体積を有し、水性緩衝液を含む微小液滴内に含まれ、前記細胞に由来する
    標的を標識するステップを含み、前記微小液滴が、前記微小液滴の平均体積の２５％未満
    の平均体積を有し、最大４フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む非混和性の担体
    液に懸濁されていることを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対す
    る担体液の体積の比が２：１より大きい、方法。
  16. 配列決定方法であり、核酸分析物をヌクレオシド三リン酸分子の秩序ある流れに加ピロ
    リン酸分解によって次第に消化し、そこから、０．５フェムトリットルから１０ナノリッ
    トルの範囲の平均体積を有し、前記ヌクレオシド三リン酸分子の１つと水性緩衝液とを各
    々含む微小液滴の対応する秩序ある流れを生成するステップと、各微小液滴内の各ヌクレ
    オシド三リン酸分子と核酸塩基に特異的な蛍光プローブとを反応させ、その後、各微小液
    滴に関連する対応する蛍光を検出し、それにより前記核酸塩基を同定するステップとを含
    み、前記微小液滴が、前記微小液滴の平均体積の２５％未満の平均体積を有し、最大０．
    ５フェムトリットルまでの二次液滴をさらに含む非混和性の担体液中に懸濁されているこ
    とを特徴とし、全体の単位体積あたりの微小液滴の合計体積に対する担体液の体積の比が
    ２：１より大きい、方法。
  17. 前記微小液滴と前記二次液滴の水分活性の比が０．９：１～１：０．９、好ましくは０
    ．９５：１～１：０．９５の範囲にあることを特徴とする、請求項１４～１６のいずれか
    一項に記載の方法。
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