CN108273454A - 一种小型反应管中纳升级微液滴融合的方法 - Google Patents

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贠娟莉
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    • B01L2400/0409—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces centrifugal forces

Abstract

本发明提供了一种小型反应管中纳升级微液滴融合的方法。该方法的实施在充分消除静电的环境中进行，提供预先添加与微液滴不互溶的油相的小型反应管，在油相中添加适量表面活性剂。小型反应管可接收喷墨技术、流式分选技术、和液滴微流控等技术手段制备的两个或多个纳升体积微滴。利用促进液滴融合的作用力，包括离心力、振动力、电磁场作用力等，使沉降于小型反应管底部的两个或以上的液滴实现接触和融合。本发明提供的微液滴的融合方法的特征在于，通过油相中适量表面活性剂的添加，降低微液滴进入油相的阻力，屏蔽液滴的表面电荷，促进了微液滴的沉降及融合。该方法在微体积生化反应筛选和单细胞分析等应用领域中具有广泛应用前景。

Description

一种小型反应管中纳升级微液滴融合的方法
技术领域
本发明涉及高通量分析筛选和单细胞分析技术领域，特别涉及一种在常规小型反应管中上实现可控的纳升体积混合反应和筛选的方法及其应用。
背景技术
在化学、生物学、药物学、以及临床诊断学领域，溶液分析的微型化和便携化是一个重要趋势(Hong,J.W.and S.R.Quake,Integrated nanoliter systems.NatureBiotechnology,2003.21:1179-1183)。通过微型化和集成化，可以节省珍贵样品和试剂的消耗，缩短反应和混合的时间，提高检测的灵敏、实现便携化和床旁检测、实时快速检测分析。
在众多微型化策略中，微流控芯片技术利用微米尺度的通道网络，可对纳升体积的流体进行分配、混合、反应、孵育等操作，在生命科学和生物工程领域发挥者越来越大的作用。然而，芯片的样品引入和导出存在着宏观和微观接口不兼容的问题(Waldbaur,A.,etal.,Microfluidics on liquid handling stations(μF-on-LHS):an industrycompatible chip interface between microfluidics and automated liquid handlingstations.Lab on a Chip,2013.13：2337)，另外，目前设计的芯片通常用于实现较为单一和固定化的功能，往往无法完成复杂的需要进行条件参数优化的操作。这些因素，导致微流控技术在推出近二十多年以来，在广大生物和化学实验室仍难以普及和推广使用。最近出现的液滴微流控技术(Teh,S.,et al.,Droplet microfluidics.Lab on a Chip,2008.8(2):198-220；Joensson,H.N.and H.Andersson Svahn,Droplet Microfluidics—A Toolfor Single-Cell Analysis.Angewandte Chemie International Edition,2012.51:12176-12192)，利用不相融的油水相在微通道内可实现高通量的大小可控的皮纳升体积液滴的生成、融合、混合、分割、分选等多种操作。微液滴的生成及融合均在微米级的通道中完成，该过程为高通量分选提供了一种新的模式，可实现最高达数千反应每秒的通量。然而，液滴可进行的融合和分割操作自由度有限，单一芯片可实现的筛选的试剂的种类和条件往往受到通道结构的制约，难以成为一种通用的高通量分选方法。
流式细胞仪是一种强大的单细胞分选装置。通过流式细胞仪，可以将单细胞分选到96孔或384孔板上，进行单细胞培养、酶活性检测、单细胞测序等研究。这些研究对于生命科学和临床医学都具有重大意义。通过流式细胞仪分选的单细胞通常包裹在皮升至纳升体积的液滴中，通过电场偏转作用落入孔板。按照传统的方法，液滴落入的孔对于液滴本身来说是一个非常大的容器，而液滴最后着陆的位置可能在孔内的位置通常不固定。为保证分选到孔板上的单细胞能够进行反应筛选，通常需要加入几十至几百微升的试剂，以保证细胞和试剂能够混合，这使单细胞在反应体系中的浓度被大大稀释，而可能存在的污染的概率大大增加，难以直接对单细胞进行分析。如何保证流式分选的单细胞反应能够在纳升体积下进行，降低试剂消耗，减少对单细胞的污染，提高单细胞反应分析的灵敏度，是一急需解决的难题。
在多孔板上，可以采用喷墨打印技术或超声液滴激发技术，实现飞升至纳升液滴的生成和转移(Murthy,T.V.,D.Kroncke and P.D.Bonin,Adding Precise NanoliterVolume Capabilities to Liquid-Handling Automation for Compound ScreeningExperimentation.Journal of Laboratory Automation,2011.16:221-228)。这些技术，微量液滴在空气中飞行和落入多孔板之后，都存在着蒸发的问题。同时，不同组分液滴在同一个微孔内的融合依赖于精确的重复定位，大多数现有的商品化仪器为了保证融合的可靠性，及防止蒸发带来的影响，虽然能够操作的体积已经能达到纳升体积，而为了保证反应的稳定性和可靠性，最终反应体系往往需要大量液滴累加到微升体积。我们最近开发了一种基于界面切割的液滴生成方法(Xu,P.；Zheng,X.；Tao,Y.；Du,W.B.,AnalyticalChemistry,2016,88:3171-3177；杜文斌，徐鹏，董立兵，基于微管道的液滴的生成方法。中国专利，申请号：201410655191.5)，在多孔板上预先加载不互溶油相，利用加样微管道插入油相液面下方注射纳升体积液体，在微管道抽出油相液面的过程中，利用油气界面对水相液滴的表面张力，使液滴脱离毛细管，被保留在孔板内。这种新的方法有效保证了液滴的体积精确性，可以任意调节加入液滴的体积。我们前期的发明也披露可以采用离心的方法实现液滴的融合然而，对于以上提到的基于孔板的微量液体处理，当体积降低到纳升级时，液滴的融合的效率会大大降低。我们在测试通过离心对预先加载矿物油的多孔板内的液滴进行融合操作的时候，观察到，在矿物油中，两个5纳升液滴融合的概率下降到<22.4％(n＝288)。流式细胞仪分选的液滴体积仅为2纳升，在飞行进入预先加载矿物油的多孔板时，利用我们开发的高精度液滴移液操作加入30纳升体积的试剂，离心后液滴融合的效率仅为40％左右，无法进行有效的单细胞反应筛选操作。在本发明中，我们通过大量实验摸索，提出了在多孔板中进行纳升体积微液滴可控融合反应的方法，这一发明，为在多孔板上进行微体积反应筛选、酶活分析、蛋白质结晶筛选、单细胞分析、单细胞基因组扩增等提供了可靠的解决方案。
发明内容
现有技术中在小型反应管中，尤其是多孔板内，进行对于纳升体积的微液滴融合的成功率很低，也鲜有相关研究报道。我们的前期研究发现：
微液滴由于表面张力和静电排斥作用力，漂浮于微孔内油相液面，并迁移至与孔壁接触的凹液面处，采用离心力等方法无法使液滴沉降；
两个微液滴沉降在管底部，但是由于多孔板底部的弧度过小，液滴接触但是借助外力实现融合的成功率不高；
其中的一个液滴由于表面吸附作用，固着在管壁上，没有定位在多孔板的底部中心，因而无法与加入的第二个液滴发生接触和融合。
为了克服以上困难，本发明经过大量实验找到了从克服表面张力、静电力等干扰出发，提出在普通多孔板上，实现油相中纳升体积水相微液滴定向融合的方法。本发明所提出的充分消除静电，在油相中添加微量表面活性剂，有效降低了液滴的表面张力，并屏蔽了液滴表面的电荷，避免了静电导致的液滴吸附和排斥，取得了意想不到的促进液滴融合的效果。成功地在纳升体积条件下，实现了单细胞基因组扩增技术等单细胞分析实验。
本发明的目的是提供一种纳升级微液滴在预先加载油相的多孔板中能够有效沉降并实现多个液滴融合的方法，有效降低试剂消耗、避免本底污染、提高反应混合的均一性、提高反应扩增的可靠性和效率。本发明利用油包水微体积(纳升级)单细胞基因组扩增体系，不仅能有效防止微体积试剂易挥发的问题，还能减少扩增过程中与外界环境的接触从而降低外源污染的可能。与传统方法相比，采用本发明所述的方法，使普通多孔板上能够进行的反应体积降低两个数量级，反应的试剂消耗降低2至3个数量级，可进行多步骤的复杂微体积反应，有利于降低成本和推广应用。
如图1所示，本发明的目的是实现纳升液滴在多孔板内的融合，以用于单细胞扩增等反应筛选。纳升体积的液滴可以通过流式细胞分选仪、喷墨打印、液滴微流控芯片等方法生成并转移至多孔板。所添加的含表面活性剂油相起到了防止液滴蒸发、避免液滴在管壁上吸附、保证液滴沉降到管底部中心等关键作用。
本发明提出了一种在小型反应管中，实现纳升体积水相微液滴在不互溶油相保护下可控融合的有效方法，包括：
(1)实验前充分消除实验环境的静电；
(2)向小型反应管加载含油溶性表面活性剂的油相；
(3)向小型反应管的油相内加入纳升体积的水相微液滴；
(4)静置或离心，使液滴沉降于多孔板底部；
(5)重复(3)-(4)步骤，在小型反应管的管内加入第二个乃至更多个水相微液滴；
(6)通过离心机离心等作用力，使沉降于小型反应管底部的两个或以上的液滴实现融合和反应。
进一步地，消除实验环境的静电包括采用仪器接地、静电屏蔽、增加湿度的办法来消除实验环境静电。
进一步地，油相是植物油、矿物油和合成油脂的一种或两种以上复配；植物油包括花生油、菜籽油、葵花籽油、蓖麻油或茶籽油；矿物油包括低沸矿物油或轻质矿物油；合成油包括轻质硅油、二甲基硅油、角鲨烷、异构十六烷烃、棕榈酸异辛酯、棕榈酸异丙酯、辛酸/癸酸三甘油酯、油酸乙酯、硬脂酸十三酯或异硬脂酸异辛酯。
进一步地，油溶性表面活性剂为Span20、Span40、Span60、Span80、Tween85、聚甘油脂肪酸酯、烷基叔胺盐、双硬脂酸乙酯基羟乙基甲基硫酸甲酯铵、三硬脂酸乙酯基羟乙基甲基硫酸甲酯铵、鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷、油酸二乙醇酰胺的一种或多种。
优选的，添加的表面活性剂为EM 90，体积浓度为0.06—0.50％，或为Span80，体积浓度为0.01至0.03％。
优选的，添加的表面活性剂的浓度在此表面活性剂的临界胶束浓度左右，过高或过低都不利于液滴的融合。
进一步地，小型反应管为6、12、24、48、96、384或1536孔的酶标板，PCR板，细胞培养板，或单个、8联、12联的离心管。
优选的，采用96孔或384孔PCR板进行批量微液滴反应实验。
进一步地，所述的小型反应管底部的构型为平底、圆底、U形底或V形底。
进一步地，利用促进液滴融合的作用力包括离心力、振动力和电磁场作用力及其组合。
优选的，含单个细胞的液滴可通过流式细胞仪或微探针加载的方法加入多孔板的油相中，进行微体积单细胞反应分析。
优选的，采用多孔板离心机实现液滴的融合。
附图说明
图1本发明实施例1所述多孔板上纳升液滴融合示意图。
图2本发明实施例1所述矿物油中添加表面活性剂Span 80对液滴融合的影响趋势图。
图3本发明对照例实施例1，多孔板上液滴无法融合反应情况示意图。
图4流式细胞分选的单细胞核酸扩增示意图。
图5在PCR八联管中加入含0.02％(v/v)Span 80的矿物油的微液滴生成图。
图6在PCR八联管中加入不含表面活性剂的矿物油的微液滴生成图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例1采用的小型反应管为96孔PCR板(1)。本实施例考察在矿物油(2)中Span 80表面活性剂的浓度对加入的两个纳升体积液滴融合效率的影响。实验步骤如下：
1)配制含有不同浓度Span 80(0％、0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.06％、0.1％、0.2％、0.5％)的矿物油(2)，加载至96多孔板(1)，加载体积为80微升/孔；
2)按按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，加载5纳升体积的1摩尔/升硫氰化钾(KSCN)溶液微液滴(3)至步骤一所述96孔板；
3)按按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，加载第二个5纳升体积的1摩尔/升氯化铁(FeCl3)溶液微液滴(4)至步骤2所述96孔板；
4)观察并统计离心之前融合效率，如发生融合，则融合液滴(5)显红色。
5)将多孔板放置在多孔板离心机中，2500转/分钟离心2分钟，以期使微液滴(3)和(4)在离心力作用下，促进两个液滴的融合；
6)观察并统计离心之后融合效率，如发生融合，则融合液滴(5)显红色。
如图2所示，为以上实验的融合效率，结果表明，离心可以有效促进液滴的融合。在表面活性剂浓度(v/v)为0.01％、0.02％和0.03％时，离心后融合效率最高，分别为99.2％(n＝288)、97.9％(n＝288)、95.1％(n＝288)。根据文献数据(Zhou H,et al.,AppliedPhysics Letters,2013,103,234102)，Span 80在矿物油中的临界胶束浓度为0.01％(v/v)，在临界胶束浓度时，液滴的表面张力达到最低值，而油相中的胶束尚未形成，液滴融合的阻力较小。随着表面活性剂浓度的增大，溶液中的表面活性剂形成胶束，阻碍液滴在离心力作用下的融合。
对照实施例1
如图3所示，为本发明的对照实施例。在96孔PCR板上，在每个孔内预先加入80微升不含Span 80的纯矿物油。按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，在孔板内顺序加入一个5nL的添加红色色素的液滴，一个5nL添加蓝色色素的液滴。2500转/分钟离心2分钟，观察液滴在多孔板内的位置和融合情况。
如图3A所示，为本发明对照实施例观察到的现象之一。其中一个液滴由于表面张力作用漂浮于油气界面上，离心无法下沉，由于弯曲液面的表面张力具有梯度，液滴最终飘向管壁和溶液的接触位置，符合马兰戈尼效应(Marangoni effect)。经过一段时间之后，漂浮的液滴蒸发无法观察到。
如图3B所示，为本发明对照实施例观察到的现象之二。两个液滴离心均沉降至多孔板底部。然而经过离心之后，液滴无法融合。
如图3C所示，为本发明对照实施例观察到的现象之三。其中一个液滴由于静电吸附作用，吸附于多孔板的管壁上，离心无法下沉。液滴无法实现融合。
统计96孔板上离心后液滴融合的概率，对于顺序加入微孔的两个5纳升液滴，其融合概率仅为22.4％(n＝288)，无法满足实验需要。
实施例2
按照本发明，进行流式细胞仪分选微生物单细胞基因组扩增的操作流程。
如图4所示，根据本发明提供的方法，采用MDA试剂盒(Qiagen REPLI-g SingleCell Kit)和贝克曼公司的Moflo XDP流式细胞分选仪(6)进行微生物单细胞全基因组扩增实验的步骤和条件如下：
1)实验在1000级以上的洁净间进行，使用加湿器增加实验环境湿度至50％，用酒精对实验台面等进行消毒和去静电；
2)配制含有0.02％Span 80的矿物油，用0.22微米的过滤膜过滤灭菌，加载至96孔板的每个孔内，加载体积为80微升；
3)在96孔板的每个孔内，按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，加入一个30纳升体积的细胞裂解液液滴，2500转/分钟离心2分钟，使微液滴沉降至管底；
4)首先把细菌细胞样品稀释到104-105个细胞/毫升左右，加载至流式细胞仪上进行流式细胞分选，根据细胞的荧光、散射光等，分选96个单细胞(7)至96孔板的孔内，2500转/分钟离心2分钟使单细胞微液滴(4)沉降至管底，与预先加入的细胞裂解液液滴融合为液滴(5)。分选的单细胞液滴(4)的体积约2纳升。
5)将96孔板放入65℃金属浴中，热裂解10min。
6)用步骤3所述的方法，向96孔板每孔中加入30纳升终止液，待液滴沉入底部后，贴膜离心(2500rpm，30s)，与含裂解细胞后液滴融合，放冰上短时间保存。
7)用步骤3所述的方法，向96孔板每孔中加入300纳升扩增液，待液滴沉入底部后，2500rpm离心30s，使液滴融合，放入RT-PCR仪(ABI 7500)前，30℃恒温扩增10h，每10min采集荧光信号，4℃保存。
8)反应结束后的96孔板贴多孔板封口膜，做好标记，4℃冰箱短期保存，长期保存需要放入-20℃冰箱。
按照以上步骤，我们对大肠杆菌K12标准株进行了单细胞扩增和测序，测序与试剂盒推荐的50微升反应体系相比，我们的反应体积仅为362纳升，使单细胞扩增成本降低至原来的百分之一。对大肠杆菌K12的序列特异性达到99.77％，全基因组覆盖度达到96％，超过了目前文献报道的60-80％覆盖度的平均水平。
实施例3
如图5所示，在PCR八联管中加入含0.02％(v/v)Span 80的矿物油，并按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，连续不断地在管中加注5纳升的液滴，所加注的液滴能够缓慢垂直下沉至管底部。这一实验表明，通过表面活性剂的添加，表明活性剂的疏水基团有效屏蔽了液滴的静电荷，避免了液滴的静电吸附和排斥，保障了后续进行离心混合的有效性。
对照实施例2
如图6所示，在PCR八联管中加入不含表面活性剂的矿物油，并按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，连续不断地在管中加注5纳升的液滴。液滴从毛细管口生成后，迅速向管壁运动并吸附。分析其原因，可能是由于液滴本身携带微量静电荷，由于静电作用，被管壁上所带的相反的微量静电荷所吸引，吸附而不能沉降。被管壁吸附的现象和PCR管本身可能随机携带的微量静电，以及液滴随机携带的静电有关系，因此带来了液滴融合过程的不确定性，大大降低了融合成功率。

Claims (9)

1.一种小型反应管中纳升级微液滴融合的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)实验在充分消除静电的环境中进行；
(2)向小型反应管加载含表面活性剂的油相；
(3)向小型反应管油相内加入纳升体积的水相微液滴；
(4)静置或离心，使液滴沉降于小型反应管底部；
(5)重复(3)-(4)步骤，在小型反应管的管内加入第二个乃至更多个水相微液滴；
(6)利用促进液滴融合的作用力，使沉降于小型反应管底部的两个或以上的液滴实现接触和融合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的油相包括植物油、矿物油和合成油的一种或两种以上复配；
所述的植物油包括花生油、菜籽油、葵花籽油、蓖麻油或茶籽油；
所述的矿物油包括低沸矿物油或轻质矿物油；
所述的合成油包括轻质硅油、二甲基硅油、角鲨烷、异构十六烷烃、棕榈酸异辛酯、棕榈酸异丙酯、辛酸/癸酸三甘油酯、油酸乙酯、硬脂酸十三酯或异硬脂酸异辛酯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小型反应管包括单个、8联或12联的离心管，或6、12、24、48、96、384或1536孔的酶标板、PCR板或细胞培养板。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小型反应管底部的构型为平底、圆底、U形底或V形底。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的油溶性表面活性剂包括Span20、Span40、Span60、Span80、Tween85、聚甘油脂肪酸酯、烷基叔胺盐、双硬脂酸乙酯基羟乙基甲基硫酸甲酯铵、三硬脂酸乙酯基羟乙基甲基硫酸甲酯铵、鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷、油酸二乙醇酰胺的一种或多种。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的油溶性表面活性剂的最佳浓度为该表面活性剂在所述油相中的临界胶束浓度附近。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的消除实验环境的静电，包括仪器接地、静电屏蔽、增加实验室湿度及其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用促进液滴融合的作用力包括离心力、振动力、电磁场作用力及其组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促进液滴融合的作用力为离心机所提供的离心力。
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