CN110226089B - 用于复杂样品处理的自动化现场测试装置及其使用方法 - Google Patents

用于复杂样品处理的自动化现场测试装置及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于通过多个样品制备和测定步骤简单、低功率、自动化处理生物样品的方法和装置。所描述的方法和装置有助于在无设备、非实验室环境中现场实施复杂的诊断测定。本发明包括微流体装置，其包括试剂分配单元、样品提取装置和样本处理单元。

Description

用于复杂样品处理的自动化现场测试装置及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月01日提交的美国临时专利申请No.62/428,976的优先权；其全部内容通过引用整体并入本文。
背景技术
现场测试(point of care,“POC”)装置允许在患者护理现场进行方便和快速的测试。因此，样品到答案(sample-to-answere)和芯片实验室(“LOC”)系统(集成微流体技术的POC装置类型)已经变得越来越流行。这些LOC在同一装置上集成了所有各种实验室功能，例如先前手动和/或异地执行的提取、放大、检测、解释和报告功能。由于样品到答案和LOC测试是在患者护理现场而不是在实验室设施中进行的，因此，这些类型的测试在污染控制方面存在问题，特别是过程中涉及人员的相互作用的步骤中。因此，需要在样品到答案LOC内自动化处理样本，以最小化人员交互。这些样品到答案和LOC通常具有几平方毫米到几平方厘米的尺寸，并且通常是微机电系统(“MEMS”)的类型。能够检测和分析诸如此处的生物材料的MEMS通常被称为Bio-MEMS。
根据临床实验室改进修正案(“CLIA”)，市场上的大多数POC诊断装置被分类为高或中等复杂性。这些联邦指南通常适用于人体临床实验室检测仪器，但允许放弃这些指南的某些条件除外。其中一个条件是装置或仪器满足某些风险、错误和复杂性要求。为了使POC诊断测试符合CLIA免除标准，需要尽量减少样品制备和流体处理步骤。使这些步骤最小化的一种方法是将试剂储存在密封装置中(例如泡罩或爆裂囊)以便释放。将试剂递送到微流体芯片中通常包括使用泵(例如注射泵或蠕动泵)以及外部试剂填充的瓶子、注射器或贮存器。这些系统不仅难以制成便携式，而且由于必须集成在一起的众多部件以及对微流体芯片的无泄漏流体界面的需要而是复杂的。实现流体处理的简单、小型化和低功率自动化的方法尚未在商业现有技术中成功实施。因此，这被视为在大多数临床设施中仍在进行的大多数多步骤生物测定测试中阻止POC实施的障碍。
需要多个处理步骤的复杂生物测定，包括但不限于移液、加热、冷却、混合、洗涤、培养、标记、结合和洗脱，依靠昂贵的实验室自动化设备来运行样品到答案序列。用于样品到答案序列自动化的低成本、低功耗、小型化仪器尚未实现，因此，用于运行样品到答案序列的现场测试微流体装置依赖于采用独立台式或便携式仪器的形式的额外的仪器，以在微流体装置上运行测定。实施可以使微流体盒上的样品处理步骤自动化的单独仪器被视为保持每次测试的低成本以及因此盒的低成本的方式。在为现场测试应用开发的系统中，这可以采用便携式台式仪器的形式，其具有螺线管柱塞、线性致动器、微控制器和电子电路，以自动化样品处理序列。虽然该仪器使用户能够控制样品处理序列，但它需要受控环境和大量电力才能运行。这些现场测试系统在没有基础设施运行仪器的低资源环境中不可行，或者在家庭和非医院环境中不可行，在家庭和非医院环境中，外行人不需要或者无力购买昂贵的测试仪器或者没有经过培训来操作与测试一起进行的仪器。因此，开发可以直接集成到微流体装置上并且可以运行自动化样品到答案序列的低功率、独立、廉价和一次性仪器的方法，被视为将可以运行复杂的多步核酸、蛋白质和免疫测定的单次使用测试装置开发为样品到答案方式的障碍。
不需要仪器运行它们的一次性测试仅限于简单单步测定和多步测定。在简单单步测定中，样品是唯一的液体，不使用任何试剂。这些测试通常包括试纸测试，如尿液试纸和妊娠测试。多步测定以包含试剂瓶和指令集的套件的形式出售，其中，依靠使用者遵循说明并将试剂分配到一次性测试盒的不同区域。这些装置通常进行免疫测定，不需要样品制备步骤。这些装置的一些示例包括但不限于Chembio Diagnostic Systems,Inc.的
Figure BDA0002143181570000021
HIV1/2测定，
Figure BDA0002143181570000022
HIV1/2、HIV1/2
Figure BDA0002143181570000024
和HIV1/2
Figure BDA0002143181570000023
DIPSTICK测试。这些测试依赖于用户手动执行一系列步骤来完成序列。如果用户不熟练或者没有正确地遵循说明，则存在不正确地执行测试的风险，因此结果会根据测试的执行方式而变化。此外，当试剂未完全包含在装置内时，存在额外的污染风险。如果没有适当的实验室规程、手套和设备(例如，通风橱和实验室基础设施，如所包含的生物安全设施)，有些苛刻的试剂无法在这些试剂盒测试中实施，除非测试由经过培训的技术人员在包含的设施进行。
如果测试不简单且自动化，则外行人会错误地运行测试。随着测试复杂性增加超过两步或三步，这些手动的基于套件的测试的效用较差。核酸扩增测定(例如，等温测定，如环介导扩增)的进展减少了加热/冷却热循环的仪器负担，因为这些测试仅需要将样品保持在单一温度(通常在60-70℃之间)。但是，这些测试仍需要多个用户启动的步骤来完成样本到答案序列，其需要熟练的操作员或其他自动化仪器。
样品制备对于涉及生物样品处理的许多诊断测定是必不可少的。生物样品在适合用于测定之前通常经历多个复杂的处理步骤。需要这些步骤从原始样品中分离、浓缩和/或纯化目标分析物，并去除样品中可能干扰所需分析的物质。样品处理步骤通常涉及温度、试剂体积和培养时间的精确条件，这些条件需要以精确的顺序和严格控制的环境(例如实验室环境)进行。用于样品处理的常规自动化系统涉及高度复杂和昂贵的仪器以及操作它们的技术人员。由于这些系统通常放置在集中式实验室中，因此必须经常将原始样品妥善存储并转移到不同位置的实验室进行处理。这些因素与若干限制相关，包括高成本，结果延迟以及由于运输和不适当的存储导致的样品完整性受损。
2016年07月25日提交的国际专利申请PCT/US16/43911涉及包括使用线性或旋转运动的磁性和机械致动元件的样品处理装置及其使用方法。2016年7月25日提交的国际专利申请PCT/US16/43855涉及样品提取装置及其使用方法。这两个申请的全部内容通过引用整体并入本文。
本发明提供了用于通过多个样品制备和测定步骤简单、低功率、自动化处理生物样品的方法和装置。所描述的方法和装置有助于在无设备、非实验室环境中进行复杂诊断测定的现场实施。
发明内容
根据本发明，公开了样品提取装置的各种实施例及其使用方法。
根据本发明，公开了样品到答案的微流体装置，测定自动化仪器和用于在微流体装置上进行自动化测定(例如，核酸扩增测试NAAT)的方法。本发明包括便携式测定自动化仪器和微流体盒，其包含液体和干燥形式的储存试剂，储存试剂以预定顺序分配以执行样品到答案的NAAT。
本公开还包括样品处理装置和相关处理方法的各种实施例，用于在将样品从样品收集装置(例如，拭子)转移到流体装置上的介质或缓冲液中，以及将样品整合到流体装置上的介质或缓冲液中时，最大化样品洗脱效率。
已经在上文陈述了本公开主题的某些方面，其全部或部分地由本发明公开的主题解决，当结合如在下面最佳描述的所附实施例和附图进行描述时，其他方面将变得明显。
附图说明
已经一般性地描述了本发明公开的主题，现在将参考附图，附图不一定按比例绘制。
图1A是示例性填充试剂囊的横截面视图。
图1B是具有集成的试剂分配单元(RDU)的示例性微流体装置的横截面视图，其示出了在致动之前的RDU。
图1C是具有集成的试剂分配单元(RDU)的示例性微流体装置的横截面视图，其示出了在致动之后的RDU。
图2A是在致动之前的具有包括柱塞和锁定机构的集成的RDU示例性微流体装置的横截面视图。
图2B是在致动之后的具有包括柱塞和锁定机构的集成的RDU示例性微流体装置的横截面视图。
图3A是用于进行核酸扩增测试(NAAT)的示例性样品到答案微流体盒的透视图。
图3B是包括微流体盒的示意性微流体装置的分解图，微流体盒在顶部致动器元件和底部致动器元件之间旋转。
图4A是微流体装置的俯视示意图，示出了在RDU致动之后微流体盒相对于致动器元件的位置。
图4B是微流体装置的俯视示意图，示出了在基于磁珠的样品制备阶段之前的微流体盒位置。
图4C是微流体装置的俯视图，示出了基于磁珠的样品制备结束时的微流体盒位置，其中珠已被递送到扩增井中。
图5是微流体装置的俯视示意图，示出了在底部致动器元件上的三个不同加热器元件上的扩增井，具有不同温度区域T1、T2和T3，以便通过旋转位置控制促进快速热循环。
图6是微流体装置的俯视图，示出了在顶部致动元件致动尖锐物体之前的瞬间的微流体盒位置，以便于通过横向流动条吸收扩增的产品用于检测。
图7A是用于提取和处理附着在拭子上的原始样品的示例性样品提取装置的示意图；示出了组件中的不同部件。
图7B是用于处理附着在拭子上的原始样品的组装的样品提取装置，示出了拭子在擦洗插入件内部旋转，以便于机械擦洗和挤压拭子头部，以最大化从拭子中洗脱样品。
图8是用于执行示例性样品处理方案的逐步序列的图示，该示例性样品处理方案用于回收附着在拭子上的原始样品并在转移至微流体盒之前从拭子处理洗脱液。
图9是具有旋转致动器元件的示例性样本处理单元的图示，示出了透视图和分解图。
图10示出了当旋转致动器元件相对于样本处理单元中的试剂托盘旋转时操作序列中的瞬间。
图11示出了基于旋转轴的样本处理单元的分解示意图。
图12是示例性试剂囊卡的透视图。
图13是在施加致动力之前和之后的包括试剂卡的示例性微流体装置的横截面示意图，试剂卡包括转移试剂囊和流通试剂囊。
图14是在施加致动力之前(图14A)和在施加致动力之后(图14B)的示例性微流体装置的横截面视图，示出了油/不混溶相分配系统。
图15是具有基于横向流动的读出的、用于核酸扩增测试(NAAT)的示例性样品到答案微流体装置的俯视图和透视图。
具体实施方式
现在将参考附图在下文中更全面地描述当前公开的主题，附图中示出了本公开主题的一些但非全部实施例。相同的数字始终指代相同的元件。当前公开的主题可以以许多不同的形式体现，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施例；相反，提供这些实施例是为了使本公开满足适用的法律要求。实际上，本发明所属领域的技术人员将会想到本文所阐述的本公开主题的许多修改和其他实施例，其具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应理解，当前公开的主题不限于所公开的特定实施例，并且修改和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。
用于复杂样品处理的自动化现场测试装置及其使用方法
本发明涉及用于在集成的样品到答案的微流体装置上进行样品制备、核酸扩增和检测的装置、测定和方法。该测定设计为使最终用户操作简单，只需极少的手动操作时间和设备要求。典型的手动样品制备方案涉及用于进行结合、洗涤和洗脱循环的多次移液/流体转移和滴捕获/重悬浮步骤，以产生纯化的DNA作为最终体积的洗脱液中的最终产物。
无用体积，即保留在试剂囊、流体导管/通道中的体积，可极大地干扰在盒上进行的测定的可重复性和可靠性。特别是在依靠高移液精度来成功执行的分析步骤中；例如扩增步骤，即使系统体积的微小变化也会极大地影响试剂的浓度，从而影响测定的表现，并且，在需要精确控制pH的步骤中，必须具有能够将精确体积的试剂递送到所需反应室的计量系统。尽管可以包括具有用于计量液体试剂的固定容积容量的反应室，使得递送到室的任何过量试剂溢出以废弃，但是这种类型的系统需要精确模制计量室以控制微流体装置上的试剂分配精度。另外，使用计量室的系统可能更容易受到系统中气泡的影响，这可能影响流体分配的可靠性。作为这样的附加去泡机构，可能需要泵和阀，这增加了微流体盒和仪器的复杂性。
本公开描述了一种试剂分配单元(RDU)，其克服了与微流体导管和储存的试剂囊中保留的无用体积相关的问题。该系统有效地递送精确执行基于微流体盒的测定所需的全部水性试剂，因此不需要用于计量精确体积的水性试剂的复杂计量系统。
试剂分配单元包括一个或多个试剂囊，所述试剂囊包括在分开的囊中，或者在单个囊中封装在一起的混溶和不混溶的液体试剂，以及一个或多个柱塞，其压在囊上以使囊上的易碎密封层破裂，并且当对它们施加足够的致动力时，将它们的内容物挤出。在一些实施例中，RDU可包括尖锐物体或突起，当对其施加足够的致动力时，该尖锐物体或突起能够破坏RDU上的易碎密封件。尖锐物体或突起可以存在于囊中或紧邻RDU的易碎密封件，使得当施加致动力时，尖锐物体与易碎密封件接触从而使其破裂。
参考图1，示出了具有集成的试剂分配单元(RDU)101的示例性微流体装置的横截面视图，其示出了填充的试剂囊(1A)、致动之前的RDU(IB)和致动之后的RDU(1C)。
RDU中的试剂囊(图1A)包括在单个试剂囊中的水性试剂103和非水性不混溶试剂102，其用易碎密封层104密封，易碎密封层104在致动时可破裂以使试剂能够递送到微流体装置中。图1B描绘了组装在微流体装置108上的RDU。RDU包括填充的试剂囊和柱塞元件106，其用于挤压试剂囊并用于致动尖锐物体105，尖锐物体105用于使组装在微流体装置上的易碎密封层104破裂。RDU集成到微流体装置108中，使得易碎密封件104存在于进入微流体装置上的流体试剂井109中的进入导管107的界面处。微流体装置包括一个或多个试剂井109和废料井110，废料井110有助于收集溢出试剂井109的过量的不混溶试剂102。
选择不混溶试剂使得当装置运行时，水性试剂最接近易碎密封件和流体井的进入导管之间的界面。在一些实施例中，可以在系统中使用密度小于水性试剂的不混溶流体，例如矿物油等，使得它们在水性试剂的顶部漂浮并形成不混溶层。在其他实施例中，可以使用密度大于水性试剂的不混溶流体，例如氟碳基化合物，如氟化物(3M)，使得密度较小的水性试剂漂浮在不混溶氟化物流体的顶部。选择不混溶的非水性流体使得当装置处于其操作位置时，水性试剂最接近易碎密封件和流体井的进入导管之间的界面。
图1C描绘了组装在微流体装置108上的致动RDU。当致动力施加到装置时，集成的柱塞挤压试剂囊以使易碎密封件104破裂，从而通过入口流体导管107与试剂井109流体连接。参照图1C，最接近入口流体导管107的水性流体103首先流出进入导管并进入流体井；接着是非水性不混溶流体102，其用于有效地推出所有水性试剂，否则，水性试剂将占据流体导管和RDU中的无用体积空间。过量的不混溶非水性流体102从试剂井溢出进入废料井110，在废料井110被收集。该系统可用于在微流体装置上有效地递送精确量的水性试剂，同时通过用非反应性不混溶非水性流体填充空间来消除无用体积问题。非水性不混溶流体102还在流体井中的水性流体顶部形成屏障，且用于防止水性试剂在加热步骤(例如热循环或热培养)期间蒸发。这种类型的系统不需要使用复杂的阀或泵来进行正确操作，从而大大降低了系统的复杂性。另外，由于系统不依赖于反应室的体积来计量精确的体积，因此，不需要通常计量精确体积的试剂所需的精确模制反应室。相反，由于存在非水性不混溶流体，将水性试剂完全推出并占据否则将由水性试剂填充的所有无用空间，使用众所周知的精确移液过程与不混溶非水性流体一起预先填充到RDU中的水性试剂在致动时被完全递送到期望的流体井。分配到系统中的不混溶试剂的体积并不重要，并且不需要精确递送。因此，这种类型的系统的主要优点在于，它不需要对仪器进行精确的致动控制来确保从单剂量试剂包递送水性试剂的多次操作间的可重复性，这是因为，一旦将所有水性试剂填充到装置中，不混溶非水性流体溢出，并通过推出水性试剂且占据所有无用空间来确保水性试剂完全递送到所需的流体井，不混溶非水性从RDU中推出所有水性试剂，并确保在致动期间其成功递送到微流体系统中。
在一些实施例中，RDU可包括锁定机构，其用于将柱塞元件锁定在其下压位置，以防止试剂回流到试剂囊中。该锁定机构不限于销捕捉机构，例如球锁销、铆钉、倒钩销等。
参考图2A和2B，图中分别示出了在致动之前和之后具有包括柱塞和锁定机构201的集成RDU的示例性微流体装置的横截面视图。柱塞元件202组装在试剂囊204附近。柱塞元件用倒钩销203固定在适当位置，倒钩销203被限制在锁定孔208内并且定向成将柱塞的运动限制在施加致动力期间便于下压囊的方向上。在该示例性实施例中，被限制的倒钩销203仅能够沿着位于微流体装置上的锁定孔208在向下方向上移动。试剂囊包括易碎密封层205，当向柱塞施加足够的致动力时，易碎密封层205破裂，如图2B所示。在致动时，易碎密封件205破裂，并且试剂囊204的内容物通过微流体装置上的入口流体导管206传递到流体井207。倒钩销203向下移动到锁定孔208中并将柱塞锁定在其下压位置，以防止试剂回流到试剂囊中。
本发明的一个方面是一种微流体装置，其包括通过主通道彼此连接的两个或更多个流体井。流体井连接到一个或多个试剂分配单元(RDU)，试剂分配单元包括储存的液体试剂，液体试剂通过易碎密封件与进入流体井的入口分离。试剂囊可以填充有水性流体、非水性不混溶流体或其组合。在致动时，易碎密封件破裂并且试剂分配单元的内容物被转移到流体井。在RDU致动序列结束时，储存的试剂成功地转移到微流体装置上的流体井中。流体井将用它们各自的水性试剂填充，并通过填充有非水性流体的主通道彼此连接。
对于现场测试装置，独立的系统是有利的，因为它们不需要任何复杂的、用户驱动的移液或注射步骤。在一个示例性实施方案中，试剂可以在试剂囊中储存在流体装置上。囊试剂包括但不限于缓冲剂、盐、酸、碱、标签、标记、标记物、水、醇、溶剂、蜡、油、气体、凝胶等。当在囊上施加足够的压力时，它破裂从而将囊的内容物分配到流体导管中，从而引导到其预期的反应井。囊设计有与流体导管入口对准的易碎密封件，使得当囊破裂时，其内容物被迫进入流体导管并填充流体井。
每个流体井的体积设计成使得它可以仅部分地填充有混溶的液体试剂，以便不允许每个流体井中的混溶液体溢出以及通过每个流体井的顶部流体导管彼此混合。含有不混溶液体(如矿物油)的试剂囊连接到主流体导管，使得在致动时：1)含有不混溶液体的试剂囊的内容物被释放以在填充在流体井中的水性试剂上形成不混溶的油相，和2)流体井中的所有混溶液体依次连接以形成流体回路，但是通过油相彼此分开以避免彼此混合。主流体导管进入废料井以收集多余的油。
虽然可以用由油相分离的缓冲液预先填充流体井，密封并储存盒以供以后使用，但是一些试剂(不限于酶、寡聚物、dNTP和缓冲液)在室温下或长时间的液体形式下不稳定，因此需要以冻干形式储存并在使用前水合。另外，将样品引入这种预填充系统存在挑战。所公开的发明提供了一种方法和装置，以解决与微流体装置上的样品处理的样品引入、试剂递送和测定自动化相关的挑战。
现在参考图3A，示出了用于进行核酸扩增测试(NAAT)的示例性样品到答案微流体盒301的透视图。样品到答案微流体盒包括通过主流体通道305彼此连接的一个或多个试剂井309。组装到微流体盒的RDU包括多个试剂囊302，试剂囊302通过易碎密封件与到微流体盒上的流体井309的进入导管分离；以及具有锁定销304的集成柱塞元件303，在致动之后锁定销304将柱塞锁定在其下压位置，以防止试剂回流到试剂囊中。在该实施例中，柱塞元件303设计成在同一瞬间与所有试剂囊接触，以便从单个的致动步骤并行地下压并从试剂囊中释放所有各自的试剂。在其他实施例中，柱塞元件可在其上包括具有不同深度的空间定向突起，以便以优选顺序与期望的试剂囊接触，以便在柱塞被下压时促进试剂按顺序递送到微流体盒中。在致动RDU时，试剂井充满水性试剂，试剂井之间的流体回路通过填充有非水性不混溶流体的主流体通道完成。盒包括废料井306，其收集通过主流体通道305溢出试剂井309的过量不混溶试剂。为了进行NAAT，试剂囊可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、磁珠、洗涤缓冲液、水合缓冲液和不混溶流体，例如矿物油、蜡或基于碳氟的化合物如氟化物。
取决于在微流体装置上自动化进行的测定类型，可以不同地设计试剂和试剂递送顺序。盒还可包括干燥的试剂和冻干试剂，其可在使用期间由样品或分配的缓冲液水合。盒包括样品进入端口，样品通过该样品进入端口被转移到盒中以进行处理。样品进入端口可以包括快速连接配件，例如鲁尔接头311，样品可以通过该快速连接接头注入到盒中。其他实施例可以包括进入端口，可以通过该进入端口将样品移液到盒中。
在一些实施例中，盒在进入端口和盒之间的界面处包括一个或多个滤膜310，使得在样品递送到盒中之前过滤掉来自样品的杂质和抑制剂。可根据所进行的测定类型选择滤膜材料和孔径，滤膜材料不限于硝酸纤维素、尼龙、PTFE、PES、玻璃纤维、PVDF、MCE、聚碳酸酯等。取决于所采用的检测方法的类型，盒可以包括另外的下游分析单元，例如DNA杂交微阵列、蛋白质阵列、横向流动条等。
在一些实施例中，基于荧光、电化学或比色的检测技术可用于检测扩增产物。在图3所示的示例性微流体盒中，使用横向流动条308来进行比色检测，横向流动条308可以通过光学读出器数字地读取或者由最终用户在视觉上读取。横向流动条通过易碎密封层与扩增井分离，该易碎密封层与包含尖锐物体307的囊连接，尖锐物体307在致动时可使易碎密封件破裂以将扩增产物递送到横向流动条308以进行检测。在一些实施例中，扩增井本身可以包含易碎层并且可以在致动时容易地变形，使得易碎密封层破裂并且扩增产物被挤压到横向流动条上。
现在参考图3B，示出了包括微流体盒301的示意性微流体装置的分解图，微流体盒301在顶部致动器元件318和底部致动器元件313之间旋转。
顶部和底部致动器元件分别包括空间定向的磁体317和312，使得在包括在致动器元件之间旋转微流体盒的单个致动步骤中，空间定向的磁体在不同的试剂井之间捕获、重新悬浮和传输磁珠，以便在转移到微流体盒中的样品上进行样品制备序列，例如结合、洗涤、洗脱序列。在图3B所示的示例性实施例中，顶部致动器元件包括突起316，突起316设计成在测定序列中的预定时间与微流体盒接触，并致动存在于其上的囊307中的尖锐物体，以便使易碎密封层破裂并将扩增产物引入横向流动条308。底部致动器元件包括一个或多个空间定向的加热器元件314，其有助于提供稳定的单温热量或热循环，这对于核酸的等温或基于PCR的扩增是必需的。取决于在系统上进行的测定，空间定向的加热器元件314还可以有助于为样品制备步骤或下游后扩增步骤提供热量。在进行热循环的情况下，微流体盒在三个加热器元件之间以循环方式旋转，所述三个加热器元件被设定为恒定的单一温度，使得扩增井与期望的加热器元件接触或紧靠期望的循环时间量。
样品到答案NAAT：本文描述了在微流体测定自动化平台上使用提供旋转运动的单个致动器(例如伺服电动机或步进电动机，卷绕弹簧，手摇曲柄或用户产生的手指致动)的示例性样品到答案NAAT。卷绕弹簧机构提供了使用无电/电池电源自动化测定的能力，这对于低资源设置的应用尤其有利。然而，伺服电动机和步进电动机等电动机价格低廉，可以对系统运行提供更多控制。该系统可以配置成根据测定类型和测定操作序列结合不同的方法和步骤。
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技术(Invitrogen)是一种非常简单有效的纯化核酸的方法。它采用独特的可电离涂层，可电离涂层可以共价固定在固相载体上，如磁性或非磁性珠、膜、甚至塑料管和板。可电离涂层的电荷可通过改变周围缓冲液的pH来切换。在低pH下，表面带正电荷并允许带负电荷的核酸与固相载体结合，同时蛋白质和其他污染物可以容易地被洗掉。在较高的pH下，表面上的电荷被中和，核酸从表面洗脱，而不需要进行耗时的沉淀步骤。独特的优点是电荷切换技术采用水性缓冲液，不需要使用乙醇、离液盐或有机溶剂，这些都可以抑制下游应用，如扩增。
磁珠是用于核酸提取和纯化的非常有效且简单的固相捕获载体。基于磁珠的DNA纯化不依赖于离心机，并且可以容易进行自动化以减少手动操作时间。当需要快速纯化时，它们是首选方法。当考虑半自动或全自动系统时，磁性DNA纯化是对离心机依赖性分离技术的明显改进。当需要快速纯化许多样品时，使用这些系统。涂有可电离(可切换)涂层的磁珠可用于从原始生物样品中快速有效地纯化核酸。本文描述了一种独特的测定自动化平台，其能够以单个旋转运动通过充油的主流体导管跨一系列试剂填充室将磁珠捕获、重新悬浮并传输。使用该平台，可以以两分钟的序列从原始生物样品中提取和纯化核酸。
微流体盒包括试剂囊，试剂囊包括水性试剂，例如结合缓冲液、悬浮的磁珠、洗涤缓冲液、水合缓冲液，以及非水性矿物油作为覆盖层和运输流体。微流体盒还包括干燥的和冻干的试剂，例如存在于各试剂井中的干燥的裂解缓冲试剂和冻干的扩增混合物。当测试准备好运行时，执行以下步骤：
1、将原始生物样品通过样品进入端口移液、滴入或注入盒中。
2、将盒插入到手持式仪器中，手持式仪器包括致动器元件、电动机、电子元件和显示器。
3、关闭仪器盖子并开始测试。
系统操作：该系统可以配置成根据测定类型、生物样品和样品所需的样品处理步骤和测定操作序列结合不同的方法和步骤。作为说明性示例，描述了用于在诸如泌尿生殖器拭子或口腔拭子的拭子样品上执行NAAT的操作序列。拭子递送到缓冲液中以从收集的拭子样品中提取细胞。然后，将样品转移到微流体盒中，在那里使存在于裂解/结合井402中的干燥的裂解缓冲试剂水合。裂解原始样品中的细胞。然后关闭仪器的盖子。在该实施例中，盖子的关闭提供致动力，该致动力使得柱塞303被下压，并且来自储存的试剂囊的试剂被分配到它们各自的井中。在后续操作期间，将结合缓冲液和悬浮液中的磁珠分配到含有原始样品裂解物的裂解/结合井中；将洗涤缓冲液分配到洗涤井403中；将水合缓冲液分配到含有冻干的扩增混合物的扩增井404中，并且分配矿物油以在井上形成连续的覆盖层，填充主流体通道305并完成流体回路。存在于盒上的锁定倒钩销将微流体盒上的柱塞元件保持在其下压位置，以防止回流并防止其阻碍微流体盒在致动器元件之间的平稳旋转。
参考图4A，示出了微流体装置的俯视图，示出了在RDU被致动之后的微流体盒位置。在试剂装载步骤之后，微流体盒开始在顶部和底部致动器元件附近旋转，如图4B所示。当盒旋转时，存在于顶部和底部致动器元件上的空间定向磁体用于捕获、重新悬浮和运输磁珠通过不同的试剂填充井。核酸在结合缓冲液存在下与磁珠结合，其将珠周围的溶液的pH改变为<pH6。然后磁珠由顶部致动器元件上的第一永磁体捕获，并移动通过主通道并递送到第一洗涤井中。主通道包括防止珠在磁场的影响下自由移动并将珠截留在期望的井中的障碍物。已经被截留在油相中洗涤井的顶表面上的珠受到底部致动器元件上的第二永磁体的影响，第二永磁体将它们从油相中拉下到洗涤缓冲试剂的水性相中。珠上的这种牵引磁力有效地将它们重新悬浮在第二井中存在的洗涤缓冲液(pH 7)中。随着微流体盒继续旋转，珠上的这种捕获、传输和重新悬浮的序列继续发生，从样品中存在的蛋白质和抑制剂中有效地纯化核酸。使用所述的测定自动化平台，可以在2分钟内完成从结合到洗脱的整个序列。在样品制备阶段结束时，珠被传输并重新悬浮到包括水合扩增混合物的扩增井404中。扩增混合物的pH为-8.5，中和磁珠上的电荷，从而直接将所有纯化的核酸洗脱到扩增混合物中。图4C描绘了微流体装置的俯视图的示意图，示出了样品制备阶段结束时的盒位置。
在扩增阶段期间，盒旋转到扩增井紧靠致动器元件上的空间定向的加热器元件314的位置。加热器元件用于提供核酸扩增所需的热能。对于需要在单一温度下培养的等温扩增反应，不使用额外的加热器元件，并且单个加热器元件能够传递用于扩增的热能。对于涉及必要热循环的聚合酶链式反应(PCR)的应用，微流体盒在三个加热器元件之间以循环方式旋转，所述三个加热器元件被设定为恒定的单一温度，使得扩增井与期望的加热器元件接触或紧靠期望的循环时间量。
参照图5，示出了微流体装置的俯视示意图(未示出顶部致动器元件)，其中扩增井404位于加热器元件上方，加热器元件在图5A中设置为温度T1；在图5B中设置为T2，在图5C中设置为T3。这说明了如何使用致动器元件上的三个固定加热区并且使用也用于执行整个操作的单个电动机以精确的时序序列切换/致动微流体盒来实现具有快速热循环的样品到答案NAAT。电动机在三个加热区之间来回旋转，从而使扩增室在设定为对应于变性、延伸和退火循环的温度的三个加热区之间循环。这一直持续到预定义的循环次数完成。在一些实施例中，可以仅使用三个加热器元件中的两个来执行快速双温度PCR。在一些实施例中，包括具有集成电阻元件的定制铝块的加热器元件可用作散热器，以促进反应快速冷却至期望的温度。在一些实施例中，取决于在系统上进行的测定，加热器元件还可以有助于为样品制备步骤或下游后扩增步骤(例如微阵列上的DNA杂交)提供热量。
在扩增阶段之后，在集成的横向流动条上以比色法进行扩增产物的检测。横向流动条通过易碎密封层与包含扩增产物的扩增井分离，该易碎密封层与包含尖锐物体307的囊联接，尖锐物体307在致动时可使易碎密封件破裂以将扩增产物递送到横向流动条308以进行检测。在一些实施例中，扩增井本身可以包含易碎层并且可以在致动时容易地变形，使得易碎密封层破裂并且扩增产物被挤压到横向流动条上。
参考图6，示出了微流体装置在其进入横向流动上的检测步骤的位置时的俯视图。A是放大的图像，描绘了突起316接触并使包含尖锐物体307的囊变形以使易碎密封层破裂。顶部致动器元件包括在其上的空间定向的突起316，当微流体盒旋转以与突起接触时，该突起316挤压并使包含尖锐物体307的囊变形。该变形力导致易碎密封层破裂，从而使扩增产品通过横向流动条吸走。
样品收集和提取装置：拭子主要用作生物样品收集装置。虽然诸如COP ANFLOQSwabsTM的拭子被设计成使得整个样品保持靠近表面以进行快速和完全洗脱，但是需要使用物理力来最大化样品到转移介质或缓冲液中的洗脱。通常，在实验室中使用通过在传输介质中剧烈旋转拭子或涡旋进行的手动搅动以最大化样品从拭子到溶液中的洗脱。手动递送拭子，然后移出含有样品的溶液，并根据测定类型进一步处理。
在现场测试(“POC”)和低资源设置中，涡旋样品不是用于在液体介质中洗脱样品的便利方法，并且手动摇动或旋转在不同操作者之间不一致。此外，由于拭子具有吸收性，因此当残留在拭子上时，溶液中的有限量样品会丢失。在分析物以非常低的浓度存在的情况下，由于从拭子洗脱到溶液中的分析物的量不足，这可能导致灵敏度降低。
因此，需要用于样品提取的改进的装置和方法，其可以最小化操作者的不一致性，使用简单，不消耗电力并且不依赖于诸如涡旋器和离心机的实验室设备来工作。
下面公开的发明是可以在现场测试中使用的机制、装置和方法，以替换实验室方案，以便最大化从拭子样品中回收样品。所公开的发明还使用户能够使用简单的用户手动步骤将多种试剂直接递送到样品提取装置中的样品。所公开的发明极大地简化了基于实验室的样品处理方案，并且消除了对执行基于实验室的样品处理方案所需的复杂设备的需要。
参考图7A和7B，图中示出了用于提取和处理附着在拭子上的原始样品的示例性样品提取装置的示意图。在一些实施例中，样品提取装置包括样品收集容器705和样品处理单元707，样品处理单元707可从样品收集容器拆卸。该示例性实施例中的装置用于拭子样品处理，并且包括拭子704，其具有附接到拭子轴703的螺旋顶部盖子702和样品收集容器705。容器包括与拭子的盖子702配合的螺纹706。当拭子插入容器705中时，它与擦洗插入件715、716接触，擦洗插入件715、716包括一个或多个突起713，突起713与拭子头704接触，并在盖子关闭并且拭子在插入件内旋转/转动时擦洗头部。这一擦洗动作用于松脱附着在拭子头部上的样品，从而将其洗脱到容纳在容器内的缓冲液或介质714中。在一些实施例中，擦洗插入件可具有多个小刷毛713，这些小刷毛在空间上定向成当拭子头部在插入件内旋转时与拭子头部接触。在其他实施例中，擦洗插入件可以具有机械元件716，例如脊、O形环等，其可以用于擦洗和挤压在插入件内的拭子头部。螺纹的数量限定了拭子头部704在擦洗插入件内产生的转动或完整旋转的数量，并且可以被优化以最大化从拭子的样品回收。
类似地，可以针对拭子类型优化机械元件的类型和设计，以最大化样品回收。在一些实施例中，容器可包括一个或多个滤膜712，选择滤膜712以从样品中过滤出不需要的杂质、抑制剂。容器包括快速连接连接器711，例如鲁尔连接器，其连接到可拆卸的样品处理单元707。在一些实施例中，可拆卸样品处理单元707可以是注射器，其包括筒和柱塞708以及柱塞末端709。注射器可包括一个或多个带凹槽的凹陷部710，其可包含干燥的存储试剂、液体胶囊或颗粒形式。含有储存试剂的带凹槽的凹陷部可以在空间上定向，使得它们在柱塞末端709被抽出时以顺序方式引入样品中。在一些实施例中，可以反复抽出和推动注射器柱塞，以便使用强制流动来松脱样品收集容器中存在的生物材料。
储存的试剂不限于冷冻干燥或干燥的缓冲液，例如裂解缓冲液、中和缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、pH控制缓冲液、固相捕获载体(如磁珠等)、酶、抗体、适体、缀合物缓冲剂、功能化颗粒(如金纳米颗粒、胶乳颗粒、磁性颗粒等)、化学发光或比色检测试剂。
现在参考图8，示出了用于执行示例性样品处理方案的逐步序列，这一示例性样品处理方案用于在将原始样品转移到微流体盒之前，回收附着到拭子的原始样品。
步骤1-将拭子样品插入容器中，并旋转盖子以关闭。
步骤2-抽出柱塞，从而将洗脱的样品从容器引入注射器筒上的带凹槽的凹陷部中的干燥形式的存储试剂中。
步骤3-将注射器从容器上的快速连接配件上拆下，丢弃带有拭子的容器。
步骤4-将注射器连接到微流体盒上的快速连接样品进入端口，并下压柱塞以将样品转移到微流体盒中。
在示例性实施例中，容器705预先填充有适当的拭子转移介质，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Amies介质等。将拭子插入容器中并将盖子旋转“n”次以关闭，其中，n是由容器上的螺纹706确定的转数。当拭子插入容器中时，它与容器内存在的擦洗插入件上的突起和机械元件接触，使得当拭子在擦洗插入件内旋转时，拭子头部被机械元件擦洗和挤压以便松脱附着到拭子头部的样品，并将其洗脱到容器内所含的溶液/介质中。然后，抽出附接的注射器样品处理单元上的柱塞，由此来自容器的样品通过滤膜过滤以过滤掉杂质和抑制剂并收集在下面的注射器筒中。当抽出注射器柱塞时，样品被引入到以干燥、液体或凝胶形式以顺序方式存在于筒中一种或多种储存试剂。
在用于进行NAAT的示例性实施例中，储存的干燥试剂包括干燥的裂解缓冲液颗粒，当将样品引入其中时其水合并活化，并且液体形式的储存的磁珠重新悬浮在样品处理单元的注射器筒中存在的裂解物中。或者，样品处理单元中储存的试剂可包括裂解缓冲液干燥化试剂和中和缓冲液干燥化试剂，其依次被引入样品中，使得样品中的细胞首先被裂解，然后通过引入第二中和试剂中和裂解物。
然后，在将处理过的内容物转移到微流体盒之前，可以将中和的样品依次引入包括磁珠的第三带凹槽的凹陷部，磁珠也存储在样品处理单元中。或者，微流体盒可以包括已经预加载到其中存在的试剂井中的磁珠，使得当转移到微流体盒中时，中和的样品裂解物被引入磁珠中用于样品纯化。
所描述的样品提取装置可以用于任何生物测定，该生物测定包括涉及需要以预定序列递送至样品的多种试剂的多个步骤，并且，可以基于正在进行的测定来选择和设计试剂和步骤。
虽然本文所述的示出的样品收集容器和附接的样品处理单元用于处理拭子样品，其中样品附着到拭子并且需要洗脱到溶液用于下游处理，但是，容器可以适用于并非收集在拭子上的不同样品类型，包括但不限于生物样品，例如唾液、血液、血浆、血清、尿液、痰液、CSF、组织、粪便，以及植物、食物、土壤、小生物体等。容器中使用的过滤器的类型和储存的缓冲液/介质也可以适用于下游测定以及样品类型。
在示例性实施例中，样品收集容器可用于收集和处理尿液样品。样品收集容器可以包括干燥形式的裂解缓冲试剂，当尿液被引入容器时可以水合和活化，导致样品收集容器中存在的尿液样品发生细胞裂解。样品处理单元可以在其中包括干燥的中和试剂，使得当将裂解物吸入样品处理单元时中和裂解物。可以选择过滤器712，使得其保留抑制剂和蛋白质，并且仅允许纯化的核酸通过。
在一个示例性实施例中，可以使用碱性裂解缓冲液，其将样品pH改变至9-13的范围。然后将pH9-13的样品通过膜过滤器712过滤，过滤器712例如孔径为0.45μm至0.8μm的硝酸纤维素或混合纤维素酯(MCE)膜。由于样品的选定孔径和高碱性pH，样品中存在的蛋白质和抑制剂保留在滤膜后面或与滤膜结合，只有纯化的核酸进入下一阶段进入样品处理单元，在其中纯化的裂解物被存在于其中的中和试剂中和。
样本处理单元：参考图9A和9B，分别示出了示例性样本处理单元的透视图和分解图。样本处理单元包括样本收集容器902和盖致动器903，盖致动器903有助于以预定的精确定时顺序将试剂自动顺序递送到容器902中的样品。图9B是示例性样本处理单元的示意性分解图，示出了作为顺序试剂递送系统的盖致动器903的功能组件。在该示例性实施例中，盖致动器包括独特的试剂分配单元，其包括：试剂托盘905，试剂托盘905包括一个或多个试剂囊904，试剂囊904包括干燥、液体或凝胶形式的储存试剂；一个或多个旋转致动元件907；包括空间定向的机械元件906，包括但不限于突起、阀、脊等，其用于致动试剂囊904，以便当旋转致动器元件907在试剂托盘905附近旋转时，以精确的定时顺序将它们的内容物分配到样本收集容器902中。在一些实施例中，试剂被从试剂分配导管908引导到样本收集容器902中。在一些实施例中，试剂在力或重力下分配到样本收集容器中。在一些实施例中，样本处理单元包括用于提供旋转运动的机构，例如卷绕弹簧、马达等。在一些实施例中，试剂分配单元可以由用户的手指手动致动。
在示例性实施例中，使用卷绕弹簧。卷绕弹簧机构是众所周知的并且通常用作机械定时器装置。众所周知的机械弹簧计时器是厨房煮蛋计时器。这些机构产生恒定的旋转运动直到完全展开。通过适当地选择所使用的弹簧和齿轮机构，可以将卷绕弹簧机构设计成在固定的时间内完全展开。顺序试剂递送可以通过打开致动器的卷绕弹簧机构提供动力，以按照精确的定时顺序将试剂递送到系统。在本发明中，旋转致动元件包括空间定向的机械元件，机械元件沿着旋转致动元件的旋转路径在预定瞬间与试剂托盘上的试剂填充囊干涉，以便使试剂囊变形和挤压，从而在预定义的精确时序中递送试剂。
与使用移液器或滴管的手动试剂递送方案的典型试剂盒相比，这一样本处理单元具有优势，因为它是独立的系统，其将样品处理所需的所有试剂封装在单个单元中，具有简单且包含分配和试剂递送的机制。特别是对于只可以进行CLIA放弃测试(简单易行的测试，不存在产生错误结果的用户产生的错误的风险)的非实验室环境，这种独立的样品处理单元通过消除复杂、耗时的移液步骤，以及使用无需经验丰富的操作员执行的简单且普遍的扭转、滑动或旋转运动使试剂递送成为可能，从而降低了由于用户产生的错误而导致错误结果的风险，并且可以使用单个电动机或自供能卷绕弹簧致动器来自动化以便进一步减少手动操作时间。
参考图10A、10B和10C，示出了当旋转致动器元件907相对于试剂托盘905旋转时操作序列中的实例。图10A示出了在试剂递送已经发生之前旋转致动器元件的位置。在图10B中，旋转致动器元件已移动到其上存在的机械元件906在其路径中与第一试剂囊干涉的位置，从而使其变形并将其内容物挤压通过试剂分配导管908到样本收集容器中。在图10C中，旋转致动器元件已经沿其路径移动到机械元件906与第二试剂囊干涉从而使其变形并将第二试剂囊的内容物挤压到样本收集容器中的位置。
这里图9中描述的示例性实施例利用旋转运动来执行致动步骤。然而，其他实施例可以利用线性运动来完成相同的任务，例如，使用一个或多个线性滑动致动器元件。致动元件可以定向在不同的空间维度中，以便能够顺序地干涉样品处理装置或微流体盒的不同空间尺寸。
参考图11，示出了基于旋转轴的样本处理单元的分解示意图。本发明的这个独特的实施例采用旋转轴致动器元件1103，其为测定自动化提供额外的控制尺寸。旋转轴致动器元件包括一个或多个空间定向的机械元件1102，其与试剂托盘1104上的试剂囊1105干涉，以便以预定的顺序致动它们并分配它们的内容物。
在一些实施例中，检测单元可以集成到样本处理单元中，以便于直接在独立系统中检测分析物，而无需从容器转移到检测单元。该检测单元可以使用比色试剂在视觉上可见，比色试剂根据分析物的存在或不存在而在容器中发生颜色变化，或者使用量油尺或横向流动装置进行免疫色谱检测。在一些实施例中，横向流动装置可以集成在样本收集容器的表面上或样本处理单元的盖子中。
虽然每种试剂可以封装在它们各自的试剂囊中并组装在微流体盒上，但是该方法导致更复杂的组装过程，其中每个试剂囊需要单独组装并密封到盒上。在一些实施例中，优选产生包括多个试剂囊的试剂卡，其可以作为单个单元组装在微流体盒上。参考图12，描绘了示例性试剂卡1201的透视图，其示出了各个试剂囊1202和流通试剂囊1203的流动。试剂卡可以设计成在组装期间容易与盒上的配合凹槽配合和对齐的形状。试剂卡可以手动填充或使用定制夹具中的多个自动移液器填充，以在易碎箔密封之前将所需的流体体积分配到每个试剂囊中。在一些实施例中，除了囊之外，试剂卡可以包括模制特征，以帮助将试剂囊卡放置和对准微流体盒。当致动力单独地以顺序方式或与卡上的多个试剂囊并行地施加到试剂囊上时，底部上的易碎箔密封破裂并允许试剂流过流体通道进入流体盒中适当的反应室中。致动力可以通过包括空间定向突起的柱塞分配到试剂卡，所述突起在致动期间顺序地与一个或多个试剂囊接触。
在一些实施例中，可能需要将试剂囊中存在的一种或多种试剂彼此混合或组合。施加外部能量以搅拌流体的有源混合器或通过使用特殊设计的几何形状和通道配置来增加待混合流体的接触面积和接触时间的无源混合器过去已经用于在微流体装置上混合。在一些实施例中，可能需要混合两种或更多种试剂，其中至少一种试剂为固体形式或包括在低粘度或高粘度液体介质中的固体颗粒或者是高粘性液体或凝胶。在微流体盒中，固体试剂通常通过直接在反应室中干燥而储存，然后在使用期间用液体试剂重构固体试剂，该液体试剂可以是重构缓冲液或甚至是正在分析的原始或处理过的液体样品。用已知体积的重构液体将这些干燥的试剂调至所需浓度。在某些情况下，希望干燥或冻干试剂并将它们直接储存在微流体装置的反应室中。例如，用于核酸扩增测试(NAAT)的冻干主混合物不需要冷藏并且使微流体盒能够在室温下储存。在其他情况下，干燥过程会对试剂产生负面影响，导致其功效降低或永久性破坏。例如，由Thermofisher Scientific(Carlsbad CA)提供的用于核酸样品制备的电荷切换磁珠一旦变干就变得无效并且需要始终保持在溶液中。一些磁珠包括功能性涂层，例如来自Promega的
Figure BDA0002143181570000191
DNA提取试剂盒的纤维素涂覆的磁珠，其在干燥时不可逆地聚集并变得无效。因此，将珠储存在其液体基质中以保持其功能是很重要的。虽然有可能使用定制化学品开发定制干燥工艺，有助于保留珠上的功能性涂层，但开发定制工艺通常很昂贵，需要进行大量测试以确保功能不会丢失。因此，优选将诸如磁珠的官能化颗粒储存在其液体基质中。然而，液体形式的磁珠的片上存储具有其自身的一系列挑战。具体地，磁性颗粒以非常高的浓度储存在液体基质中(通常为5mg/ml至50mg/ml)，然后用样品和缓冲液稀释以满足结合容量要求。制造商提供的方案需要非常小体积的磁珠试剂，由于制造工艺的限制(50μl最小体积)，每次测试通常需要的10μl至40μl范围内的磁珠试剂难以封装在箔密封试剂囊中而不会遇到明显的无用体积问题。通向反应室的通道或流体导管中的额外无用体积也导致分配期间试剂的显着损失。例如：横截面为750μm×750μm，长度为1英寸的通道具有15μl的无用体积。复杂化该问题，在分配过程中可能多达20％的试剂仍然存在于塌陷的试剂囊中。
甚至20％的浓缩和必需试剂由于它被截留在无用空间中的损失是不期望的。本公开中的发明使用基于流通的方法来促进微流体装置上的试剂的有效转移和混合。流通系统采用流体介质，其是大量存在的液体或气体，用作转移试剂以将存在于流通试剂囊中的试剂有效地转移/置换到微流体装置上的反应室中。这里的转移试剂可以是不混溶流体例如矿物油(液体)或空气(气体)，或混溶液体例如水性缓冲液等。当不混溶液体和气体进入流通试剂囊时，它们有效地将试剂囊的所有内容物置换到微流体装置的反应室中。当诸如缓冲液的混溶流体进入流过室时，它们与流过室中存在的试剂混合，使得进入微流体装置的反应室的内容物是转移试剂囊和流通试剂囊中的试剂的混合物。该方法通过用转移试剂填充试剂囊或微流体装置来抵消无用体积的影响。因为转移试剂的体积对于在流体片的反应室中发生的反应不是必需的或关键的，所以该方法有助于有效地转移存在于流通试剂囊中的试剂，其体积对于测定的正常功能是至关重要的。
或者，转移介质可以是重构缓冲液形式，其将使可能存在于流通试剂囊中的冻干试剂颗粒再水合。在一些实施例中，转移介质可以是正在分析的液体样品。在转移介质与流通试剂囊的内容物的相互作用期间，发生两者的混合。通过增加接触面积和接触时间可以进一步辅助这种混合。许多方法，例如增加通道长度，减小通道横截面，增加阻碍流速的物理屏障，增加流体压力和引起流体流动中的湍流，是可用于促进混合的几种方法。
在一个实施例中，该方法减轻了官能化颗粒如磁珠的损失，并有助于基于流通的混合和均质化颗粒/珠，以促进溶液中存在的分析物与官能化颗粒/珠的结合。
参照图13A，示例性微流体装置的横截面示意图包括试剂卡，该试剂卡包括填充有转移试剂1306的转移试剂囊1303和包括液体介质中的磁珠/颗粒的流通试剂囊1302。转移试剂囊通过微流体装置上的转移流体导管1308连接到流通试剂囊的入口，该转移流体导管1308用易碎密封件1304盖住。流通试剂囊包括破裂元件(球)1305并且通过出口流体导管1309连接到微流体装置上的反应室。当施加致动力时，如图13B所示，破裂元件破坏存在于其下的易碎密封件，从而打开转移试剂进入流通试剂囊并移动其内容物的通路。在一些实施例中，破裂元件可以存在于微流体装置上，而不是存在于流通试剂囊的内部。
示例：制造商提供的方案要求40μl的
Figure BDA0002143181570000211
磁珠和300μl的提供的结合缓冲液添加到600μl的细菌细胞裂解液中。为了在本文所述的自动微流体装置上实施该方案，首先使用分配滴管或注射器将600μl细胞裂解物分配到微流体装置上的反应室中。流通试剂囊将包含40μl磁珠。假设系统中有60μl的总无用体积(即，压碎的流通试剂囊、流体导管和压碎的转移试剂囊中剩余的体积)，转移试剂囊将包含360μl的结合缓冲液以抵消由于无用体积造成的损失。该无用体积特定于微流体装置的设计，并且可以容易地从装置几何形状计算，并且使用实验方法确认。在施加致动力时，易碎密封件破裂，从而允许结合缓冲液进入包括磁珠的流通试剂囊中。当结合缓冲液进入流通试剂囊时，结合缓冲液的湍流开始重新悬浮储存时可能已经沉淀的磁珠。在结合缓冲液中所得的重新悬浮的磁珠然后通过出口流体导管1309进入含有细胞裂解物的反应室，以完成结合方案。该系统避免使用将增加装置的成本和复杂性的诸如计量泵之类的复杂系统。
油/不混溶相分配系统
虽然在一些实施例中，可以使用充油试剂囊来储存油相，油相可以在施加致动力时分配，然而，试剂囊非常难以制造并且在没有无用区的情况下填充和密封。囊中无用空气的典型制造公差可以是总囊体积的10％至20％。特别是对于粘稠的油相试剂，截留的空气可导致油相中出现气泡，这导致再现性问题和磁性颗粒在不混溶油相内或在混溶水相和不混溶油相之间转移的问题。另外，由于在分配期间油相流出试剂囊的流动可能是湍流，这可能导致当油相填充每个反应井和主通道时在微流体装置中形成气穴。虽然存在通过优化通道和井几何形状促进层流以及通过实施内联消泡机制(例如微孔疏水/疏油PTFE膜，选择性地排出截留的空气而液体不会泄漏)来防止系统中形成气泡的变通方法，但此处描述了另一个独特的实施例。在该独特的实施例中，通过利用油相的压头产生平滑的层流。这可以通过优化的通道和井几何形状来补充，以在主通道中产生完美的无气泡油相，而不需要通过使用消泡机构使系统复杂化。基于压头的方法需要通气口以实现流体流动，这可以通过在分配期间使易碎密封件破裂而产生。此外，它不受油相容器内空气的影响，因为空气太轻而不能取代油相。
参照图14，图14A示出了在施加致动力之前的，并且图14B示出了在施加致动力之后的示例性微流体装置，示出了油/不混溶相分配系统1401。基于微流体芯片的油/不混溶相分配系统1401包括储油容器1402，其保持所需体积的油/不混溶或液体试剂1404。油/不混溶相储存容器包括通气导管1403和油/试剂导管1405，其用于将容器1402分别连接到微流体装置上的通气口和反应室。容纳破裂球1408的可变形盖子1407存在于通气端口和油/试剂出口端口处。通气端口1409和油/试剂出口端口1410由易碎密封件1406密封，并通过用作一次性阀的相同易碎密封件与微流体装置分离。在如图14B所示施加致动力时，通气端口和油/试剂出口端口处的可变形盖子被压碎，并使破裂球1408刺穿易碎密封件。这种破裂将通气端口和油/试剂出口端口分别连接到微流体装置上的通气口和微流体装置上的反应室。
参考图15，描绘了用于核酸扩增测试(NAAT)的样品到答案微流体装置的示例性实施例。微流体装置包括试剂卡1201，油分配系统1401和用于检测的横向流动条1505，其组装到微流体芯片上。微流体芯片本身包括通过主通道1503连接在一起的多个反应室1502。入口通道1504将试剂卡上的试剂囊1303连接到各个反应室。仪器盖子上的致动元件包括柱塞，该柱塞具有与各个试剂囊和油分配系统1401上的可变形盖元件1407的空间位置匹配的空间形貌，柱塞用于提供使易碎密封件破裂的致动力。
在典型的操作序列中：
1、将样品注入盒中或通过样品入口分配。
2、将盒插入仪器中并关闭盖子。盖子的关闭提供了致动力以使试剂卡和油分配系统上的易碎密封件破裂。
3、用户通过按下按钮来输入开始命令，以开始基于磁珠的样品处理和扩增序列。
4、测试完成后，结果显示在横向流动条上。
一般定义
尽管本文采用了特定术语，但它们仅用于一般性和描述性意义，而不是用于限制的目的。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用的“核酸”是指包含称为核苷酸的共价连接的亚基的聚合化合物。“核苷酸”是较大核酸分子中的分子或单个单元，其包含与磷酸基团连接的核苷(即，包含与糖连接的嘌呤或嘧啶碱基的化合物，通常是核糖或脱氧核糖)。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核酸分子”在本文中可互换使用，意指磷酸酯聚合形式的核糖核苷(腺苷，鸟苷，尿苷或胞苷；“RNA分子”或简称“RNA”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷，脱氧鸟苷，脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”或简称“DNA”)，或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链或双链形式。
包括任何长度的RNA、DNA或RNA/DNA杂合序列的多核苷酸是可能的。用于本发明的多核苷酸可以是天然存在的，合成的，重组的，离体产生的，或它们的组合，也可以使用本领域已知的任何纯化方法纯化。因此，术语“DNA”包括但不限于基因组DNA，质粒DNA，合成DNA，半合成DNA，互补DNA(“cDNA”；从信使RNA模板合成的DNA)和重组DNA(DNA是人工设计的，因此从其天然核苷酸序列进行了分子生物学操作)。
“扩增”、“核酸扩增”等是指产生核酸模板的多个拷贝(例如模板DNA分子)，或产生与核酸模板互补的多个核酸序列拷贝(例如模板DNA分子)。
在整个说明书中，参考所述装置的部件的相对位置，例如装置内顶部和底部基板的相对位置，使用术语“顶部”、“底部”、“上方”、“下方”和“上”。应当理解，无论装置的空间方向如何，装置都是可用的。
根据长期存在的专利法惯例，术语“一”和“该”在本申请包括权利要求中使用时指的是“一个或多个”。因此，例如，提及“一主题”包括多个主题，除非上下文明显相反(例如，多个主题)，等等。在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”以非排他性的意义使用，除非上下文另有要求。同样地，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中的项目的叙述不排除可以替换或添加到所列项目的其他类似项目。
为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，否则所有表示说明书和权利要求中使用的数量，尺寸，大小，比例，形状，配方，参数，百分比，参数，数量，特性和其他数值的数字，应理解为在所有情况下都用术语“约”进行修饰，即使术语“约”可能没有明确地以值，数量或范围出现。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数不是也不必是精确的，而是可以根据需要，反映公差，转换因子，四舍五入，测量误差等以及本领域技术人员已知的其他因素近似和/或更大或更小，取决于试图通过本发明公开的主题获得的所需性质。例如，当涉及值时，术语“约”可以意味着包括，与指定值存在，在一些实施例中±100％的变化，在一些实施例中±50％的变化，在一些实施例中±20％的变化，在一些实施例中±10％的变化，在一些实施例中±5％的变化，在一些实施例中±1％的变化，在一些实施例中±0.5％的变化，以及在一些实施例中±0.1％的变化，因为这样的变化适合于实施所公开的方法或使用所公开的组合物。
此外，当与一个或多个数字或数值范围结合使用时，术语“约”应理解为指代所有这样的数字，包括范围中的所有数字并通过扩展数值上方和下方的边界来修改该范围。由端点表述的数值范围包括所有数字，例如包括在该范围内的整数，包括其分数(例如，1至5的叙述包括1、2、3、4和5，以及其分数，例如，1.5、2.25、3.75、4.1等)，以及该范围内的任何范围。本说明书中提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献指示了本公开主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利申请，专利和其他参考文献被具体和单独地指出通过引用并入。应当理解，尽管本文提及了许多专利申请，专利和其他参考文献，但这些参考文献并不构成承认任何这些文献构成本领域公知常识的一部分。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。

Claims (18)

1.一种微流体装置，包括试剂分配单元，其中所述试剂分配单元包括：
试剂囊，其包括至少两种试剂和易碎密封层；
至少一个流体井，其包括与所述至少一个流体井流体连通的进入导管；
在易碎密封层和进入导管之间的界面；
至少一个柱塞和至少一个尖锐物体或突起，所述柱塞构造为施加致动力至所述试剂囊和/或所述至少一个尖锐物体或突起，所述尖锐物体或突起构造成当致动力施加到试剂分配单元时使易碎密封层破裂，并且将所述试剂递送到所述微流体装置中；
其中，所述至少两种试剂包括封装在单个试剂囊中的水性试剂和非水性不混溶试剂，并且，所述水性试剂最接近易碎密封层和进入导管之间的界面。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，所述至少一个流体井包括至少一个试剂井和至少一个废料井；
其中，所述进入导管、所述至少一个试剂井和所述至少一个废料井流体连接，使得当致动力施加到试剂分配单元时，所述试剂通过进入导管递送到试剂井中，并且从试剂井溢出的任何过量试剂被收集在废料井中。
3.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，非水性不混溶试剂的密度小于水性试剂，并漂浮在水性试剂的上面，从而在水性试剂的顶部形成不混溶的层。
4.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，水性试剂的密度小于非水性不混溶试剂，并漂浮在非水性不混溶的上面，从而在非水性不混溶的顶部形成水性层。
5.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，当致动力施加到试剂分配单元时，水性试剂首先从进入导管流出并进入试剂井，非水性不混溶的试剂跟在水性试剂之后。
6.根据权利要求1所述的微流体装置，还包括锁定机构，其构造成将柱塞锁定在下压位置，从而防止试剂回流到试剂囊中。
7.根据权利要求6所述的微流体装置，其中，锁定机构包括在锁定孔内的倒钩销，锁定孔构造成将柱塞的运动限制在施加致动力期间便于下压囊的方向上。
8.根据权利要求1所述的微流体装置，包括两个或更多个试剂井，所述试剂井彼此连接并通过主通道连接到一个或多个试剂分配单元。
9.根据权利要求8所述的微流体装置，其构造成使得，在致动序列结束时，试剂井填充有水性试剂并通过填充有非水性流体的主通道彼此连接。
10.根据权利要求8所述的微流体装置，其构造成使得，在致动序列结束时，在流体井中的水性试剂上形成不混溶的油相，并且流体井中的水性试剂通过油相彼此分离，但按顺序流体连接以形成流体回路。
11.根据权利要求8所述的微流体装置，包括多个试剂囊，试剂囊通过易碎密封件与到流体井的进入导管分离，以及具有锁定销的集成柱塞元件，在致动之后锁定销将柱塞锁定在其下压位置，以防止试剂回流到试剂囊中。
12.根据权利要求11所述的微流体装置，其中，柱塞构造成在同一瞬间与所有试剂囊接触，以便从单个致动步骤并行地下压，并释放从试剂囊中的所有试剂。
13.根据权利要求11所述的微流体装置，其中，柱塞包括具有不同深度的空间定向突起，以便以优选顺序与期望的试剂囊接触，以便在柱塞被下压时将试剂顺序地递送到微流体装置中。
14.根据权利要求1所述的微流体装置，还包括样品进入端口，样品能通过所述样品进入端口注入微流体装置中。
15.根据权利要求14所述的微流体装置，其中，样品进入端口还包括一个或多个滤膜。
16.根据权利要求1所述的微流体装置，进一步包括微流体盒，其构造成在顶部致动器元件和底部致动器元件之间旋转，其中，顶部和底部致动器元件包括空间定向的磁体，使得在包括在顶部和底部致动器元件之间旋转微流体盒的单个致动步骤中，空间定向的磁体在不同的试剂井之间捕获、重新悬浮和传输磁珠。
17.根据权利要求16所述的微流体装置，其中，顶部致动器元件包括突起，所述突起构造成在测定序列中的预定时间与微流体盒接触，并致动试剂囊中的尖锐物体或突起，以使易碎密封层破裂并将扩增产物递送到横向流动条，并且，底部致动器元件包括一个或多个空间定向的加热器元件，其构造成提供稳定的单温加热或热循环，用于等温或基于聚合酶链反应(PCR)的核酸扩增。
18.根据权利要求17所述的微流体装置，其中，空间定向的加热器元件构造成提供热循环，其中，微流体盒在多个加热器元件之间以循环方式旋转，每个加热器元件设定为恒定的单一温度，由此扩增井接触或紧靠期望的加热器元件持续期望的循环时间。
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