KR20210126060A - 미세액적 조작 방법 - Google Patents

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Abstract

평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 적어도 하나의 생물학적 성분과 수분활성도 aw1이 1보다 작은 제1 수성매질을 포함하는 미세액적의 조작 방법이 제공된다. 이는 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이며 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 수성매질을 포함하는 제2 액적을 추가로 포함하는, 물과 비혼화성인 분산매에 미세액적을 유지시키는 단계를 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 크다. 상기 방법은 예를 들어 생물학적 세포를 함유하는 미세액적이나 액적 기반 핵산 시퀀서에서 제조되는 것과 같은 단일 뉴클레오사이드 인산을 포함하는 미세액적과 함께 사용될 수 있다. 이 방법은 예를 들어, 미세액적 또는 단일 뉴클레오사이드 핵산 시퀀싱에서 세포, 화학적 또는 효소적 과정 및/또는 미세액적의 크기를 제어하는 데 적합하다.

Description

미세액적 조작 방법
본 발명은 오일과 같은 비혼화성 분산매에서, 생물학적 세포를 선택적으로 포함하는 수성 미세액적을 조작하는 개선된 방법에 관한 것이다. 이는 미세액적의 크기를 제어 또는 조정하고, 그 안에서 발생하는 모든 효소 또는 화학 반응을 소정 기간 동안 유지하거나 최적화할 수 있도록 한다.
우리의 이전 특허출원, 예를 들어 WO2014167323, WO2015121675, WO2016012789, WO2017140839 및 PCT/EP2018/066574에서, 본 발명자들은 DNA 및 RNA 시퀀싱 분석, 세포 및 바이러스의 검출 및 특성 규명 분석을 포함하는 다양한 분석 목적을 위해 세포, 효소, 올리고뉴클레오티드, 심지어는 단일 뉴클레오티드와 같은 생물학적 성분을 조작하는 방법을 기술하였다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 전기습윤 추진력을 사용하거나 분산매로 코팅된 기재 상에 미세액적을 직접 출력함으로써 분석 장치에서 미세유체 경로를 따라 비혼화성 분산매에 분산된 미세액적을 전위시키는 것을 포함한다. 미세액적의 부피 분율이 상대적으로 낮은 많은 경우에 이러한 미세액적은 시간이 경과함에 따라 상당히 수축되는 경향이 있어, 때때로 내부에서 진행되는 일부 또는 전체 효소 과정을 방해할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 다른 경우에는 소정의 분석이 수행됨에 따라 장치의 일부에서 미세액적의 크기를 의도적으로 수축시키거나 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 극복하는 미세액적 조작 방법을 개발하였다. 이 방법은 예를 들어, 미세액적 내용물의 크기 및/또는 반응성을 조작하거나 그 안에서 발생하는 화학적 또는 효소적 반응을 제어하는 데 사용할 수 있다. 본 발명은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 적어도 하나의 생물학적 성분과 수분활성도 aw1이 1보다 작은 제1 수성매질을 포함하는 미세액적을 조작(미세액적의 내용물의 크기 및/또는 화학적 조성을 제어)하는 일반적인 방법으로, 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 수성매질을 포함하는 제2 액적을 추가로 포함하며 물과 비혼화성인 분산매에 미세액적을 유지시키는 단계를 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰 미세액적 조작 방법이 제공된다.
본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 미세액적의 전체 특성 또는 이들에게 적용되는 임의의 검출 방법의 효능에 악영향을 미치지 않으면서 미세액적과 상호작용할 수 있는 매우 작은 제2 액적을 함유하는 분산매를 사용함으로써 문제를 해결하고자 하는 것으로 생각된다. 분산매가 오일인 경우 이러한 복합 매질은 때때로 '수화된 오일'로 지칭된다. 이와 관련하여 중요한 특징은 미세액적과 제2 액적의 상대적인 수분활성도가 특정 변수 내에서, 선택적으로는 지속적인 모니터링 및/또는 피드백 루프에 의해 제어된다는 것이다. 여기서, 수성매질의 수분활성도(aw)는 STP 조건의 순수한 물의 부분 증기압에 대한 조사 중인 수성매질의 부분 증기압의 비율로 정의된다. 물은 높은 수분활성도에서 낮은 수분활성도의 구배를 따라 확산되는 경향이 있기 때문에, 시스템의 제약 내에서 제2 수성매질(aw2)의 수분활성도가 제1 수성매질(aw1)의 수분활성도보다 더 높을 때에는, 두 성분의 수분활성도가 같아질 때까지 미세액적이 팽창하는 순 효과가 있음을 확인하였다. 반대로, 제2 수성매질의 수분활성도가 제1 수성매질의 수분활성도보다 높으면 미세액적은 상기 수분활성도가 같아질 때까지 수축하는 경향이 있다. 유용한 일 실시예에서, 제1 및 제2 수성매질의 수분활성도는 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있어, 미세액적이 수축 또는 팽창하는 임의의 경향이 연속적으로 상쇄된다. 따라서 미세액적의 크기는 항상 보존될 수 있다. 또한 상기 수단에 의해, 예를 들면 상기 방법을 사용하는 임의의 장치의 하나 이상의 지점에서 세포-성장 성분을 공급하기 위해 제2 액적을 사용하는 것에 의해, 상기 제2 액적이 미세액적에서 발생하는 효소 또는 화학 반응을 보존하거나 더욱 향상시키는 것을 보조하도록 사용할 수 있음을 확인하였다. 제1 및 제2 수성매질은 일 실시예에서 동일한 조성을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 제1 및 제2 수성매질의 수분활성도는 독립적으로 0.9 내지 1의 범위이다. 다른 실시예에서, 제1 수성매질의 수분활성도는 0.9 내지 1 미만이다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2 수성매질의 수분활성도의 비(awi : aw2)는 0.9:1 내지 1:0.9 범위이다.
조작을 수행하는 한 가지 편리한 방법은 완충액인 제1 및 제2 매질을 사용하는 것이며, 필요한 경우 둘의 상대적 조성을 변경하는 것에 의해 수행된다. 예를 들어, 일 적용예에서 제1 수성매질의 이온 강도는 제2 수성매질의 1 내지 5배, 바람직하게는 3 내지 5배 범위이다. 다른 예에서, 제2 수성매질의 이온 강도는 제1 수성매질의 이온 강도의 1 내지 5, 바람직하게는 3 내지 5배 범위이다. 또 다른 적용에서, 이온 강도는 3:1 내지 1:3 범위의 이온 강도의 비율과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 특히 유용한 일 실시예에서, 제1 및 제2 수성매질 중 하나 또는 둘 모두는 성분으로서 글리세롤을 예를 들어 서로 다른 농도로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 제1 및 제2 수성매질의 pH는 6.5 내지 8의 범위 내에서 동일하거나 유사하다.
제2 액적과 관련하여, 이들의 평균 부피는 미세액적의 평균값보다 훨씬 작으며, 경계에는 펨토-크기의 액적이나, 분산매에서 제2 수성매질이 유화되고 호환되는 계면활성제 분자(예를 들어 비-이온성 계면활성제)의 외피에 의해 안정화된 미셀(micelle)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 제2 액적의 크기는 사용된 미세액적 부피의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만이다. 다른 예에서, 제2 액적의 평균 부피는 미세액적의 평균 부피의 10 내지 1% 범위 내에 있다. 적절하게는 제2 액적은 일 실시예에서는 비혼화성 오일인 분산매에서 안정한 에멀젼의 일부를 형성한다. 적절하게는, 분산매는 미네랄 오일, 실리콘 오일 또는 플루오로카본 오일로부터 선택된다. 오일은 필요하다면 추가적으로 계면활성제와 안정제를 포함할 수도 있다. 적절하게는 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 3:1보다 크며, 바람직하게는 5:1 이상이다.
본 발명의 방법은 생물학적 세포가 분석되는 여러 응용에 유용하다. 일 예는 단백질 발현 또는 특정 유전적 특성과 같은 바람직한 특성에 대해 세포의 개별 클론 사본을 스크리닝할 목적으로 불사화 포유동물 세포의 배양물이 미세액적 내부에서 증식되도록 하는 경우이다. 따라서, 본 발명의 제2 양태에서는, 일 실시예에서 평균 부피가 4 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 수성 완충액을 포함하는 미세액적 내에 함유된 하나 이상의 세포 유형의 세포 증식을 유발하는 방법으로, 적절한 환경 조건에서 액적 내부에서 세포(들)을 배양한 후 각 액적 내부의 세포 수를 검출하는 단계를 포함하며, 미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이며 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰 세포 증식 유발 방법이 제공된다.
다른 실시예에서, 평균 부피가 4 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고 수성 성장 배지를 포함하는 미세액적 내에 함유되어 있는 고려 중인 세포의 하나 이상의 표현형 특성, 유전적 특성 또는 단백질 발현 프로파일을 검출하는 방법으로, 세포(들)로부터 유도된 표적을 형광 프로브로 표지한 후 프로브로부터의 출력을 검출하는 단계를 포함하고, 세포-포함 미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰 검출 방법 또한 제공된다. 이 목적에 적합한 형광 프로브 분자는 공지되어 있으며, 형광 표지된 항체, FRET 리포터 프로브 및 표적 단백질의 존재 하에 분해되는 효소 표지된 항원을 포함한다.
다른 실시예에서, 평균 부피가 4 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고 수성 완충액을 추가로 포함하는 미세액적 내에 함유되어 있는 생물학적 세포 유래의 올리고뉴클레오티드를 분석하는 방법으로, 올리고뉴클레오티드를 형광 혼성화 프로브로 표시한 후 해당 형광을 측정하는 단계를 포함하고, 미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰 방법 또한 제공된다.
본 목적을 위해 사용될 수 있는 형광 혼성화 프로브는 당 업계에 공지되어 있으며, 분자 비콘, TaqMan® 프로브, Scorpion® 프로브 및 LNA® 프로브를 포함한다. 상기 모든 실시예에서 발생하는 형광의 검출 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 입사 전자기파 방사선 소스(레이저, LED 등) 및 형광 광자(photon)를 검출하고 마이크로프로세서 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있는 데이터 스트림을 출력하기 위한 해당 광검출기를 사용할 수 있다.
따라서, 이러한 방법에서 표적은 세포(들) 그 자체, 이로부터 유래된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 미세액적 자체 내에서 배양될 때 세포(들)에 의해 발현되는 단백질과 같은 생성물일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 용해(lysis)에 의해 세포(들)로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 일 실시예에서 생물학적 세포로부터 기존에 유래된 핵산 또는 그의 성분을 조작하는데 사용될 수 있으나, 비-세포(non-cellular) 또는 무-세포(cell-free)인 생물학적 성분과 관련하여 역시 적절하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제3 양태에서는, 평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터 범위인 미세액적의 내용물의 크기 및/또는 반응성을 조작하는 방법이 제공된다; 미세액적은 적어도 하나의 생물학적 성분과 수분활성도 aw1이 1보다 작고 생물학적 세포를 포함하지 않는 제1 수성매질을 포함하고, 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 0.5 펨토리터에 달하는 제2 수성매질을 포함하는 제2 액적을 추가로 포함하는 물과 비혼화성인 분산매에 미세액적을 유지시키는 단계를 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 크다.
본 발명의 제3 양태의 방법은 생물학적 성분이 단일 뉴클레오티드인 다수의 적용에 유용하다; 예를 들어, 이 방법은 종래 본 발명자들이 EP3013987 또는 상기 언급된 다른 특허출원에서 설명한 시퀀싱 방법의 하나에 유리하게 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서 제3 양태에서, 핵산 검체를 열인산화(pyrophosphorolysis)에 의해 뉴클레오사이드 삼인산 분자의 정렬된 스트림으로 점진적으로 분해하고, 그로부터 평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터이고 각각은 뉴클레오사이드 삼인산 분자 중 하나와 수성 완충액을 포함하는 해당 미세액적의 정렬된 스트림을 생성하는 단계를 포함하는 시퀀싱 방법이 제공된다; 각 미세액적 내의 각 뉴클레오시드 삼인산 분자를 핵염기-특이적 형광 프로브와 반응시킨 후, 각 미세액적과 관련된 해당 형광을 검출함으로써 핵염기를 식별하며, 미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 0.5 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며, 이때 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 크다.
본 발명에 사용하기에 적합한 형광 프로브는 본 발명자들의 이전 특허 출원, 예를 들어, WO2016012789 및 후속의 공개된 출원에 설명되어 있다. 이러한 프로브는 (a) 사용되지 않는 상태에서는 형광을 나타내지 않고 (b) 단일 뉴클레오사이드 일인산에 부착된 검출 가능한 상태에서 형광단을 생성하는 데 사용되면 외향핵분해(exonucleolysis)가 진행될 수 있다는 특징이 있다. 발생하는 형광은 전술한 바와 같이 검출 및 분석될 수 있다.
본 발명의 이러한 모든 부가적 양태에서, 미세액적 및 제2 액적 각각과 관련된 제1 및 제2 수성매질의 수분활성도의 비율은 0.9:1 내지 1:0.9 범위인 것이 바람직하다; 바람직하게는 0.95:1 내지 1:0.95이며, 예를 들어 1:1이다.
전술한 바와 같은 분산 상을 수화시키는 유리한 효과를 하기 실시예에 의해 설명한다.
실시예 1(세포 성장)
오일 연속상 물질은 99부의 하이드로플루오로에테르(hydrofluoroether) 연속상과 1부의 플루오르화 계면활성제를 혼합하여 제조하였다. 성장-배지-처리된 분산상은 RPMI 1640 배지(Thermo Fisher Scientific, UK)의 분취액을 동일한 부피의 오일/계면활성제 혼합물과 혼합하고, 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 교반하여 다분산 에멀젼을 형성하여 제조하였다. 상기 에멀젼은 이후 큰 액적과 수성 성장 배지의 분산되지 않은 플러그를 포함하는 상부 상과, 추가로 용해된 수성 배지로 포화된 오일 상에 현탁되어 있는 성장 배지의 가장 작은 소포만을 포함하는 하부 상을 형성하도록 자발적으로 분별될 때까지 방치하였다. 상기 하부 상은 피펫을 사용하여 용기로부터 제거하고, 추후 사용하기 위해 보관하였다.
Jurkat E6-1 T-세포 림프종 세포(ATCC, Virginia, USA)는 8E6 세포/ml의 농도로 RPMI 배지에 현탁하였다. 이후, 상기 배지와 세포를 유화 장치를 통해 흐르게 하여 액적 전체에 분산된 세포와 함께 직경 50 um의 액적을 형성시켰다. 에멀젼에 대한 외부 분산매는 용액에서 액적을 안정화시키기 위해 1%의 적절한 계면활성제와 혼합한 하이드로플루오로에테르 오일이다. 이렇게 형성된 에멀젼은 자발적으로 분별되어 연속상 오일/계면활성제 혼합물의 컬럼의 상단에 부유하는 조밀하게 패킹된 단분산성 수성 액적 층을 형성한다. 이후 상기 에멀젼을 부드럽게 혼합하여 균일하게 분산시키고, 액적과 분산상을 포함하는 3개의 분취액으로 나누었다.
하나의 분취액(초기 참조)은 즉시 혈구계(haemocytometer) 플로우 셀로 옮기고, 그 안의 액적을 20x 배율 광학 현미경을 사용하여 검사하였다. 각 액적의 세포 점유는 각 액적에 있는 별개의 세포 수를 계수하여 기록하였다. 빈 액적은 무시하였다.
두 번째 분취액을 한 번 더 분별하고, 피펫을 사용하여 아래의 분산상을 제거하였다. 제거된 처리되지 않은 분산상을 대체하기 위하여 동일한 부피의 이전에 처리된 분산상을 시료에 도입하였다. 세 번째 분취액은 변경되지 않은 상태로 남겨놓았다. 이후 두 번째 및 세 번째 분취액 모두를 용기와 주변 환경 간에 가스 투과가 허용되는 부분적으로 밀봉된 용기로 이송하였다. 두 용기 모두는 5% CO2/공기 혼합물을 포함하고, 95% 습도 및 37℃ 설정 온도로 설정된 환경-제어 CO2 배양기에 배치하였다. 분취액은 24시간 동안 배양하였다.
이후 상기 분취액을 배양기에서 제거하고 참조 분취액과 동일한 방식으로 검사 및 분석하기 위하여 혈구계로 도입하였다. 배양 후 세포 집단-분포의 변화(세포 증식 특성)는 다른 오일 처리 간에 비교될 수 있다.
도 1은 수화되지 않은 오일의 0 및 24시간에서의 기준 측정과 비교하여 24시간 배양 후 얻은 결과를 비교한 것이다. 여기서 세포 성장은 하나보다 많은 세포를 포함하는 액적의 비율로 표현된다. 기준 세포 성장에 비해, 오일이 세포 배양 배지로 수화될 때 개선이 발생함을 알 수 있다.
실시예 2(반응성)
수화된 오일 연속상은 99 중량부의 경질 미네랄 오일과 1 중량부의 PEG화된(pegylated) 계면활성제를 혼합하여 제조하였다. 오일은 오일과 계면 활성제를 완전히 혼합시키기 위해 밤새 회전 장치에 놓아두었다. 수화된 오일은 오일 5부와 분산 에멀젼 상에 사용된 동일한 식염수 완충액 또는 물로 구성된 수성 수화상(hydrating phase) 3부를 혼합하여 제조하였다. 혼합물을 50℃에서 밤새 회전시킨 다음, 70℃에서 60분 동안 회전시켰다. 에멀젼은 15분 동안 방치하였다. 에멀젼의 윗 부분을 분취한 다음, 분취액을 오일의 수화 수준을 조정하기 위하여 원심분리하였으며, 원심분리 시간이 길어지면 수화 수준이 낮아진다. 수화 수준은 Karl Fisher 적정기를 사용하여 측정하였다. 통상 500-1000ppm의 적절한 수화 수준에 도달하면, 분취액의 상등액을 새 튜브에 피펫으로 옮기고 사용할 때까지 동결하였다.
액적의 다분산 에멀젼은 8 부피부의 오일(수화되거나 수화되지 않음)과 1 부피부의 수성 분산상을 혼합한 다음, 볼텍스 믹서로 5분간 혼합하고 400RPM에서 1분 동안 원심분리하여 제조하였다. 혼합물의 상부 절반을 새 튜브로 피펫팅한 후 5초 간 원심분리하였다. 에멀젼은 추가 사용을 위해 튜브 바닥에서 피펫팅하였다.
효소 활성의 측정을 위해, 전술한 수성 분산상은 이미 설명되고 EP3013987에서 예시된 바와 같이 단일 뉴클레오티드 검출 화학으로 구성된다.
형광 강도의 측정을 위해, 에멀젼을 평균 에멀젼 액적 크기에 상응하는 스페이서에 의해 분리된 2개의 투명 기판 사이에 끼워넣었다. 적절한 파장 범위의 빛으로 여기됨에 따라 각 에멀젼 액적에서 방출되는 형광 신호는 에멀젼의 명시야 이미지에서 수집된 액적의 직경과 함께 측정하였다.
도 2에서 히스토그램으로 제시된 데이터는 수화되지 않은 오일('Dry oil'), 물로 수화된 오일('Water only') 또는 액적의 완충액의 3배 농도로 수화된 오일('3x buffer')에서 배양된 6 um 액적의 평균 형광 강도를 나타낸다. 수화되지 않은 오일에서 배양된 액적은 이 시료의 경우 약 1000 정도인 배경 상의 매우 낮은 강도를 나태낸다. 물로 수화된 오일에서 배양된 것은 수화되지 않은 오일에서 배양된 액적과 비교하여 증가된 강도를 나타낸다. 액적의 완충액의 3배 농도로 수화된 오일에 액적을 배양하면 평균 강도가 추가로 증가한다. 이는 두 수화된 오일 모두가 상기 액적에서 효소 반응성을 유지하는데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 3(액적 크기 효과)
미세액적은 예를 들어 종래 EP3008207호에 기술된 바와 같이 오일 연속상에 침지된 기재 상에 침착시켰다.
수화된 오일 연속상은 파라핀 오일 99 중량부와 PEG화된 계면활성제 1중량부를 혼합하여 제조하였다. 오일은 오일과 계면 활성제를 완전히 혼합시키기 위해 밤새 회전 장치에 놓아두었다. 수화된 오일은 오일 5부와 4% 글리세롤이 있거나 없는 물로 구성된 수성 수화상 3부를 혼합하여 제조하였다. 혼합물을 50℃에서 밤새 회전시킨 다음, 70℃에서 60분 동안 회전시켰다. 에멀젼은 15분 동안 방치하였다. 에멀젼의 윗 부분을 분취한 다음, 분취액을 오일의 수화 수준을 조정하기 위하여 원심분리하였으며, 원심분리 시간이 길어지면 수화 수준이 낮아진다. 수화 수준은 Karl Fisher 적정기를 사용하여 측정하였다. 통상 500-1000ppm의 적절한 수화 수준에 도달하면, 분취액의 상등액을 새 튜브에 피펫으로 옮기고 사용할 때까지 동결하였다.
수성 분산상은 4% 글리세롤이 있거나 없는 물로 이루어진다. 침착된 액적은 70℃에서 115분 동안 배양시켰다. 이후 에멀젼 액적 직경을 명시야 현미경 이미지로 측정하고, 측정된 직경을 배양 전 측정된 직경과 비교하여 액적 수축 또는 성장을 결정하였다.
하기 제시된 데이터는 오일 수화제 및 액적 각각에서 글리세롤의 함량에 따른, 고온 배양 단계에서의 액적의 평균 부피 변화를 나타낸다. 참조 시료에서, 글리세롤이 오일 수화제 또는 액적에 존재하지 않으면 액적이 평균적으로 수축된다. 액적에 글리세롤이 포함되어 있는 반면 오일 수화제에는 포함되어 있지 않다면, 액적에 글리세롤을 첨가하는 것이 오일에서의 수분활성도가 액적에서의 수분활성도보다 높아지도록 하기 때문에 액적이 참조에 비해 상대적으로 성장한다. 글리세롤이 오일 수화제에 첨가되지만 액적에는 첨가되지 않는 경우에는 반대 현상이 발생한다. 액적에서의 수분활성도가 오일보다 높기 때문에 참조에 비해 액적은 수축한다. 이는 액적의 특정 내용물과 오일 수화제를 사용하여 액적 수축 및 성장을 제어할 수 있음을 보여준다.
Figure pct00001

Claims (17)

  1. 평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 적어도 하나의 생물학적 성분과 수분활성도 aw1이 1보다 작은 제1 수성매질을 포함하는 미세액적 조작 방법으로,
    평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 수성매질을 포함하는 제2 액적을 추가로 포함하는 물과 비혼화성인 분산매에 미세액적을 유지시키는 단계를 특징으로 하며,
    여기서 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰,
    미세액적 조작 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 적어도 하나 이상의 생물학적 성분과 수분활성도 aw1이 1보다 작고 생물학적 세포를 포함하지 않는 제1 수성매질을 포함하는 미세액적의 내용물의 크기 및/또는 화학적 또는 효소적 반응성을 조작하기 위한 미세액적 조작 방법으로,
    평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 0.5 펨토리터에 달하는 제2 수성매질을 포함하는 제2 액적을 추가로 포함하는 물과 비혼화성인 분산매에 미세액적을 유지시키는 단계를 특징으로 하며,
    여기서 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰,
    미세액적 조작 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 적어도 하나 이상의 생물학적 성분과 수분활성도 aw1이 1보다 작은 제1 수성매질을 포함하는 미세액적에서 화학적 또는 효소적 반응성 및/또는 미세액적의 크기를 제어하기 위한 미세액적 조작 방법으로,
    평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 0.5 펨토리터에 달하는 제2 수성매질을 포함하는 제2 액적을 추가로 포함하는 물과 비혼화성인 분산매에 미세액적을 유지시키는 단계를 특징으로 하며,
    여기서 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰,
    미세액적 조작 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 액적은 수분활성도 aw2가 aw1보다 큰 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 액적은 수분활성도 aw2가 aw1보다 작은 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 액적은 수분활성도 aw2가 aw1와 같은 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  7. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    aw1과 aw2는 독립적으로 0.9 내지 1의 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  8. 청구항 4에 있어서,
    제2 수성매질의 이온 강도는 제1 수성매질의 이온 강도의 1 내지 5배 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  9. 청구항 5에 있어서,
    제1 매질의 이온 강도는 제2 수성매질의 이온 강도의 1 내지 5배 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  10. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 액적의 평균 부피는 미세액적의 평균부피의 10% 미만인 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  11. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 수성매질 중 적어도 하나는 글리세롤을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  12. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 성분은 표적 핵산 유래의 단일 뉴클레오트드 삼인산, 세포의 DNA 또는 RNA 유래의 올리고뉴틀레오티드, 효소 또는 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    제1 및/또는 제2 수성매질은 완충액인 것을 특징으로 하는 미세액적 조작 방법.
  14. 평균 부피가 4 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 수성 완충액을 포함하는 미세액적 내에 함유된 하나 이상의 세포 유형의 세포 증식 유발 방법으로,
    적절한 환경 조건에서 액적 내부에서 세포(들)을 배양한 후 각 액적 내부의 세포 수를 검출하는 단계를 포함하며,
    미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이며 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며,
    여기서 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰,
    세포 증식 유발 방법.
  15. 평균 부피가 4 펨토리터 내지 10 나노리터 범위이고, 수성 완충액을 포함하는 미세액적 내에 함유되어 있는 고려 중인 세포의 하나 이상의 표현형 특성, 유전적 특성 또는 단백질 발현 프로파일의 분석 또는 검출 방법으로,
    세포(들)로부터 유도된 표적을 표지하는 단계를 포함하고,
    미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 4 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며,
    여기서 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰,
    분석 또는 검출 방법.
  16. 핵산 검체를 열인산화(pyrophosphorolysis)에 의해 뉴클레오사이드 삼인산 분자의 정렬된 스트림으로 점진적으로 분해하고, 그로부터 평균 부피가 0.5 펨토리터 내지 10 나노리터이고 각각은 뉴클레오사이드 삼인산 분자 중 하나와 수성 완충액을 포함하는 해당 미세액적의 정렬된 스트림을 생성하는 단계를 포함하는 시퀀싱 방법으로,
    각 미세액적 내의 각 뉴클레오시드 삼인산 분자를 핵염기-특이적 형광 프로브와 반응시킨 후, 각 미세액적과 관련된 해당 형광을 검출함으로써 핵염기를 식별하며,
    미세액적은 평균 부피가 미세액적의 평균부피의 25% 미만이고 최대 0.5 펨토리터에 달하는 제2 액적을 추가적으로 포함하는 비혼화성 분산매에서 현탁되는 것을 특징으로 하며,
    여기서 총 단위 부피 당 미세액적의 총 부피에 대한 분산매의 부피비는 2:1보다 큰,
    시퀀싱 방법.
  17. 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 있어서,
    미세액적과 제2 액적의 수분활성도의 비는 0.9:1 내지 1:0.9, 바람직하게는 0.95:1 내지 1:0.95인 것을 특징으로 하는 방법.
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