KR20140106933A

KR20140106933A - 메쉬-그리드 미세액적 어레이를 이용한 단일 세포 기반 목적 유용효소 활성 탐색 방법

Info

Publication number: KR20140106933A
Application number: KR1020130021247A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 박제균; 엄유진; 권길광; 나유진; 최수림
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국과학기술원
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2014-09-04
Also published as: KR101634350B1

Abstract

본 발명은 단일세포의 활성을 분석하기 위해 분석하고자하는 세포를 단일 세포 단위로 함유할 수 있는 피코리터 수준의 미세액적 제조방법 및 메쉬-그리드가 도입된 미세 액적 마이크로웰 어레이를 이용하여 목적 유용 효소 활성의 탐색 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미세액적 제조 방법은 미세액적 제조 시 이차파쇄과정을 거치므로 단일세포 함유 미세액적의 생산효율을 증가시키고, 메쉬-그리드 기법을 이용한 미세액적(microdroplet) 마이크로 웰 어레이는 개방형 구조를 갖기 때문에 쉽게 액적을 포획하고 융합할 수 있으며 추가적인 조작과 다른 장치와의 연계할 수 있는 안정적 환경을 제공한다. 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소활성을 단일 세포 수준에서 고속 탐색하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 다양한 조건에서 미생물 간 상호작용을 연구하는 데에 적용될 수 있다.

Description

메쉬-그리드 미세액적 어레이를 이용한 단일 세포 기반 목적 유용효소 활성 탐색 방법 {Single Cell-based Screening Method of Useful Enzyme Resources Using Mesh-integrated Microdroplet Array}

본 발명은 자연계에 존재하는 미생물커뮤니티 및 메타게놈 라이브러리 등 다양한 유전자원에서 원하는 대사 또는 효소 활성을 가지는 세포의 효율적 탐색 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 단일 미생물 세포를 포집한 피코리터 수준의 미세액적(microdroplet)을 제조하여 메쉬-그리드(mesh-grid)를 도입한 개방형 마이크로웰 어레이를 수행하고, 단일 세포 단위의 효소 활성 또는 세포 간 상호작용을 리포터 세포를 이용하여 분석함으로써, 원하는 단일세포수준에서 세포의 다양한 활성과 상호작용을 고효율, 고속 탐색하는 새로운 방법에 관한 것이다.

일반적으로 주위세포의 영향 없이 단일세포의 반응이나 분비물을 연구하거나 세포와 세포의 상호작용을 연구하기 위해서는 각 세포를 작은 부피로 분리하는 것이 필요하다. 지금까지 단일세포 분석에 일반적으로 사용되는 방법인 마이크로 플레이트는 한 구획 당 보통 최소 부피가 약 10μL 정도로 단일 세포 볼륨인 1pL 와 비교할 때 상대적으로 큰 부피이다. 이에 따라 반복적이고 비능률적인 희석 과정이 수반된다. 적은 숫자의 세포에서 효과적으로 세포의 활성을 유도하기 위해서는 단위 면적당 세포 수를 조절하는 것이 중요하고 이를 위해 미세구조물 (microfabrication)과 미세유체기술 (microfluidics)이 도입되었다(Lindstrom S. et. al., Lab Chip, 10, p33633372, 2010; Tadmor A. D. et. al., Science, 333, p5862, 2011; Boedicker J. Q. et. al., Angew. Chem.Int. Ed., 48, p59085911, 2009). 미세구조 어레이는 단위면적당 한 세포가 들어가기 위한 적당한 숫자의 구획을 대량으로 제공한다. 그러나 대장균과 같은 모양이 일정하지 않고 크기가 작은 세균을 단일세포 단위로 구분하여 분리하는 것은 용이하지 않으며 각각의 구획에 다른 약물 처리를 하고 그 세포를 다시 회복시키는 것 또한 어렵다.

이런 문제를 해결하기 위해 고안된 방법은 섞이지 않는 이상(two-phase) 유체로부터 미세액적을 형성하는 기법이다(Clausell-Tormos J. et. al., Chem. Biol., 15, p427437, 2008; Um E. et. al., Microfluid. Nanofluid., 5, p541549, 2008). 미세액적은 피코 혹은 나노 리터의 작은 액적 안에 다양한 생물활성물질을 포함할 수 있고 고체 웰과 달리 액적을 이동, 분리, 융합시키고, 시간간격에 따른 분획을 할 수 있으며, 경로를 선택할 수 있는 능동적인 시스템이다(Priest C. et. al., Appl. Phys. Lett., 89, 134101, 2006; Song H. et. al., Angew. Chem. Int. Ed., 45, 73367356, 2006; Um E. et. al., Lab Chip, 9, 207212, 2009). 생물학적 분석을 위해서는 단일세포를 포함한 액적을 안정적으로 형성 및 유지하는 것은 물론, 생물/효소 활성 유도 및 리포터 세포와의 상호작용을 위해 새롭게 유입되는 액적과 기존의 액적을 융합하는 과정이 필요하다. 또한, 추가적인 분석을 위해 미세액적 주변 오일의 조성 및 종류를 추가 또는 교환하는 과정이 필요하며, 이러한 조작단계는 쉽지 않기 때문에 미세액적기술을 용이하게 생물/효소 활성분석에 사용하는 데에는 한계점으로 작용해 왔다.

지금까지 어레이 구조물은 액적을 안정적으로 유지하기 위하여 폐쇄형 미세채널 형식으로 고안되어 사용되어왔다. 그러나 이러한 폐쇄형 구조는 액적을 반복적으로 추가하거나 특정 액적을 선택하기에 용이하지 않은 문제가 있다.

미세구조물에서 다른 모듈로 액적을 이동시키며 유지하기 위한 방법으로 계면활성제가 사용되어왔다. 그러나 포획한 액적의 물리적 경계 없이 액적의 위치를 분석하는 동안 고정시키기가 어려운 문제가 있다. 액적은 압력이나 유속, 액적 개수와 같은 주위 환경에 민감하게 반응하기 때문에, 액적의 물리적 경계를 만들어 주기 위해서는 매우 섬세한 디자인을 필요로 하며, 이런 이유로 기능적인 모듈제작과 액적 조작을 복합적으로 수행하는 것은 용이하지 않다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 단일세포를 함유하는 피코리터 수준의 미세액적을 제조하고, 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용하는 경우, 특정 효소 활성을 가지는 세포를 리포터 세포가 포함된 액적의 융합을 통하여 자연계의 미생물커뮤니티 혹은 메타게놈 세포의 직접적인 조작 없이 효율적으로 스크리닝할 수 있어, 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소활성을 단일세포 수준에서 고속탐색하고 다양한 조건에서 미생물 간 상호작용을 분석할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소 활성을 단일 세포 수준에서 고속 탐색하고 다양한 조건에서 미생물간 상호작용을 분석하기 위하여 단일세포를 함유하는 피코리터 수준의 미세액적의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 다양한 자원의 라이브러리에 직접 적용하여, 원하는 효소 활성을 가지는 세포를 리포터 세포와의 상호 작용을 통해 고효율, 고속 탐색하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 주입부, 오일 주입부, T-junction 채널, pinched-flow 채널, 액적배출구 및 폐기물 배출구가 구비된 미세채널을 이용하여 (a) 오일 및 활성을 분석하고자 하는 세포를 상기 미세채널의 주입부에 각각 주입하는 단계; (b) T-junction 채널에서 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성시키는 단계; 및 (c) Pinched-flow 채널에서 상기 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 단일 세포를 함유한 작은 액적으로 파쇄시켜, 미세액적을 제조하는 단계를 포함하는 단일세포 함유 미세액적의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이상에 특정 효소 활성을 갖는 단일세포 함유 제1액적을 로딩한 다음, 각 웰 내부에 포획하는 단계; (b) 상기 마이크로웰 어레이상에 제1오일을 통과시켜 각 웰 내부로 포획되지 않은 액적을 제거하는 단계; (c) 리포터 세포를 함유하고 있는 제2액적을 상기 단일 세포 함유 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하는 단계; (d) 제2오일을 마이크로웰 어레이상에 통과시켜 제1액적과 제2액적을 융합시키는 단계; (e) 상기 융합된 액적 내 두 세포 간의 반응을 분석하는 단계; 및 (f) 상기 원하는 활성을 나타내는 두 세포가 함유된 액적을 회수하는 단계를 포함한 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용한 원하는 활성을 갖는 세포의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소활성을 단일세포 수준에서 고속 탐색하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 다양한 조건에서 미생물 간 상호작용을 연구하는데 유용하다.

도 1은 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용(가)과 활성 세포 함유 액적과 리포터 세포 함유 액적의 융합(나)을 도식적으로 표현한 것이다.
도 2는 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용을 분석한 것으로, 활성 세포로 사용한 TPL 생산 대장균이 리포터 세포인 녹색형광단백질 생산 대장균과 공동 액체 배양하였을 때의 형광발현 확인(가)과 고체 배지 상의 TPL 생산 활성 세포 콜로니와 녹색형광단백질 리포터 생산 세포 사이의 상호 작용을 형광현미경으로 분석한 것이다.
도 3은 단일 세포 함유 미세액적 제작에 관한 것으로, (가)는 단일 세포를 포함한 미세액적을 만드는 과정, (나)는 pinched flow 부분을 도식적으로 표현한 것이다. (다)는 액적 배출구에 모인 액적들의 volume 분포를 나타낸 그래프이고, (라)는 액적 배출구에 모인 액적들에 포함된 세포의 개수를 나타는 그래프이다.
도 4는 메쉬-그리드가 적용된 마이크로웰 어레이를 만드는 과정을 도식화 한 것으로, (가)소프트리소그래피를 이용하여 제작한 마이크로웰어레이 기판에, (나) 미세액적보다 작은 높이의 간격을 갖도록 하기 위한 스페이서를 제작하고, (다)와 (라) 메쉬-그리드를 배열하여 올려서 제작하고, (마)는 메쉬-그리드를 배열한 후 찍은 현미경 사진이며, (바)는 실험하기 전에 마이크로웰 어레이를 오일로 채우는 단계를 보여주는 그림이다.
도 5는 메쉬-그리드가 적용된 마이크로웰 주변에 생성된 미세유체채널 구조(가)와 각 웰 안에 트랩된 액적의 수를 나타내는 그래프(나) 이다.
도 6은 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용한 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용을 분석한 것으로, (가)는 녹색형광단백질 생산 세포를 함유하는 액적을 마이크로웰 어레이에 포획한 것이며, (나)는 (가)의 액적과 적색형광단백질 생산 세포 함유 액적을 융한 한 것이고, (다)는 TPL 생산 활성 세포 함유 액적과 녹색형광단백질 리포터 생산 세포 함유 액적을 융합하여 분석한 것이다.
도 7은 미세액적에 포획된 목적 단일세포를 30㎛ 유리 미세관(가)을 이용하여 마이크로웰로부터 채취하여 선택배지에서 배양하여 회수한 단일 콜로니(화살표)를 나타낸 것(나) 이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 예를 들어 자연에서 분리한 활성 세포와 유전공학적으로 제조한 리포터 세포 사이의 상호 작용, 즉 전사활성물질의 확산에 의한 리포터발현(도 1의 (가))을 단일세포 수준에서 관찰하기 위한 것이다. 이를 위하여 본 발명에서는 활성 세포 함유 액적과 리포터 세포 함유 미세액적을 독립적으로 제조하고 개별 미세액적을 융합한 융합 미세액적(도 1의 (나))을 현미경으로 관찰하여 활성 세포의 특성을 판별하는 방법에 대한 것이다.

도 2는 미세액적에서 활성 세포 및 리포터 세포의 개별적 상호작용을 관찰하기에 앞서 액체배지(도 2의 (가)) 및 고체배지(도2의 (나))에서 실제 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용을 먼저 조사한 것이다. 즉 리포터 세포인 녹색형광단백질 생산 대장균은 활성 세포로 사용한 TPL 생산 대장균과 공동 액체 배양하였을 때에만 형광리포터 발현이 관찰되었고 그 외의 경우에서는 형광을 나타내지 않았다 (도 2의 (가)). 또한 고체 배지 상에서 TPL 생산 활성 세포 콜로니와 녹색형광단백질 리포터 생산 세포를 섞어서 도말한 경우 두 집락(콜로니)군의 물리적 접촉면에서만 리포터 세포의 형광 발현이 나타났다 (도 2의 (나)).

또한 미세액적의 제조에 있어서, 본 발명은 세포 주입부, 오일 주입부, T-junction 채널, pinched-flow 채널, 액적배출구 및 폐기물 배출구가 구비된 미세채널을 이용한 (a) 오일 및 활성을 분석하고자 하는 세포를 상기 미세채널의 주입부에 각각 주입하는 단계; (b) T-junction 채널에서 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성시키는 단계; 및 (c) Pinched-flow 채널에서 상기 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 단일 세포를 함유한 작은 액적으로 파쇄 시켜, 미세액적을 제조하는 단계를 포함하는 단일세포 함유 미세액적의 제조방법에 관한 것이다 (도 3).

본 발명에서 상기 단일 세포를 함유하는 미세액적의 제조를 위해 도 3에서와 같이 미세채널장치는 오일 흐름을 형성하기 위한 오일을 주입하는 오일 주입로 (oil inlet), 활성을 측정하고자 하는 세포를 주입하는 세포 주입로(cell loading), 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성하는 T-junction 채널, 상기 큰 액적을 단일 세포를 함유하는 작은 액적으로 파쇄 하는 Pinched-flow 채널, 최종적으로 단일 세포를 포함하는 액적을 마이크로웰 어레이로 보내는 배출구 (oulet) 및 폐기물 배출구(Waste)로 구성되었다.

본 발명에서 T-juction은 오일 유체와 세포가 혼합된 액체가 만나는 부분으로 약 직경 100μm의 비교적 큰 액적이 형성되는데, 이 액적은 보통 한 개 이상의 다수의 세포를 포함하게 된다. 상기 생성된 직경 100μm의 액적은 pinched-flow 채널을 통과하면서 직경이 약 30μm인 더 작은 액적으로 이차 파쇄 되며, 파쇄된 액적은 부피가 10~15pL로 세균과 같은 작은 크기의 세포도 단일세포로 함유할 수 있다. 기존의 미세공정 또는 미세유체조작에 의한 방법에서는 단일 세포로의 분리 효율이 30%가 채 되지 않으나, 본 발명에서와 같이 이차 파쇄 방법으로 액적을 제조하면 단일 세포를 함유하는 액적을 50% 정도의 수율로 수득할 수 있으며, 다수의 세포를 포함하는 액적의 비율을 16% 이하로 낮출 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 단계를 거쳐 제조된 최종 단일세포 함유 미세액적은 500μm의 유리 모세관을 이용하여 마이크로웰 어레이로 이동되어 단일세포 분석에 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유체는 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 세포가 포함된 배양액은 세포를 1x10⁸~2x10⁸cells/mL의 비교적 고농도로 사용하여 미세채널 안의 세포들이 균등하게 분포되고 세균세포가 벽면에 붙지 않도록 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 T-junction 채널과 Pinched-flow 채널 사이에 설치된 오일 주입부를 통해 오일을 주입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이상에 단일세포 함유 제1액적을 로딩한 다음, 각 웰 내부에 포획하는 단계; (b) 상기 마이크로웰 어레이상에 제1오일을 통과시켜 각 웰 내부로 포획되지 않은 액적을 제거하는 단계; (c) 상기 단일 세포와 다른 세포를 함유하고 있는 제2액적을 상기 단일 세포 함유 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하는 단계; (d) 제2오일을 마이크로웰 어레이상에 통과시켜 제1액적과 제2액적을 융합시키는 단계; (e) 상기 융합된 액적 내 두 세포 간의 반응을 분석하는 단계; 및 (f) 상기 원하는 반응을 보이는 두 세포가 함유된 액적을 회수하는 단계를 포함한 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용한 목적 활성을 갖는 세포의 탐색 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 제1액적과 제2액적은 상기 단일 세포를 포함한 미세액적의 제조방법으로 제작되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 '목적활성을 갖는 세포'은 원하는 효소활성이나 원하는 대사경로를 가지는 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이는 구조적으로 도 4에서와 같이 평면 금속의 그리드가 스페이서가 양쪽 끝에 부착된 PDMS (polydimethylsiloxane) 마이크로웰 기판 위에 놓여진 구조이다. 도 4에서 나타낸 바와 같이 PDMS기판은 soft lithography과정을 통해 다수의 웰을 갖는 마이크로웰 어레이 형태로 성형 되고 그 위에 스페이서를 양쪽 끝에 부착하며 금속성 메쉬-그리드를 현미경하에서 마이크로웰 어레이에 부착된 스페이서 위에 고정하였다.

본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 높이가 25μm이며 2500rpm으로 60초간 PDMS로 스핀코팅을 하여 얇은 막 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메쉬-그리드는 금속성이며 크기가 2mmㅧ2mm이고 너비가 43μm인 900개의 웰을 포함한 것을 특징으로 할 수 있고, 메쉬-그리드의 가장 바람직한 예는 상업적으로 구입할 수 있는 금속성 400-메쉬 투과전자현미경 그리드 (400-mesh transmission electron microscopy grid, Electron Microscopy Science PA, USA).)이나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 마이크로웰은 너비와 깊이가 각각 40μm이며 웰 간격은 23μm인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일 세포를 함유하는 미세액적은 직경 500μm 유리 미세관을 이용하여, 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이로 이동시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 도 3에서 나타낸 바와 같이, 스페이서에 의해 메쉬-그리드와 어레이 기판 사이에 공간이 형성되며 유체로 채워지게 될 때 유체의 대량 흐름 대신 얇은 오일 필름 형태의 유체 흐름을 유지하게 하여 미세채널구조를 갖게 한다. 계속적인 오일의 흐름으로 마이크로웰에 액적이 포획되는 것을 방해하는 거품이 제거된다. 도 5에서처럼, 메쉬-그리드와 기판 사이의 공간을 형성하여 자유롭게 유체의 흐름을 형성하고, 액적 이동이 원활하게 하여 액적이 웰 안으로 배열될 수 있게 하였다. 메쉬-그리드를 사용하지 않는 기존의 방법은 액적이 마이크로웰의 외부의 대량적인 오일 흐름을 따라 휩쓸려 흐르게 되고 마이크로웰로 향하는 유체의 수직속도 w는 거의 제로에 가까워 액적이 좁은 웰 안으로 들어가기에 용이하지 않으나, 본 발명은 도 5에서와 같이 w를 증가시켜 액적이 마이크로웰에 안정하게 포획되게 한다. 또한 메쉬-그리드와 PDMS 어레이 사이의 공간이 액적의 크기보다 작아 액적이 오일의 흐름을 따라 그리드를 통과할 때 웰 안으로 쉽게 포획될 수 있다. 웰 안으로 포획되지 못한 액적은 제1오일이 통과되면서 제거된다.

본 발명에 있어서, 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 80% 이상의 웰 안에 미세액적을 안정적으로 포획하여 추가적인 미세액적의 조작 및 다른 장치와의 연계가 가능한 안정적인 환경을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이는 기존의 고체로 된 덮개가 있는 밀폐형 구조인 마이크로웰 어레이와 달리 매쉬-그리드를 이용한 개방형 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 개방형 구조를 제공하기 때문에 상기 제2액적을 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하여, 복잡한 유체 병합 채널을 통합하거나 전극과 같은 활성 구성 요소를 사용하지 않고 화학적 구성물질 분리 방법 (chemical demulsification)을 이용하여 제1액적과 쉽게 융합할 수 있다. 상기 제1액적이 마이크로웰 안에 안정적으로 위치하게 되면 제2 액적을 흘려보내 제1액적이 위치한 마이크로웰 안으로 위치시킨다. 포획된 두 액적을 융합시키기 위해 제1오일과 상태가 다른 상기 제2오일을 이용하는데 주변 오일상태의 변화로 인해 평형상태가 변하면 마이크로웰 안의 두 액적이 융합되며, 전체 웰의 83%에서 1:1 융합이 일어나 기존의 방법에 비하여 효율적임을 확인하였다.

본 발명에서 상기 제1오일은 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일이고, 상기 제2오일로는 물에 불용성이며 수용성 미세액적에 영향을 주지 않고 바람직하게는 40% (v/v) 옥탄올을 포함하는 미네랄 오일을 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 일에 있어서, 상기 제1액적 및 제2액적에 사용되는 유체는 제1오일 또는 제2오일보다 밀도가 높은 유체를 이용할 수 있으며, 상기 제1액적에 포함되어 있는 세포는 특정 효소의 생산능력이 있는 세포이고, 상기 제2액적에 포함되어 있는 세포는 특정효소의 산물에 반응하여 형광을 나타내는 리포터 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 융합된 액적 내 두 세포간의 반응을 분석하기 위한 방법으로, 특정 효소(TPL; tyrosine phenol lyase) 활성을 갖는 대장균과 TPL 효소 활성을 감지하여 형광단백질을 발현하는 리포터를 갖는 대장균을 이용하였다. 상기 제1액적의 활성 세포는 TPL을 발현하는 대장균세포이나, 단지 TPL 효소 활성에 국한하지 않고 세포 내 대사나 세포간 상호작용 등 필요한 활성을 나타내는 세포이다. 리포터 세포는 상기 제2액적에 함유된 TPL의 생산물인 페놀을 감지하여 형광을 나타내는 세포이나, 형광에 국한하지 않고 발광, 항생제 내성 등 활성 탐색이 가능한 여러 가지 리포터 세포를 나타낸다. 두 세포를 각각 포함한 액적을 제조하여 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이를 이용하여 융합시킨 후 세포간의 상호 반응을 형광측정 장치로 측정할 수 있다. 도 6에서와 같이 TPL을 생산하는 세포를 포함하는 액적과 리포터 세포를 포함하는 액적을 융합시킨 웰에서만 형광이 감지되어 효소 활성을 갖는 세포를 탐색 할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포를 포함하는 미세액적의 회수는 30μm 직경의 유리 미세관을 이용하여 액적을 마이크로웰 어레이로부터 선택적으로 꺼내고, 이를 고체배지에 배양하여 원하는 세포를 콜로니 형태로 키울 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

효소활성 세포와 리포터 세포의 제조 및 상호작용 분석

메쉬-그리드 기법이 도입된 어레이를 특정효소를 생산하는 대장균을 포함하는 액적을 리포터 세포가 포함된 다른 액적과 융합시켜 단일세포 반응 검사에 적용 시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 특정 효소(TPL; tyrosine phenol lyase) 활성을 갖는 대장균과 TPL 효소 활성을 감지하여 형광단백질을 발현하는 리포터를 갖는 대장균을 이용하였다(Lee et. al. FEBS J., 273, p55645573, 2006). TPL을 생산하는 세포를 포함하는 액적과 리포터 세포를 포함하는 액적을 융합시켜 TPL 효소 활성을 분석 할 수 있는지를 확인하고자 하였다 (도 1).

도 1에서와 같이, 효소 생산세포는 tyrosine phenol-lyase (TPL)를 발현하는 대장균세포(XL1-Blue/pTrc99a-TPL)로 L-tyrosine의 가수 분해 반응에 의한 페놀, pyruvate 및 암모니아를 생산하도록 유전자 조작을 수행하였다. 리포터 세포는 TPL의 반응 산물인 페놀을 슈도모나스속 유래 페놀-촉매 전사유도체인 DmpR에 의해 감지하여 리포터 형광 단백질의 발현을 활성화하도록 설계된 유전자 조작 대장균 세포를 사용하였다(도 1, Lee et. al. FEBS J., 273, p55645573, 2006).

다음으로 TPL 생산 활성 세포와 리포터 세포 간의 상호 작용을 lab scale로 분석하기 위해 37ㅀC에서 1mM tyrosine이 보충된 M9 액체 배지(1x M9 salt, 0.4 % acetate, 2 mM MgSO4. 0.1 mM CaCl₂, 0.01 % thiamine, 1 mM Tyrosine, 10 uM PLP, 50 ug/ml Ampicillin)로 16시간 동안 공동 진탕 배양을 한 후, EGFP 필터 세트(ex: 488 nm, em: 530/20) 조건에서 형광 플레이트 리더 (VictorTM 51 V, Perkin-Elmer, MA)를 사용하여 형광을 측정하였다. 그 결과, 도 2의 (가)에서와 같이, TPL 생산 활성 세포나 리포터 세포를 단독으로 배양한 경우에는 형광이 측정되지 않았지만, TPL 생산 활성 세포와 리포터 세포가 동시에 존재하는 배양체에서는 높은 형광이 측정되었다(도2의 가).

이러한 결과는 고체 배지 상에서 활성 세포와 리포터 세포의 단일 콜로니에서도 관찰 할 수 있었다. 고체배지 상에서 효소 발현 세포와 리포터 세포 사이의 효소 활성 감지를 확인하기 위해 M9 고체배지(1x M9 salt, 0.4 % acetate, 2 mM MgSO4. 0.1 mM CaCl2, 0.01 % thiamine, 1 mM Tyrosine, 10 uM PLP, 50 ug/ml Ampicillin, 10 ug/ml Tetracycline, 1.5 % agar)에서 실험을 진행하였다. 항생제내성 실험에 사용하기 위해 TPL 유전자가 pET 플라스미드에 삽입된 대장균 DH5α에 ACYC184 플라스미드를 삽입하여 tetracycline 저항성을 부여하였다. 그리고 리포터 세포는 pUC19 플라스미드에 형광 리포터 단백질 뒤에 tetracycline 내성 유전자를 삽입하여, 감지물질이 세포 내부로 들어오면 형광과 항생제내성 두 가지 반응을 동시에 확인할 수 있게 하였다. 두 종류의 세포들을 각각 LB에 전배양 한 후 원심분리와 부유화과정을 통하여 M9 버퍼로 1회 세척한 뒤, 리포터 세포를 위에 준비한 고체배지에 약 10⁴정도 되게 희석하여 도말하였다. 그리고 그 위에 TPL 효소 생산 세포 배양 희석액을 떨어뜨린 뒤, 30 ℃에서 48시간 배양하였다. 배양한 고체배지는 형광현미경(AZ100M, nikon, 일본)을 이용하여 형광을 관찰하였다.

그 결과, 도 2의 (나)와 같이 TPL 생산 세포의 콜로니 주변으로 리포터 세포의 마이크로콜로니들이 자라면서 형광을 내는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 TPL 활성으로 인한 효소 생산물이 고체 배지로 확산되어, 리포터 세포들이 tetracycline 저항성을 가지게 되어, 자라면서 형광을 나타내는 것으로 예상된다. 이 실험 결과를 통해, 이종의 균주 간에 효소활성을 리포터 세포의 형광 및 항생제내성 발현 등으로 확인할 수 있음을 확인하였다.

단일 세포를 함유한 미세액적의 제조

단일 미생물 세포를 포함하는 미세액적 생성은 각각의 독립적 미세채널 장치로부터 생성된다. 도 3의 (가)에서와 같이 미세채널장치는 오일을 주입하기 위한 오일 주입로(oil inlet), 활성을 측정하고자 하는 세포를 주입하는 세포 주입로(cell loading), 세포와 오일이 혼합되어 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성시키는 T-junction 채널, 작은 액적으로 이차 파쇄시키는 Pinched-flow 채널, 최종적으로 제조된 단일 세포를 함유한 액적을 내보내는 배출구(oulet) 및 폐기물 배출구로 구성되어 있다. 이러한 미세액적 생성 장치는 상기 미세채널구조를 갖는 기판 2개를 부착하여 채널 통로를 만드는데 각각의 기판은 PDMS(polydimethyl- siloxane)재질로 이루어져 있다.

다음으로, 오일 주입부에 오일을 주입하는데, 오일로는 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일을 사용하였다. 분석할 세포가 포함된 배양액은 세포 주입로를 통하여 주입되는데 세포배양액은 비교적 높은 농도인 1x 10⁸~2x10⁸cells/mL로 주입되었다. 이와 같이 높은 농도의 세포배양액을 사용하면 세균세포가 벽면에 붙는 현상에 구애받지 않고, 미세채널 안의 세포들을 균등하게 분포시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

주입된 오일과 세포배양액은 상기 T-juction에서 혼합되어 먼저 다수 세포를 함유한 약 직경 100μm의 비교적 큰 액적이 만들어진다. 생성된 큰 액적은 Pinched-flow 채널로 이동되어 이차적으로 파쇄되어 직경이 약 30μm이고 부피가 10-15pL이며, 단일세포를 함유한 미세액적이 제조되었다(도 3의 (다)). 상기 액적의 이차파쇄는 Pinched-flow 채널의 직경과 오일 흐름속도에 기인하는데, 도 3의 (나)에서와 같이 Pinched-flow 채널의 직경(W₂)은 다른 채널의 직경(W₁=120μm)에 비교하여 20μm로 좁으며, Pinched-flow 채널쪽에서 측정되는 오일 흐름 속도(Qd)가 다른 채널 부위의 오일 흐름 속도(Qo= 20μL/h)에 비하여 40μL/h로 높게 설정되었기 때문에 큰 액적은Pinched-flow 채널을 통과하면서 작은 액적으로 파쇄되게 된다. 최종적으로 제조된 단일세포를 함유하고 있는 미세액적은 생성된 총 액적의 50%정도로 기존의 방법으로 얻은 단일세포 함유 미세액적 수득률(30%)에 비하여 크게 향상된 결과를 얻었다(도 3의 라).

1. 메쉬 그리드가 도입된 마이크로웰 어레이의 제작과 액적의 포획

1-1. 메쉬 그리드가 도입된 마이크로웰 어레이의 제작

구조적으로 메쉬그리드가 첨가된 마이크로웰 어레이는 도 4에서와 같이 평면 금속의 그리드가 스페이서가 양쪽 끝에 부착된 PDMS(polydimethylsiloxane) 마이크로웰 기판 위에 놓여진 구조이다. 도 4의 (가)에서 나타낸 바와 같이 PDMS기판은 소프트 리소그래피(soft lithography)과정을 통해 다수의 웰을 갖는 마이크로웰 어레이 형태로 성형 되는데, 전체 2mmㅧ2mm 크기이며 45μm 너비의 웰 900개가 포함되어 있다. 기판 위에 스페이서를 양쪽 끝에 부착하는데, 스페이서는 25μm 높이를 갖으며 2500rpm으로 60초간 PDMS로 스핀코팅을 하여 얇은 막 구조를 갖는다(도 4의 (나)). 다음으로, 도 4의 (다)∼(바)와 같이 마이크로웰 어레이에 부착된 스페이서 위에 메쉬-그리드를 현미경하에서 정렬하여 고정시키고 메쉬-그리드와 마이크로웰 사이의 공간을 오일로 채운다.

본 실시예에서 사용된 메쉬-그리드는 상업적으로 구입할 수 있는 금속성 400-메쉬 전자현미경 그리드(400-mesh transmission electron microscopy grid, Electron Microscopy Science, USA)이다. 오일로는 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일을 사용하였으며, 각 마이크로웰 어레이의 웰은 너비와 깊이가 40μm이며, 각각의 웰은 23μm 간격으로 떨어져 있도록 제작되었다.

1-2. 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이에서 액적의 포획

조립된 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 스페이서에 의해 메쉬-그리드와 어레이 기판사이에 공간이 형성되며 유체로 채워지게 될 때 유체의 대량 흐름 대신 얇은 오일 필름 형태의 유체 흐름을 유지하게 하여 미세채널구조 구조를 갖게 한다. 계속적인 유체흐름으로 마이크로웰에 액적이 포획되는 것을 방해하는 거품이 제거된다. 도 3에서처럼, 메쉬-그리드와 기판사이의 공간은 자유로운 오일의 흐름을 형성하고 액적의 이동이 원활하게 하여 웰 안으로 액적이 쉽게 포획될 수 있게 도와준다. 기존의 메쉬-그리드를 사용하지 않는 마이크로웰 어레이는 액적이 외부 오일의 대량 흐름에 휩쓸려 흐르며, 웰로 향하는 유체의 수직속도 W는 거의 제로에 가깝게 되어 웰 안으로 포획되는 것이 용이하지 않았다. 본 발명의 메쉬-그리드가 적용된 경우 마이크로웰 주변에 미세유체채널 구조가 생기게 되어 유체의 흐름으로 액적을 밀어넣는 힘(w)이 증가하게 되고, 메쉬-그리드로 인해 생기게 되는 간격 s 보다 액적의 크기가 크면 밖으로 빠져나가기 보다 웰 안으로 트랩 되려고 하기 때문에 액적이 마이크로웰 어레이 안으로 안정하게 포획되는 것을 돕는다(도 5의 가).

본 발명의 메쉬-그리드를 적용한 마이크로웰 어레이 웰 안에 포획된 액적의 수는, 마이크로웰의 너비가 40㎛ 일 경우, 90% 이상이 40㎛ 직경을 갖는 액적이 마이크로웰 안에 하나 트랩된 것을 확인할 수 있었다(도 5의 나).

메쉬 -그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용한 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용 분석

메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용한 활성 세포와 리포터 세포의 상호작용을 분석하기 위하여, 우선 실시예 1의 방법으로 제조된 활성 세포와 리포터 세포가 단계적으로 액적 내에 포획/융합 되는지를 녹색형광단백질과 적색형광단백질을 발현하는 세포들을 이용하여 현미경으로 분석하였다.

그 결과, 도 6의 (가)에서 보는 바와 같이, 녹색형광단백질을 발현하는 세포를 갖는 제1액적을 메쉬-그리드 마이크로웰에 약 50%의 높은 수득률로 포획할 수 있었다. 또한, 상기의 녹색형광단백질 함유 제1액적을 적색형광단백질을 발현하는 세포를 포획한 액적과 융합하여 관찰한 결과, 녹색형광단백질과 적색형광단백질이 융합되어 동시에 발현된 웰을 확인할 수 있었다(도 6의 나). 이는 서로 다른 2개의 액적이 융합되어 각 액적의 특성 및 활성이 융합된 하나의 액적에서 발현되고, 관찰 가능함을 확인한 결과이다.

다음은 특정 효소 활성을 갖는 활성 세포와 리포터 세포의 상호작용을 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용하여 확인하였다. 활성 세포로는 TPL을 생산하는 대장균 세포(XL1-Blue/pTrc99a-TPL)를 사용하였으며, 리포터 세포는 TPL의 반응 산물인 페놀을 슈도모나스속 유래 페놀-촉매 전사유도체인 DmpR에 의해 감지하여 리포터 형광 단백질의 발현을 활성화하도록 설계된 유전자 조작 대장균 세포를 사용하였다. 활성 세포 함유 제1액적과 리포터 세포 함유 제2액적을 각각 제조한 다음, 2개의 액적을 융합하여 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 6의 (다)에서 보는 바와 같이, 일부 마이크로웰에서 녹색형광이 관찰 되었는데, 이는 TPL 생산 활성 세포 함유 제1액적과 녹색형광단백질 생산 리포터 세포 함유 제2액적이 융합하여 활성 세포의 TPL 활성을 리포터 세포의 DmpR이 감지하여 녹색형광단백질을 발현을 활성화 한 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용하여 미생물커뮤니티 및 메타게놈 등 다양한 자원에 직접 적용하여, 세포 간 상호 작용 분석 뿐만 아니라, 원하는 효소 활성의 고속 탐색에도 효율적으로 사용 가능함을 보여 준 것이다.

아울러, 상기의 TPL 생산 활성 세포가 있는 마이크로웰의 액적을 30㎛의 유리 미세관으로 회수 분석하였다. 도 7의 (가)에서처럼 직경 30㎛의 유리 미세관으로 형광이 관찰되는 액적을 채취하여, 암피실린이 포함된 고체배지에 배양하여 활성 세포를 확인하였다. 그 결과, 암피실린에 내성을 갖도록 설계한 TPL 생산 대장균이 자라는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 나). 이러한 결과는, 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소 활성을 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용하여 단일 세포 수준에서 분석 및 고속 탐색할 수 있을 뿐만 아니라, 유리 미세관 등의 간단한 도구 및 방법으로 유용 목적 활성 세포를 간단히 채취, 회수 가능함을 보여준 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시의 일예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용한 효소 활성 탐색 방법:
(a) 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이상에 단일 세포 함유 제1액적을 로딩한 다음, 각 웰 내부에 포획하는 단계;
(b) 상기 마이크로웰 어레이상에 제1오일을 통과시켜 각 웰 내부로 포획되지 않은 액적을 제거하는 단계;
(c) 상기 단일 세포와 다른 세포를 함유하고 있는 제2액적을 상기 단일 세포 함유 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하는 단계;
(d) 제2오일을 마이크로웰 어레이상에 통과시켜 제1액적과 제2액적을 융합시키는 단계;
(e) 상기 융합된 액적내 두 세포간의 반응을 분석하는 단계; 및
(f) 상기 목적 활성을 나타내는 두세포가 함유된 액적을 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 제1액적에 포함되어 있는 세포는 특정 대사회로 또는 특정효소 활성이 있는 세포이고, 상기 제2액적에 포함되어 있는 세포는 상기 특정대사회로 또는 특정 효소활성의 산물에 반응하여 감지할 수 있는 리포터 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (f) 단계의 회수는 미세 유리관을 이용하여 액적을 선택적으로 꺼내고 이를 선택배지에 배양하여 원하는 세포를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
미세액적을 마이크로웰 어레이 내에 포획하기 위해, 상기 마이크로웰 어레이 위에 간격을 두고 집적된 마이크로그리드 구조물; 및
상기 마이크로그리드 구조물과 마이크로웰 어레이 사이의 간격을 형성하고 마이크로그리드 구조물을 고정할 수 있는 지지대; 를 포함하는 마이크로그리드 구조물이 집적된 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 미세액적은 이와 섞이지 않는 연속상 유체 내에 퍼져 있는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제5항에 있어서, 상기 연속상 유체는 미세액적의 혼합을 막기 위한 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이
제4항에 있어서, 상기 미세액적은 세포, 단백질 및 나노 크기의 입자상태로 제공되어야 하는 고분자성 입자로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이는 복수의 미세액적이 독립적으로 포획될 수 있는 복수의 웰을 포함하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이는 포획하고자 하는 미세액적을 독립적으로 포획하기 위해 미세액적과 비슷한 크기를 갖는 마이크로웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물은 마이크로웰 어레이 위에 일정한 간격을 두고 고정된 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물은, 마이크로웰에 포획하고자 하는 미세액적과 연속상 유체를 구멍들을 통해 통과시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물은 마이크로웰 크기에 상응하는 크기의 구멍들을 갖는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제12항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물은 그 구멍들은 상응하는 마이크로웰 위에 정렬되어 고정된 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물과 어레이 사이의 간격 사이로 미세액적 또는 연속상 유체가 배출될 수 있는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물과 어레이 사이의 간격은 포획하고자 하는 미세액적이 구형태의 지름보다 작은 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물 위로 미세액적 및 연속상 유체를 옮겨놓을 수 있는 장치를 포함하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물과 어레이 사이의 간격으로 유체흐름을 유도할 수 있는 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이.
제4항에 있어서, 상기 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이는 개방형 구조인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 내지 제18항 중 어느 한 항의 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이를 이용하여 미세유체 액적을 포획하는 방법에 있어서,
상기 마이크로그리드 구조물 상에 연속상 유체에 담겨 있는 미세액적을 분산시키는 단계;
상기 마이크로그리드 구조물로 연속상 유체에 담겨 있는 미세액적들이 통과되는 단계; 및
상기 연속상 유체가 마이크로그리드 구조물과 마이크로웰 어레이 사이의 간격을 통해 빠져나가면서 미세액적은 마이크로웰 안으로 포획되는 단계;를 포함하는 미세액적을 포획하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 마이크로그리드 구조물과 마이크로웰 어레이 사이의 간격 내에 포획되지 않은 미세액적이 남아있는 경우, 연속상 유체의 흐름을 유도하여 미세액적을 그 간격 사이로 배출할 수 있는 것을 특징으로 하는 미세액적을 포획하는 방법.
제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이를 이용하여 미세액적을 포획하는 방법에 있어서, 상기 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이에 일차적으로 미세액적이 포획 된 후,
상기 마이크로그리드 구조물 상에 연속상 유체에 담겨 있는 미세액적을 분산시키는 단계;
상기 마이크로그리드 구조물로 연속상 유체에 담겨 있는 미세액적들이 통과되는 단계; 및
상기 연속상 유체가 마이크로그리드 구조물과 마이크로웰 어레이 사이의 간격을 통해 빠져나가면서 미세액적은 마이크로웰 안으로 포획되는 단계;를 반복하여 마이크로웰 내에 다수의 미세액적을 포획하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 복수의 미세액적이 마이크로웰 내에 포획된 경우 포획된 미세액적이 마이크로웰 내에서 만나 합쳐지는 단계를 포함하는 미세액적 혼합을 하는 방법.
제4항 내지 제18항 중 어느 한 항의 미세액적 포획 및 혼합을 위한 마이크로웰 어레이를 이용하여 미세액적을 포획 및 혼합하는 방법에 있어서, 상기 미세액적이 포획된 마이크로웰 어레이 및 마이크로 그리드 구조물 상에 지속적으로 연속상 유체를 추가 및 변경하는 단계를 포함하는 미세액적 포획 및 혼합을 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 연속상 유체 내에 계면활성제가 포함되어 마이크로웰 어레이 내에 포획된 미세액적들이 합쳐지지 않을 경우, 계면활성제가 포함되어 있지 않은 연속성 유체 또는 항유화제가 포함된 연속성 유체를 마이크로웰 어레이 및 마이크로 그리드 구조물 상에 추가 및 변경하여 포획된 다수의 미세액적을 혼합할 수 있는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이 내에 포획된 미세액적들이 합쳐지지 않을 경우, 마이크로웰 어레이 주변에 전기장과 같은 외부 힘을 가해 미세액적의 표면장력을 변화시켜 포획된 다수의 미세액적을 혼합하는 것을 특징으로 하는 미세액적 포획 및 혼합을 하는 방법.