CN113355387B - 一种检测组织中单细胞的酶活性的检测系统及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单细胞检测技术领域，特别涉及一种单细胞酶活性的检测系统及检测方法。所述检测系统包括毛细管，银丝，氧化铟锡电极，所述毛细管中装有酶活性测定溶液，所述银丝浸没在所述酶活性测定溶液中，银丝和氧化铟锡电极通过电化学工作站连接，使用电化学工作站在银丝和氧化铟锡电极上施加电压并检测电流，控制毛细管向下移动，使所述酶活性测定溶液微滴留在氧化铟锡电极表面，形成试剂盒，酶活性测定溶液与待测酶反应，通过检测荧光强度，计算酶活性。与现有的单细胞分析相比，组织中单个细胞的分析可以提供更接近真实生理状态的信息。这可以帮助阐明组织水平上的酶异质性。

Description

一种检测组织中单细胞的酶活性的检测系统及其检测方法

技术领域

本发明涉及单细胞检测技术领域，特别涉及一种单细胞酶活性的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

细胞作为生命体结构和生命活动的基本单元，要了解生命体中的一些生命活动规律，就必须要以细胞为研究基础。在对细胞内组分的分析研究中，由于对单细胞分析的难度比较大，所以往往采取对细胞群体的分析手段来获得细胞中的化学信息，但是这样会带来一些局限性和弊端。生物体内的组织具有不均匀性，而对于单个细胞间，更具有较大的差异。在对细胞群体的统计分析结果中，掩盖了单细胞间的差异，造成了医学、生物学以及其他学科在进一步研究时受到限制。对于单个细胞的研究，能够掌握更准确更全面的细胞信息，对于其他学科的研究，疾病的早期预防和诊断具有重要意义。

考虑到高度的细胞异质性，从组织或细胞群体进行的分析无法提供有关单个细胞中酶活性的信息。因此，单细胞水平的酶活性的特征在于揭示酶在细胞差异中的作用。科学家们已经设计了各种无机或有机探针并将其负载到细胞中，以便与细胞内的酶进行反应发出光信号。为了获得高度特异性和细胞可渗透性的探针，需要针对目标酶的个性化设计和探针的合成，这是复杂且耗时的。

最近，科学家们使用电化学泵将试剂盒组分注射到一个活细胞中，形成纳米试剂盒。该策略运用了完善的试剂盒，因此避免了探针制备的复杂性。尽管在检测单个细胞中的酶活性方面已经取得了这些进展，但是来自单个培养细胞的信息并不能代表真实器官或组织中的互联的细胞行为。

发明内容

本发明解决的问题是，一方面避免探针制备的复杂性，另一方面是单个培养细胞的信息并不能代表真实器官或组织中的互联的细胞行为。

本发明提供了一种酶活性的检测系统，并按照需要形成微米级别的试剂盒，以此分析组织中单细胞的酶活性的方法。

本发明针对现有单细胞酶活性检测技术中无法反映真实器官或组织中的互联的细胞行为，实现了在组织上按需滴注形成微米级别检测系统的功能，例如，以单细胞分辨率测量脑切片上的乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性。确定切片上AChE的活性范围，表明了AChE活性在组织中的分布是不均匀的。与现有的单细胞分析相比，组织中单个细胞的分析可以提供更接近真实生理状态的信息。这可以帮助阐明组织水平上的酶异质性。

本发明的设计原理：

使酶活性测定溶液形成试剂盒，酶活性测定溶液与待测酶反应，通过检测荧光强度，计算酶活性，例如检测乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性：

DHR123(二氧罗丹明123)+H₂O₂→Rh123(罗丹明123)

通过检测体系生成的过氧化氢量，测定乙酰胆碱酯酶(AChE)的酶活性。

本发明提供一种用于检测组织中单细胞的酶活性的检测系统，所述检测系统包括：毛细管，银丝，氧化铟锡电极。毛细管中装有酶活性测定溶液，所述银丝设置在所述毛细管中。其中，使用电化学工作站在银丝和氧化铟锡电极上施加电压并检测电流，控制毛细管上下移动。使所述酶活性测定溶液微滴留在氧化铟锡电极表面，形成试剂盒。其中，酶活性测定溶液与待测酶反应，通过检测荧光强度，计算酶活性。

作为优选方案，以上所述的酶活性测定溶液为生理缓冲液，其中含有酶反应物和荧光探针。

作为优选方案，以上所述的酶反应物为乙酰胆碱氯化物、胆碱或葡萄糖。

作为优选方案，以上所述的酶活性测定溶液为生理缓冲液10mM PBS，pH 7.4，其中含有酶反应物75mM乙酰胆碱氯化物，还包括5U/mL胆碱氧化酶，所述荧光探针为20μg/mLDHR123和0.1μM RhB。

作为优选方案，以上所述荧光探针中，DHR123(二氢罗丹明123)作为过氧化氢的荧光探针，使用RhB(罗丹明B)作为内部荧光标准物。

作为优选方案，以上所述的使用电化学工作站在银丝和氧化铟锡电极上施加电压0.3V-1.2V。

作为优选方案，以上所述电化学工作站检测背景电流，毛细管向下移动，监测到电流增加时停止向下移动，然后，毛细管向上移动，使所述酶活性测定溶液微滴留在氧化铟锡电极表面。

作为优选方案，记录绿色和红色荧光图像，分析图像中的荧光比率，通过荧光比率和过氧化氢含量的线性关系，计算出不同荧光比率对应的过氧化氢的浓度，从而计算出酶的活性。

本发明提供一种酶活性的检测方法，使用以上所述的酶活性检测检测系统，具体包括以下步骤：将酶活性测定溶液滴于待测样品上，酶活性测定溶液与待测酶反应，通过检测荧光强度，可计算酶活性。

作为优选方案，以上所述待测样品可为包含待测酶的模拟切片，所述模拟切片的制备方法为：氧化铟锡电极(ITO)浸泡在2.5％戊二醛(10mM PBS,pH 7.4)溶液中30min，再浸泡在乙酰胆碱酯酶(10mM PBS,pH 7.4)溶液中60min，在35℃烘箱中烘20-40min。

作为优选方案，所述氧化铟锡电极(ITO)浸泡在乙酰胆碱酯酶(10mM PBS,pH 7.4)时，所述乙酰胆碱酯酶的酶含量的浓度为，1u/ml,5u/ml或15u/ml。

作为优选方案，以上所述待测样品可为冷冻的小鼠脑切片，从毛细管释放细胞大小的微滴，在组织的特定位置形成微米试剂盒，对小鼠脑切片组织酶活性进行测定。

作为优选方案，以上所述待测样品可为冷冻的小鼠脑切片，所检测的组织酶包括氧化酶和氧化酶。

作为优选方案，以上所述的水解酶为乙酰胆碱酯酶，所述氧化酶为葡萄糖氧化酶或胆碱氧化酶。

本发明用激光微电极拉制仪将一根硅酸盐毛细管拉制出一端开口约1μm的尖端。毛细管中装有生理缓冲液(10mM PBS，pH 7.4)，其中含有用于测定酶活性的所有酶活性测定溶液。将银丝放置在毛细管内，使用电化学工作站在银丝和ITO载玻片之间施加1.2V的电压。收集背景电流后，毛细管向下移动，直到观察到电流增加为止。在这种条件下，酶活性测定溶液微滴与ITO表面接触。然后，毛细管向上移动，使微滴留在ITO表面，电流下降。形成微米级别的试剂盒。

有益效果：本发明提供的单细胞酶活性检测检测系统及其检测方法和现有技术相比具有以下优点：

1.利用按需滴注形成微米级别的试剂盒，可以在组织上达到单细胞分辨的酶活性检测。这可以帮助阐明组织水平上的酶异质性。

2.克服了干态滴注微米级的液滴的技术困难，解决了目前分析单个培养细胞的酶活性并不能代表真实器官或组织中的互联的细胞行为的问题。

3.本发明实现了在组织上形成按需滴注的微米级别试剂盒的功能，以单细胞分辨率测量脑切片上的乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性。确定切片上AChE的活性范围，表明了AChE活性在组织中的分布是不均匀的。与现有的单细胞分析相比，组织中单个细胞的分析可以提供更接近真实生理状态的信息。这可以帮助阐明组织水平上的酶异质性。

4.采用罗丹明B(RhB)作为内标染料，和检测反应物的二氢罗丹明123(DHR123)协同作用，使得检测结果准确度高，可重复性高。

附图说明

图1.ITO玻片上，测定AChE活性的试剂盒反应的微米级试剂盒的图像：(A)明场；(B)微米级试剂盒中绿色和红色荧光的比率。

图2.微米级试剂盒的统计荧光比，(a)乙酰胆碱氯化物，胆碱氧化酶，DHR123和RhB；(b)胆碱氧化酶，DHR123和RhB；(c)乙酰胆碱氯化物，DHR123和RhB；(d)DHR123和RhB。

图3微滴覆盖模拟切片的25个区域中酶活性性，(a)乙酰胆碱酯酶的活性，(b)葡萄糖氧化酶的活性，(c)胆碱氧化酶的活性。

图4.来自大脑切片的25个微米级试剂盒的(A)明场；(B)绿色荧光图像；(C)红色荧光图像；(D)绿色和红色荧光之比的图像。

图5.微米级试剂盒的统计荧光比(a)乙酰胆碱氯化物，胆碱氧化酶，DHR123和RhB；(b)胆碱氧化酶，DHR123和RhB；(c)乙酰胆碱氯化物，DHR123和RhB；(d)DHR123和RhB。

图6.在微滴覆盖小鼠大脑切片的25个细胞区域中AChE的活性。

图7.单个染料和两个染料的实验对比。

图8.标准样品的检测及标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例，仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例一：制备酶活性检测检测系统。

用激光微电极拉制仪将一根硅酸盐毛细管拉制出一端开口约1μm的尖端。毛细管中装有生理缓冲液(10mM PBS，pH 7.4)，其中含有用于测定酶活性的酶活性测定溶液。将银丝放置在毛细管内，使用电化学工作站在银丝和ITO载玻片之间施加1.2V的电压。收集背景电流后，毛细管向下移动，直到观察到电流增加为止。在这种条件下，微滴与ITO表面接触。然后，毛细管向上移动，使微滴留在ITO表面，电流下降，形成微米级别的试剂盒。

实施例二：检测单个荧光燃料和罗丹明B作为内标的双荧光染料的对照实验。

对于毛细管中没有加底物的时候，在模拟切片上一次性形成9个微滴：1.当只有DHR123时，3次实验的相对标准偏差分别为20.76％，32.72％，27.02％(大于10％)；2.当含有DHR123和RhB时，3次实验的相对标准偏差分别为5.21％，3.45％，4.74％(小于10％，重复性更好)

实验表明，罗丹明B作为内标的双荧光染料检测结果重复性好。

实施例三：标准曲线的测定

利用已知不同浓度的过氧化氢(0mM，1mM,2mM，5mM，10mM，15mM)和DHR123+RhB混合，一次性形成25个微滴，记录荧光强度比，形成标准曲线。然后检测模拟切片和脑组织切片的酶的荧光强度比，可以得到对应的过氧化氢浓度；

先检测空白对照(C₂)，再检测样品(C₁)，防止空气中的氧气对计算结果造成误差。

浓度一：毛细管中含有乙酰胆碱氯化物，胆碱氧化酶，DHR123和RhB，对模拟切片形成微滴的荧光强度比平均值。

0.1267C₁+0.41225＝1.35

浓度二：毛细管中含有胆碱氧化酶、DHR123和RhB，对模拟切片形成微滴的荧光强度比平均值，即空白对照，为了防止空气中氧气氧化DHR123造成误差。

0.1267C₂+0.41225＝0.46

C₁-C₂＝7.0245mM＝C_H2O2

R＝16*10^-6m,h＝7*10^-6m(测量微滴的尺寸，R为微滴半径，h为微滴的高度)

其中微滴尺寸R的测量，通过显微镜成像，拍照后，通过标尺的比例计算。h是通过显微镜分别聚焦液滴的最上端和最低端，看调焦旋钮在定焦最上端和最下端时转了几圈，然后通过在一块干净玻片上下两面聚焦，看调焦旋钮旋转几圈，通过游标卡尺测量该玻片厚度，通过比例得到h。

酶活性计算公式，其中，V是液滴体积，C_H2O2是液滴中过氧化氢浓度，2是因为一分子胆碱生成2分子过氧化氢，2.25min是反应时间。

实施例四：检测模拟切片的乙酰胆碱酯酶活性。

检测方法具体和实施例三相同。模拟切片也要扣除空白，为了一致，利用毛细管中只含胆碱氧化酶和DHR123+RhB进行及检测作为空白独照。

检测模拟切片的乙酰胆碱酯酶活性。制备模拟切片：先将清洗干净的氧化铟锡电极(ITO)浸泡在2.5％戊二醛(10mM PBS,pH 7.4)溶液中30min，再浸泡在5U/mL乙酰胆碱酯酶(10mM PBS,pH 7.4)溶液中60min，在35℃烘箱中烘30min。毛细管充满生理缓冲液(10mMPBS，pH 7.4)，其中含有75mM乙酰胆碱氯化物，5U/mL胆碱氧化酶，20μg/mL DHR123和0.1μMRhB，悬浮在载玻片上方。根据需要在ITO表面形成25个细胞大小的微滴后，其中的试剂盒成分与AChE反应生成过氧化氢。使用DHR123作为过氧化氢的荧光探针，并使用RhB作为内部荧光标准物。分别使用不同滤光片和EM CCD(Electron-Multiplying Charge coupledDevice电子倍增CCD,电荷耦合元件，也可以称为电子倍增CCD图像传感器)记录绿色和红色荧光图像。使用ImageJ软件分析图像中来自这些微米试剂盒的荧光比率。通过荧光比率和过氧化氢含量的线性关系，计算出不同荧光比率对应的过氧化氢的浓度，从而计算出酶的活性。

为了检测ITO玻片上的AChE活性，在其表面上构建了25个含乙酰胆碱氯化物，胆碱氧化酶，DHR123和RhB的微米级别的试剂盒(图1A)。反应1分钟后，分别记录Rh123和RhB的绿色和红色荧光。计算荧光比，在图1B中示出。与没有AChE区域的背景比率相比，观察到比率增加了约3倍，这表明AChE与试剂盒组件之间发生了反应(图2)。从毛细管中的溶液中除去乙酰胆碱氯化物或胆碱氧化酶时，荧光比接近背景值。所有这些结果证实，可以使用微试剂盒测量AChE的活性。图3列出了来自ITO载玻片上25个微米试剂盒的AChE活性。测得的平均活性为3.5nU(等于1.2mU/cm2)。这25个微米试剂盒的相对标准偏差为16.5％，在ITO玻片上的AChE活性测量中显示出良好的可重复性。

实施例五：检测模拟切片的胆碱氧化酶和葡萄糖氧化酶的活性

制备模拟切片：先将清洗干净的氧化铟锡电极(ITO)浸泡在2.5％戊二醛(10mMPBS,pH 7.4)溶液中30min，再浸泡在5U/mL胆碱氧化酶或者15U/mL葡萄糖氧化酶(10mMPBS,pH 7.4)溶液中60min，在35℃烘箱中烘20-40min。检测方法除酶反应物分别为检测胆碱氧化酶活性时为胆碱，检测葡萄糖氧化酶为葡萄糖之外，其他具体步骤和实施例三相同，检测结果见图3(b)葡萄糖氧化酶，(c)胆碱氧化酶。

实施例六：检测小鼠大脑切片的乙酰胆碱酯酶活性。

检测方法具体和实施例三相同。大脑组织切片需要扣除的是组织中的胆碱和胆碱氧化酶反应生成的过氧化氢以及空气中的氧气造成的影响，空白对照检测同样是利用毛细管中只含胆碱氧化酶和DHR123+RhB进行及检测。

使用冷冻的小鼠脑切片进行分析单细胞分辨的酶活性。通过从微毛细管释放细胞大小的微滴，在组织的特定位置形成微米试剂盒，其中的试剂盒成分与细胞的AChE反应生成过氧化氢。使用DHR123作为过氧化氢的荧光探针，并使用RhB作为内部荧光标准物。分别使用不同滤光片和EM CCD(Electron-Multiplying Charge coupled Device电子倍增CCD,电荷耦合元件，也可以称为电子倍增CCD图像传感器)记录绿色和红色荧光图像。使用ImageJ软件分析图像中来自这些微米试剂盒的荧光比率。通过荧光比率和过氧化氢含量的线性关系，计算出不同荧光比率对应的过氧化氢的浓度，从而计算出酶的活性。

冷冻的脑组织的明场图像显示在图4中。将微滴滴到组织中的神经元上后，分别记录了来自组织中Rh123和RhB的绿色和红色荧光(图4B和4C)。这些微滴的尺寸在17±5μm的范围内，略小于ITO载玻片上的微滴的尺寸。微滴尺寸的相对较大偏差应归因于组织处的复杂表面状况。使用这两个荧光强度之间的比率，可以清晰地观察到组织中各个微米试剂盒的荧光信号(图4D)，并达到了单细胞分辨率显示组织中AChE的活性。由于胆碱存在于细胞中，因此仅在毛细管中进行包括胆碱氧化酶的对照实验。平均荧光强度显示在图5中。计算出的平均荧光强度比为0.65，大于DHR123和RhB之间的背景比(0.38)，证实了胆碱氧化酶与神经元内部胆碱之间的反应。但是，该值明显小于在乙酰胆碱氯化物存在下的测量值(1.55)。因此，在组织上从微米试剂盒中观察到了更高的荧光比，表明可以测量AChE活性。计算出这些区域的酶活性范围为0.18至2.5mU/cm²，如图6所示，从微米试剂盒的组织切片测得的相对标准偏差为73.3％，表明AChE活性高度异质性。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来书，在不脱离本发明的原理的前提下，还可以作数若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于检测组织中单细胞的酶活性的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括：毛细管，银丝和氧化铟锡电极，所述毛细管中装有酶活性测定溶液，其中，将一根硅酸盐毛细管拉制出一端开口约1 μm的尖端，所述银丝浸没在所述酶活性测定溶液中，银丝和氧化铟锡电极通过电化学工作站连接，

电化学工作站在银丝和氧化铟锡电极上集中施加电压并检测电流，通过检测的电流信号控制毛细管向下移动，使所述酶活性测定溶液微滴留在氧化铟锡电极表面，形成试剂盒，酶活性测定溶液与酶反应，通过检测荧光强度，计算酶活性；

其中所述酶为乙酰胆碱酯酶，葡萄糖氧化酶或胆碱氧化酶；

所述酶活性测定溶液为生理缓冲液，其中含有酶反应物和荧光探针，所述荧光探针为二氢罗丹明123和罗丹明B，所述酶反应物为乙酰胆碱氯化物和胆碱氧化酶的组合、胆碱或葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的用于检测组织中单细胞的酶活性的检测系统，其特征在于，所述生理缓冲液为10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，其中含有所述酶反应物为75 mM乙酰胆碱氯化物，和5 U/mL胆碱氧化酶，所述荧光探针为20 μg/mL二氢罗丹明123和0.1 μM罗丹明B。

3.根据权利要求1所述的用于检测组织中单细胞的酶活性的检测系统，其特征在于，所述生理缓冲液为10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，其中含有所述酶反应物为75 mM胆碱，所述荧光探针为20 μg/mL二氢罗丹明123和0.1 μM罗丹明B。

4.根据权利要求1所述的用于检测组织中单细胞的酶活性的检测系统，其特征在于，所述生理缓冲液为10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，其中含有所述酶反应物为75 mM葡萄糖，所述荧光探针为20 μg/mL二氢罗丹明123和0.1 μM罗丹明B。

5.权利要求1所述的检测系统在检测脑组织中单细胞的酶的酶活性中的应用，其中所述酶为乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶或胆碱氧化酶。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：使用如权利要求1所述的检测系统，将酶活性测定溶液滴于待测样品上，酶活性测定溶液与酶发生反应，通过检测荧光强度，记录分析图像中的荧光比率，通过荧光比率和过氧化氢含量的线性关系，计算出不同荧光比率对应的过氧化氢的浓度，从而计算出酶的活性。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用电化学工作站在银丝和氧化铟锡电极上集中施加电压为0.3-1.2V。