CN101246141A - 快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，是一种基于检测酶反应产物在电极表面产生的氧化信号来定性检测周围神经束中乙酰胆碱酯酶的电化学检测方法。它首先采用聚合物-金纳米粒子复合物修饰电极，然后依次在胆碱氧化酶和乙酰胆碱酯酶溶液中孵育，通过复合物膜对蛋白质良好的吸附力，使两种酶在电极表面富集，通过三电极系统，基于双酶体系测定底物乙酰胆碱的安培响应，从而间接实现对乙酰胆碱酯酶的检测(检测浓度范围：1.0－2.0unit/mL)。用神经组织匀浆代替标准乙酰胆碱酯酶溶液进行孵育，通过对乙酰胆碱是否有响应的检测，实现了对运动束和感觉束的快速鉴别，是一种在临床鉴别周围神经束性质领域的突破。
Description
技术领域
本发明涉及周围神经束性质的电化学鉴别方法。
背景技术
在周围神经损伤后的神经修复中(如断肢再植)，难点之一是手术中不能正确分辨出神经干内运动束与感觉束，现有的缝合方法如神经外膜和神经束膜缝合法，由于不能实现两断端相同神经束正确缝合，严重影响了患者的神经功能恢复，若能实现神经两断端感觉束对感觉束。运动束对运动束的正确缝合，将极大提高神经功能恢复率。目前采用的酶组织化学法，根据运动束和感觉束中一种神经递质酶——乙酰胆碱酯酶的含量差别，作为鉴别运动束与感觉束的标准。检测乙酰胆碱酯酶主要为酶组织化学染色法，根据反应形成亚铁氰化铜(一种棕色沉淀)出现于酶活性部位，运动纤维呈强阳性，感觉纤维大部分呈阴性，少部分呈弱阳性的原理，对神经束性质进行判定。然而此法染色时间长，过程复杂，且不能进行原位染色，故临床应用也受到一定限制。
近年来，电化学技术因其简便快捷，准确灵敏及选择性好等特点，在环境监测，食品工业和临床分析等领域受到了广泛关注。在临床生物化学检验领域，电化学技术已经成功应用于代谢物，如葡萄糖和激素的测定，以及大分子，如细胞和蛋白质的检测；而微型化电极在电活性神经递质的体外和在体检测方面，也很有研究价值。在电化学家的努力下，检测未知生物样品中的乙酰胆碱酯酶已经实现，实时监测也指日可待。由此可见，电化学技术与生命科学的结合推动了电化学传感器在临床分析中的应用，并取得了不俗的进展。
目前，提高电化学传感器性能的焦点集中在电极材料的选择和表面修饰方面。很多先进材料，如纳米材料，高分子聚合物材料，因其具有特殊的物理化学性质，已被应用于电极的制备和表面修饰，并在化学传感器和纳米器件的构建中展示了良好的应用前景。而表面科学技术与电化学技术相结合制备成化学修饰电极，其潜在的应用价值也引起了科学界广泛的研究兴趣，推进了近20年来电化学生物传感器的迅速发展。
因此，将电化学技术与纳米技术、表面科学相结合，制备高性能的电化学生物传感器，并将其应用于手术中快速鉴别周围神经束性质，可提高周围神经损伤修复后的功能恢复率，给广大患者带来福音。
发明内容
一种快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，它由下列步骤组成：
步骤1.将金电极在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用，
步骤2.将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％聚二甲基二烯丙基胺(重均分子量～100000-20000)水溶液，聚二甲基硅氧烷(重均分子量～60000)和固化剂(Si-H官能交联剂)滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000～2500转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化，
步骤3.将步骤2修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有质量百分浓度为0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面，
步骤4.将步骤3修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面。
步骤5.将步骤4修饰好的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面。
步骤6.将步骤5修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连，
步骤7.在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应，
步骤8.分别用1.0，1.1，1.3，1.5，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0和10.0unit/mL标准浓度乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5步骤，采用origin作图。由于孵育溶液中乙酰胆碱酯酶浓度直接影响电极对乙酰胆碱的响应，得到0.7V下氧化电流变化与乙酰胆碱酯酶浓度的对应关系。
步骤9.将神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用，取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水，
步骤10.将步骤9中得到神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000～20000转/分钟，0～4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000～20000转/分钟，0～4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀。
步骤11.用步骤10制备得到的神经匀浆代替乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶，从而进一步鉴别周围神经束的性质(有明显响应证实为运动神经束，无明显响应则为感觉神经束)。
本发明采用了一种生物相容性好，稳定性良好且价格低廉的高分子聚合物材料，聚二甲基硅氧烷，作为修饰电极的材料。通过掺杂聚二烯丙基二甲基胺和原位合成金纳米粒子，这种聚合物-金纳米粒子复合薄膜显示了对蛋白质极好的吸附性能，可连续吸附多种蛋白质。对于乙酰胆碱酯酶的检测可以通过电化学监测酶反应产物的氧化电流变化实现。胆碱氧化酶/乙酰胆碱酯酶双酶体系催化底物反应过程如下：
乙酰胆碱酯酶催化神经递质乙酰胆碱水解，生成醋酸盐和胆碱。随后，胆碱在氧气存在的环境中，被胆碱氧化酶的催化生成过氧化氢。通过监测过氧化氢在+0.7V(vs.饱和甘汞电极)的条件下的氧化电流，可实现对乙酰胆碱的检测。而由于溶液中乙酰胆碱酯酶浓度不同，相同条件下吸附在电极表面的酶的量也不同，通过对于底物乙酰胆碱的检测，可测定溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度，或判断组织匀浆溶液中是否含有乙酰胆碱酯酶。传感器制备过程如图1所示。
对标准溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度进行了检测，并做出标准曲线。图3中乙酰胆碱酯酶在1.0unit/mL到2.0unit/mL浓度范围内与乙酰胆碱响应的安培电流呈线性关系。对Beagle狗神经组织匀浆进行了检测，如图4所示，修饰电极在运动神经组织匀浆中孵育后，经电化学测定对乙酰胆碱有明显的安培响应(曲线a)，而在感觉神经组织匀浆中孵育后，对乙酰胆碱基本没有响应(曲线b)。对24根Beagle狗神经束进行了鉴别，准确率达到91.7％，与常规Kamovsky-Roots酶组织染色法和Fuminori酶组织染色法得到的结果对比，电化学方法准确率较高，结果列于表1中。这个实验说明这种方法可将运动神经和感觉神经有效地区分开来，有着良好的临床应用前景。
本发明的具体效果如下：本发明方法采用生物相容性好，稳定性良好且价格低廉的聚合物材料修饰金电极，提高了传感器的稳定性，并降低了成本；在聚合物薄膜表面原位合成金纳米粒子，制备的聚合物-纳米粒子复合材料对蛋白质有很强的吸附力，简化了检测乙酰胆碱酯酶的步骤；选择纯绿色试剂，确保了无污染检测；成功对狗神经组织匀浆中的乙酰胆碱酯酶进行定性检测，实现了对周围神经束性质的快速鉴别。
附图说明
图1为本方法制备乙酰胆碱酯酶传感器主要过程。
图2为三电极电化学系统的构造示意图。图中：1，磁力搅拌器；2，电化学检测池；3，磁力搅拌子；4，电化学工作电极；5，电化学参比电极；6，电化学对电极；7，电化学工作站；8，计算机。
图3为聚合物/金纳米粒子/胆碱氧化酶修饰电极检测乙酰胆碱酯酶的标准曲线，插图为部分标准曲线的放大图。
图4为聚合物/金纳米粒子/胆碱氧化酶修饰电极在Beagle狗运动神经(a)和感觉神经(b)组织匀浆孵育10min后，对0.2mM乙酰胆碱的安培响应。
具体实施方式：
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。
实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用试剂包括胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶、氯化乙酰胆碱、聚二烯丙基二甲基胺、聚二甲基硅氧烷和氯金酸等均为光谱纯或分析纯试剂。检测溶液均采用0.1M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
实施例1a.
实验前先将金盘电极(4)在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用。
1.修饰电极过程中，首先将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％聚二甲基二烯丙基胺水溶液(重均分子量100000，Aldrich公司)，聚二甲基硅氧烷(重均分子量60000)和固化剂(Sylgard 184 Dow Coming公司)滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化。
2.将修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有质量百分浓度为0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面。
3.将修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面。
4.然后，将修饰了聚合物/金纳米粒子/胆碱氧化酶的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面。
5.检测时，首先将电化学检测池(2)中放一粒磁力搅拌子(3)，置于磁力搅拌器(1)上。将修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连(见图2)，在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应。
6.分别用1.0，1.1，1.3，1.5，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0，10.0unit/mL标准浓度乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5步骤，采用origin作图。由于孵育溶液中乙酰胆碱酯酶浓度浓度直接影响电极对乙酰胆碱的响应，得到0.7V下氧化电流变化与乙酰胆碱酯酶浓度的线性关系标准曲线(图3)。
实施例1b.
实验前先将金盘电极(4)在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用。
1.修饰电极过程中，首先将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％聚二甲基二烯丙基胺(重均分子量20000，Aldrich公司)水溶液，聚二甲基硅氧烷(重均分子量60000)和固化剂(Sylgard 184 Dow Corning公司)滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2500转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化。
其它步骤同实施例1a，得到的结果与实施例1a完全相同。
实施例2.
1.将Beagle犬分次麻醉后处死，立即从后背正中将椎管打开，取从硬膜外到脊神经根管入口这一段走行的T12-S2脊神经的前根和后根(前根为运动神经，后根为感觉神经)，将每一条犬的两类神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用。取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水。
2.将一根神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀。
3.用步骤2制备得到的神经匀浆代替实施例乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复实施例1的步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来定性判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶(图4)，从而进一步鉴别周围神经束的性质。
实施例3.
1.取24根神经标本，重复实施例2的步骤2，3，对神经束性质进行鉴别。
2.将鉴别结果与常规Karnovsky-Roots酶组织染色法，Fuminori酶组织染色法得到的鉴别结果进行对照(表1)。
表1.电化学传感器法，Karnovsky-Roots酶组织染色法，Fuminori酶组织染色法的鉴别Beagle狗周围神经束性质的成功率。
| 样品数量 | ||||
| 方法 | 正确数量 | 错误数量 | 总数 | 正确率 |
| 电化学传感器法 | 22 | 2 | 24 | 91.7％ |
| K-R酶组织染色法 | 39 | 9 | 48 | 81.3％ |
| Fuminori酶组织染色法 | 44 | 4 | 48 | 91.7％ |
Claims (2)
1.一种快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，它由下列步骤组成：
步骤1.将金电极在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用，
步骤2.将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％重均分子量为100000-20000的聚二甲基二烯丙基胺水溶液，重均分子量为60000的聚二甲基硅氧烷和Si-H官能交联剂的固化剂滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化，
步骤3.将步骤2修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面，
步骤4.将步骤2修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面，
步骤5.将步骤4修饰好的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面，
步骤6.将步骤5修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连，
步骤7.在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应，
步骤8.分别用不同标准浓度的乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5和7步骤，采用origin作图，
步骤9.将神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用，取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水，
步骤10.将步骤9中得到神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀，
步骤11.用步骤10制备得到的神经匀浆代替乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶，从而进一步鉴别周围神经束的性质。
2.根据权利要求1所述的周围神经束性质的电化学检测方法，其特征是：所述的乙酰胆碱酯酶溶液标准浓度溶液的检测浓度范围为1.0-2.0unit/mL。
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