CN101246141A - 快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 - Google Patents
快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101246141A CN101246141A CNA2008100207571A CN200810020757A CN101246141A CN 101246141 A CN101246141 A CN 101246141A CN A2008100207571 A CNA2008100207571 A CN A2008100207571A CN 200810020757 A CN200810020757 A CN 200810020757A CN 101246141 A CN101246141 A CN 101246141A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- acetylcholinesterase
- solution
- peripheral nerve
- nerve bundle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 title 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims abstract description 43
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108010000659 Choline oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 claims description 14
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N Alumina Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 8
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 7
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 229920005573 silicon-containing polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 241001481789 Rupicapra Species 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000010985 leather Substances 0.000 claims description 4
- GBCKRQRXNXQQPW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(C)CC=C GBCKRQRXNXQQPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 claims description 4
- SJUCACGNNJFHLB-UHFFFAOYSA-N O=C1N[ClH](=O)NC2=C1NC(=O)N2 Chemical compound O=C1N[ClH](=O)NC2=C1NC(=O)N2 SJUCACGNNJFHLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 abstract description 12
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 abstract description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 8
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 7
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 2
- ZUHZZVMEUAUWHY-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CCCN(C)C ZUHZZVMEUAUWHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical class Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 1
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000001032 spinal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，是一种基于检测酶反应产物在电极表面产生的氧化信号来定性检测周围神经束中乙酰胆碱酯酶的电化学检测方法。它首先采用聚合物-金纳米粒子复合物修饰电极，然后依次在胆碱氧化酶和乙酰胆碱酯酶溶液中孵育，通过复合物膜对蛋白质良好的吸附力，使两种酶在电极表面富集，通过三电极系统，基于双酶体系测定底物乙酰胆碱的安培响应，从而间接实现对乙酰胆碱酯酶的检测(检测浓度范围：1.0－2.0unit/mL)。用神经组织匀浆代替标准乙酰胆碱酯酶溶液进行孵育，通过对乙酰胆碱是否有响应的检测，实现了对运动束和感觉束的快速鉴别，是一种在临床鉴别周围神经束性质领域的突破。
Description
技术领域
本发明涉及周围神经束性质的电化学鉴别方法。
背景技术
在周围神经损伤后的神经修复中(如断肢再植)，难点之一是手术中不能正确分辨出神经干内运动束与感觉束，现有的缝合方法如神经外膜和神经束膜缝合法，由于不能实现两断端相同神经束正确缝合，严重影响了患者的神经功能恢复，若能实现神经两断端感觉束对感觉束。运动束对运动束的正确缝合，将极大提高神经功能恢复率。目前采用的酶组织化学法，根据运动束和感觉束中一种神经递质酶——乙酰胆碱酯酶的含量差别，作为鉴别运动束与感觉束的标准。检测乙酰胆碱酯酶主要为酶组织化学染色法，根据反应形成亚铁氰化铜(一种棕色沉淀)出现于酶活性部位，运动纤维呈强阳性，感觉纤维大部分呈阴性，少部分呈弱阳性的原理，对神经束性质进行判定。然而此法染色时间长，过程复杂，且不能进行原位染色，故临床应用也受到一定限制。
近年来，电化学技术因其简便快捷，准确灵敏及选择性好等特点，在环境监测，食品工业和临床分析等领域受到了广泛关注。在临床生物化学检验领域，电化学技术已经成功应用于代谢物，如葡萄糖和激素的测定，以及大分子，如细胞和蛋白质的检测；而微型化电极在电活性神经递质的体外和在体检测方面，也很有研究价值。在电化学家的努力下，检测未知生物样品中的乙酰胆碱酯酶已经实现，实时监测也指日可待。由此可见，电化学技术与生命科学的结合推动了电化学传感器在临床分析中的应用，并取得了不俗的进展。
目前，提高电化学传感器性能的焦点集中在电极材料的选择和表面修饰方面。很多先进材料，如纳米材料，高分子聚合物材料，因其具有特殊的物理化学性质，已被应用于电极的制备和表面修饰，并在化学传感器和纳米器件的构建中展示了良好的应用前景。而表面科学技术与电化学技术相结合制备成化学修饰电极，其潜在的应用价值也引起了科学界广泛的研究兴趣，推进了近20年来电化学生物传感器的迅速发展。
因此，将电化学技术与纳米技术、表面科学相结合，制备高性能的电化学生物传感器，并将其应用于手术中快速鉴别周围神经束性质，可提高周围神经损伤修复后的功能恢复率，给广大患者带来福音。
发明内容
一种快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，它由下列步骤组成：
步骤1.将金电极在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用，
步骤2.将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％聚二甲基二烯丙基胺(重均分子量～100000-20000)水溶液，聚二甲基硅氧烷(重均分子量～60000)和固化剂(Si-H官能交联剂)滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000～2500转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化，
步骤3.将步骤2修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有质量百分浓度为0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面，
步骤4.将步骤3修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面。
步骤5.将步骤4修饰好的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面。
步骤6.将步骤5修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连，
步骤7.在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应，
步骤8.分别用1.0，1.1，1.3，1.5，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0和10.0unit/mL标准浓度乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5步骤，采用origin作图。由于孵育溶液中乙酰胆碱酯酶浓度直接影响电极对乙酰胆碱的响应，得到0.7V下氧化电流变化与乙酰胆碱酯酶浓度的对应关系。
步骤9.将神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用，取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水，
步骤10.将步骤9中得到神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000～20000转/分钟，0～4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000～20000转/分钟，0～4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀。
步骤11.用步骤10制备得到的神经匀浆代替乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶，从而进一步鉴别周围神经束的性质(有明显响应证实为运动神经束，无明显响应则为感觉神经束)。
本发明采用了一种生物相容性好，稳定性良好且价格低廉的高分子聚合物材料，聚二甲基硅氧烷，作为修饰电极的材料。通过掺杂聚二烯丙基二甲基胺和原位合成金纳米粒子，这种聚合物-金纳米粒子复合薄膜显示了对蛋白质极好的吸附性能，可连续吸附多种蛋白质。对于乙酰胆碱酯酶的检测可以通过电化学监测酶反应产物的氧化电流变化实现。胆碱氧化酶/乙酰胆碱酯酶双酶体系催化底物反应过程如下：
乙酰胆碱酯酶催化神经递质乙酰胆碱水解，生成醋酸盐和胆碱。随后，胆碱在氧气存在的环境中，被胆碱氧化酶的催化生成过氧化氢。通过监测过氧化氢在+0.7V(vs.饱和甘汞电极)的条件下的氧化电流，可实现对乙酰胆碱的检测。而由于溶液中乙酰胆碱酯酶浓度不同，相同条件下吸附在电极表面的酶的量也不同，通过对于底物乙酰胆碱的检测，可测定溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度，或判断组织匀浆溶液中是否含有乙酰胆碱酯酶。传感器制备过程如图1所示。
对标准溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度进行了检测，并做出标准曲线。图3中乙酰胆碱酯酶在1.0unit/mL到2.0unit/mL浓度范围内与乙酰胆碱响应的安培电流呈线性关系。对Beagle狗神经组织匀浆进行了检测，如图4所示，修饰电极在运动神经组织匀浆中孵育后，经电化学测定对乙酰胆碱有明显的安培响应(曲线a)，而在感觉神经组织匀浆中孵育后，对乙酰胆碱基本没有响应(曲线b)。对24根Beagle狗神经束进行了鉴别，准确率达到91.7％，与常规Kamovsky-Roots酶组织染色法和Fuminori酶组织染色法得到的结果对比，电化学方法准确率较高，结果列于表1中。这个实验说明这种方法可将运动神经和感觉神经有效地区分开来，有着良好的临床应用前景。
本发明的具体效果如下：本发明方法采用生物相容性好，稳定性良好且价格低廉的聚合物材料修饰金电极，提高了传感器的稳定性，并降低了成本；在聚合物薄膜表面原位合成金纳米粒子，制备的聚合物-纳米粒子复合材料对蛋白质有很强的吸附力，简化了检测乙酰胆碱酯酶的步骤；选择纯绿色试剂，确保了无污染检测；成功对狗神经组织匀浆中的乙酰胆碱酯酶进行定性检测，实现了对周围神经束性质的快速鉴别。
附图说明
图1为本方法制备乙酰胆碱酯酶传感器主要过程。
图2为三电极电化学系统的构造示意图。图中：1，磁力搅拌器；2，电化学检测池；3，磁力搅拌子；4，电化学工作电极；5，电化学参比电极；6，电化学对电极；7，电化学工作站；8，计算机。
图3为聚合物/金纳米粒子/胆碱氧化酶修饰电极检测乙酰胆碱酯酶的标准曲线，插图为部分标准曲线的放大图。
图4为聚合物/金纳米粒子/胆碱氧化酶修饰电极在Beagle狗运动神经(a)和感觉神经(b)组织匀浆孵育10min后，对0.2mM乙酰胆碱的安培响应。
具体实施方式：
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。
实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用试剂包括胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶、氯化乙酰胆碱、聚二烯丙基二甲基胺、聚二甲基硅氧烷和氯金酸等均为光谱纯或分析纯试剂。检测溶液均采用0.1M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
实施例1a.
实验前先将金盘电极(4)在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用。
1.修饰电极过程中，首先将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％聚二甲基二烯丙基胺水溶液(重均分子量100000，Aldrich公司)，聚二甲基硅氧烷(重均分子量60000)和固化剂(Sylgard 184 Dow Coming公司)滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化。
2.将修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有质量百分浓度为0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面。
3.将修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面。
4.然后，将修饰了聚合物/金纳米粒子/胆碱氧化酶的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面。
5.检测时，首先将电化学检测池(2)中放一粒磁力搅拌子(3)，置于磁力搅拌器(1)上。将修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连(见图2)，在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应。
6.分别用1.0，1.1，1.3，1.5，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0，10.0unit/mL标准浓度乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5步骤，采用origin作图。由于孵育溶液中乙酰胆碱酯酶浓度浓度直接影响电极对乙酰胆碱的响应，得到0.7V下氧化电流变化与乙酰胆碱酯酶浓度的线性关系标准曲线(图3)。
实施例1b.
实验前先将金盘电极(4)在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用。
1.修饰电极过程中，首先将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％聚二甲基二烯丙基胺(重均分子量20000，Aldrich公司)水溶液，聚二甲基硅氧烷(重均分子量60000)和固化剂(Sylgard 184 Dow Corning公司)滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2500转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化。
其它步骤同实施例1a，得到的结果与实施例1a完全相同。
实施例2.
1.将Beagle犬分次麻醉后处死，立即从后背正中将椎管打开，取从硬膜外到脊神经根管入口这一段走行的T12-S2脊神经的前根和后根(前根为运动神经，后根为感觉神经)，将每一条犬的两类神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用。取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水。
2.将一根神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀。
3.用步骤2制备得到的神经匀浆代替实施例乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复实施例1的步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来定性判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶(图4)，从而进一步鉴别周围神经束的性质。
实施例3.
1.取24根神经标本，重复实施例2的步骤2，3，对神经束性质进行鉴别。
2.将鉴别结果与常规Karnovsky-Roots酶组织染色法，Fuminori酶组织染色法得到的鉴别结果进行对照(表1)。
表1.电化学传感器法，Karnovsky-Roots酶组织染色法，Fuminori酶组织染色法的鉴别Beagle狗周围神经束性质的成功率。
| 样品数量 | ||||
| 方法 | 正确数量 | 错误数量 | 总数 | 正确率 |
| 电化学传感器法 | 22 | 2 | 24 | 91.7％ |
| K-R酶组织染色法 | 39 | 9 | 48 | 81.3％ |
| Fuminori酶组织染色法 | 44 | 4 | 48 | 91.7％ |
Claims (2)
1.一种快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，它由下列步骤组成：
步骤1.将金电极在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用，
步骤2.将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％重均分子量为100000-20000的聚二甲基二烯丙基胺水溶液，重均分子量为60000的聚二甲基硅氧烷和Si-H官能交联剂的固化剂滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化，
步骤3.将步骤2修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面，
步骤4.将步骤2修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面，
步骤5.将步骤4修饰好的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面，
步骤6.将步骤5修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连，
步骤7.在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应，
步骤8.分别用不同标准浓度的乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5和7步骤，采用origin作图，
步骤9.将神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用，取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水，
步骤10.将步骤9中得到神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀，
步骤11.用步骤10制备得到的神经匀浆代替乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶，从而进一步鉴别周围神经束的性质。
2.根据权利要求1所述的周围神经束性质的电化学检测方法，其特征是：所述的乙酰胆碱酯酶溶液标准浓度溶液的检测浓度范围为1.0-2.0unit/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100207571A CN101246141B (zh) | 2008-02-26 | 2008-02-26 | 快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100207571A CN101246141B (zh) | 2008-02-26 | 2008-02-26 | 快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101246141A true CN101246141A (zh) | 2008-08-20 |
| CN101246141B CN101246141B (zh) | 2012-03-14 |
Family
ID=39946716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008100207571A Expired - Fee Related CN101246141B (zh) | 2008-02-26 | 2008-02-26 | 快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101246141B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102375006A (zh) * | 2010-08-13 | 2012-03-14 | 华东师范大学 | 一种Au-TiO2-AChE复合体系及其制备方法和应用 |
| CN113355387A (zh) * | 2020-09-01 | 2021-09-07 | 南京大学 | 一种检测组织中单细胞的酶活性的检测系统及其检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003001194A1 (fr) * | 2001-06-20 | 2003-01-03 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Electrode d'enregistrement extracellulaire |
| CN100344960C (zh) * | 2001-12-17 | 2007-10-24 | 清华大学 | 刺激动物细胞并记录其生理信号的装置及其生产使用方法 |
| CN1161478C (zh) * | 2002-01-09 | 2004-08-11 | 南京医科大学 | 乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器的制法 |
| CN2709979Y (zh) * | 2003-12-25 | 2005-07-13 | 浙江大学 | 用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器 |
-
2008
- 2008-02-26 CN CN2008100207571A patent/CN101246141B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102375006A (zh) * | 2010-08-13 | 2012-03-14 | 华东师范大学 | 一种Au-TiO2-AChE复合体系及其制备方法和应用 |
| CN113355387A (zh) * | 2020-09-01 | 2021-09-07 | 南京大学 | 一种检测组织中单细胞的酶活性的检测系统及其检测方法 |
| CN113355387B (zh) * | 2020-09-01 | 2024-04-30 | 南京大学 | 一种检测组织中单细胞的酶活性的检测系统及其检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101246141B (zh) | 2012-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101980018B (zh) | 用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法 | |
| CN103926294B (zh) | Cs/il-gr修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备及其应用 | |
| CN106525943B (zh) | 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用 | |
| Chen et al. | A dual-responsive biosensor for blood lead detection | |
| US20130153443A1 (en) | Device for measuring proteins using biosensor | |
| CN109557159A (zh) | 一种碳化钛三维复合材料及其制备方法以及在构建凝血酶适体传感器中的应用 | |
| CN107037109A (zh) | 磁分离‑信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法 | |
| Babaei et al. | A sensor for simultaneous determination of dopamine and morphine in biological samples using a multi-walled carbon nanotube/chitosan composite modified glassy carbon electrode | |
| CN109060790B (zh) | 基于羟基氧化钴纳米片的乙酰胆碱酯酶活性检测试纸条及其制备方法 | |
| Pourreza et al. | A novel metal enhanced fluorescence bio probe for insulin sensing based on poly vinyl alcohol-borax hydrogel functionalized by Ag dots | |
| CN106290518B (zh) | 一种用于沙丁胺醇定量检测的分子印迹型电化学传感器及其制备方法 | |
| CN105548297A (zh) | 基于电化学生物传感器的血红蛋白定量检测系统及其检测方法 | |
| CN101246141B (zh) | 快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法 | |
| CN106468682B (zh) | 一种电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法 | |
| CN110227483A (zh) | 一种新型磁性纳米模拟氧化酶及其制备方法和应用 | |
| CN110044987A (zh) | 二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测肌钙蛋白的方法 | |
| CN110044994A (zh) | 一种改变pH洗脱蛋白质的分子印迹水凝胶电极的制备方法 | |
| CN107102052B (zh) | 基于含有活性铜碳点的尿酸电化学传感器及其应用 | |
| CN112179875B (zh) | 一种一型透明质酸酶荧光纳米传感器的制备及应用 | |
| CN104076025A (zh) | 一种抗菌肽电化学发光传感器及其制备方法和检测方法 | |
| CN105866221A (zh) | 可催化还原血红蛋白的电化学传感器 | |
| Xu et al. | Simultaneous voltammetric determination of ascorbic acid, dopamine and uric acid using polybromothymol blue film-modified glassy carbon electrode | |
| CN108802145A (zh) | 一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器及其制备方法 | |
| CN107677715B (zh) | 一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器 | |
| Hu et al. | Electrochemical Sensor for Sensitive Determination of Ga (III) Ion Based on β‐Cyclodextrin Incorporated Multi‐walled Carbon Nanotubes and Imprinted Sol‐gel Composite Film |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120314 Termination date: 20150226 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |