CN102323323B - 一种17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器的制备方法，该方法依次经过电极预处理、纳米铂粒子修饰电极、分子自组装膜修饰电极、电聚合反应以及模板分子洗脱步骤制备得到17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器。本发明制备的分子印记电化学传感器具有选择性高、响应快速、灵敏度高、稳定性和耐受性良好，可实现水样中痕微量17β-雌二醇的高效、灵敏和实时检测，对环境污染物监测有重要意义。

Description

一种17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器的制备方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器的制备方法。

背景技术

随着人类生产活动的发展，大量有害化学物质不断进入人类生活环境中，环境雌激素的残留对人类健康造成很大的危害。早在90年代初，环境雌激素对人类生殖、发育的影响及与激素依赖性肿瘤和自身免疫性疾病等的关系引起社会和医学界的重视。其中内源性雌激素(雌二醇)具有强的生理活性，即使在极低浓度下(大多在ppt～ppb水平或更低)也会对生物产生极大的影响，因此雌二醇的检测与控制已经成为全球性关注的热点问题。我国国家自然科学基金委员会在1997年设立了有关环境雌激素方面的基金项目。

目前，对实际样品中内源性雌激素的检测仍存在着许多困难与挑战。从以下分析可以看出雌二醇在环境中分析难度较大：(1)水质、土壤等样品基体的组成复杂；(2)在环境中的浓度极低；(3)随着现代科技的迅速发展，各种新的检测分析仪器在适用性和灵敏度方面都有很大的提高，特别是带有质谱检测器的气相色谱和液相色谱的普及大大推动了雌二醇检测的进步，但仍需要繁杂样品前处理过程，难以做到快速分离和检测。因此迫切需要建立一种快速、简便、价廉且具有高灵敏度和高选择性的实时检测分析方法。

传感器是一种重要的电子器件，因具设计简单、灵敏度高、价格低廉、且可实现在体检测等优点可满足临床诊断、环境分析、食品分析和产品检测的需要，从而越来越受到人们的关注，但选择性差成为其发展的瓶颈。目前用于测定雌激素的传感器多为生物传感器，虽具有较高的灵敏度和选择性，但天然的生物识别体系易受外界化学或物理环境的影响，使用条件要求较高，稳定性差，难以长期保存，检测对象有限，使其应用受到限制。

1987年Tabushi首次尝试用分子印迹聚合物作为敏感材料，并成功用于检测维生素。此后，分子印迹聚合物传感器引起了人们广泛的兴趣。分子印记聚合物(Molecular ImprintedPolymers，MIPs)是一种人工合成受体，因其具有良好的物理化学稳定性和对目标分子的高吸附量、高选择性，已被广泛应用于食品药品和环境有害残留物的分离、富集及测定。尤其是能耐受高温、高压、酸碱、有机溶剂等优点被认为是生物分子的理想替代物，成为传感器敏感材料的研究热点。因此，分子印记技术和传感器研究相结合将获得相得益彰的效果。

目前大多分子印记电化学传感器的制备是通过电沉积法或滴涂法使分子印记聚合物附着在电极上，其膜厚难以控制，均匀性较差，从而影响了传感器的灵敏度。另外，传统本体聚合法合成的分子印记聚合物普遍存在多数结合位点被埋藏、易产生模板分子残留、吸附容量低、印记空穴不稳定和目标分子传质过程缓慢等问题。

表面分子印记技术，是将模板分子以一定作用力结合到刚性无机材料上制备对特定目标分子(模板分子)具有特异预定选择性聚合物的过程。其印记结合位点均在材料表面，具有更多的结合位点，表现出高的选择性和快的吸附动力学等特点。电聚合法通过化学键作用在电极表面直接成膜，具有速度快、膜厚可控和膜稳定好等优点。因此，电聚合法是制备分子印记传感器敏感膜最有潜力的方法。目前已有电聚合法分子印记膜电化学传感器的研究，但电聚合法制备雌二醇自组装分子印记膜电化学传感器未见报道。

另外，2009年王富生科研小组的发明专利(CN101650334A)公开了：“用于双酚A的分子印迹膜检测装置及其制备、检测方法”制备方法。它采用了“相似相容”原理，将电极浸于乙醇和水中浸泡3-6小时去除模板分子。但该方法洗脱时间较长。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，通过表面分子印记技术、纳米技术与电化学传感器的交叉研究，基于纳米金属修饰电极，采用电聚合法制备出稳定的雌二醇自组装分子印记膜电化学传感器，并根据静电斥力和氢键在酸性溶液中易断裂的机理快速去除模板分子。本发明方法制备得到的高灵敏度、高选择性特性的自组装分子印记膜电化学传感器可实现水样中痕微量雌二醇的快捷、灵敏和实时检测，对环境污染物监测有重要意义。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种17β-雌二醇(E2)分子印记膜电化学传感器的制备方法包括以下步骤：

a)电极预处理：将玻碳电极经抛光后，放入Piranha溶液中浸泡后洗净；本发明所述的Piranha溶液为30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝3∶7，V/V。

b)纳米铂粒子修饰电极：将洗净的玻碳电极置于含硫酸和六氯铂酸的混合溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环扫描3～28min；然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗干净，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得纳米铂粒子修饰电极；Piranha溶液中浸泡时间可为3～8min。

c)分子自组装膜修饰电极：将修饰电极浸入到含功能单体和17β-雌二醇的四氢呋喃混合溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置16～24h；其中，17β-雌二醇和功能单体摩尔比为1∶1～1∶8；

d)电聚合反应：配制含功能单体、17β-雌二醇和KCl的PBS溶液，氮吹20～30min后，插入“c)”步骤得到的自组装膜修饰电极，于-0.2～0.6V电位范围，以50mV·s^-1的扫描速率循环伏安扫描7～28圈，取出，去离子水淋洗，氮气吹干；其中，17β-雌二醇和功能单体摩尔比范围为1∶1～1∶48。

e)洗脱模板分子：将电聚合后电极浸入H₂SO₄溶液中，在0.2～1.0V电位下处理5～10min。

步骤“b)”中所述的混合溶液优选为含0.5mol·L^-1硫酸和5mmol·L^-1六氯铂酸的混合溶液，所述的循环扫描时间优选为15～25min，最优选20min。步骤“c)”和“d)”中所述的功能单体可为巯基类化合物，优选6-巯基烟酸、4-巯基苯甲酸或2-巯基哌啶，最优选6-巯基烟酸。步骤“c)”中所述的混合溶液中功能单体与17β-雌二醇的摩尔比优选为2∶1～4∶1，最优选为2∶1，该混合溶液最优选采用含6mmol·L^-1 6-巯基烟酸和3mmol·L^-1 17β-雌二醇的四氢呋喃混合溶液。

步骤“d)”中所述的PBS溶液中优选含摩尔比为12∶1～36∶1(最优为24∶1)的功能单体与17β-雌二醇，最优选为含6mmol·L^-1 6-巯基烟酸，0.25mmol·L^-1 17β-雌二醇和0.1mol·L^-1 KCl的PBS溶液。步骤“e)”中步骤“e)”中优选将电聚合后电极浸入H₂SO₄溶液中，在0.2～1.0V电位下处理5min。所述的H₂SO₄溶液的浓度优选为0.5mol·L^-1。

步骤“a)”中玻碳电极可在Piranha溶液中浸泡2～5min。所述的抛光可为玻碳电极经0.05μm的Al₂O₃悬浊液抛光。

PBS溶液是0.05mol/L的磷酸二氢(KH₂PO₄)和0.05mol/L的磷酸氢二钾(K₂HPO₄)水溶液配制成一定pH值的缓冲溶液。本发明中优选采用pH6-7的缓冲溶液，最优选是pH值6.86的缓冲溶液。

使用的模板分子为17β-雌二醇，英文名为17β-Estradiol，结构式为：

本发明通过以下方法对本发明电化学传感器进行检测：

电化学检测方法和条件：

循环伏安法(CV)法：检测电位范围为-0.2～0.6V，扫描速率为50mV·s^-1。测试底液为0.1mol·L^-1 KCl和1mmol·L^-1铁氰化钾溶液。

差示脉冲法(DPV)法：测试底液为含0.1mol·L^-1 KCl的PBS溶液(0.05mol·L^-1，pH6.86)，检测电位范围为0.2～1.0V，扫描速率为50mV·s^-1，电位增量为0.005V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.0167s，静止时间为2s。测试前电极在H₂SO₄溶液中清洗至背景电流恢复。为使吸附完全，实验中选择E2富集时间为4min，温度均控制在(25±5)℃。

样品测定：

取本市某医院妇科处理前后用水和自来水，过滤除去固体杂质，将其作为溶剂配制pH6.86的PBS(0.05mol·L^-1)溶液，采用DPV法测定三份样品中E2的浓度。

(一)以下通过优化实验条件的选择进一步说明本发明的技术方案：

1、电沉积时间对纳米铂修饰电极影响

纳米铂沉积的厚度可由沉积时间控制，以1mmol·L^-1 K₃[Fe(CN)₆]为探针分子，循环伏安响应值为指标，考察电极电沉积最佳时间。图2中循环伏安响应随着沉积时间的延长逐渐增大，在20min达到最大值表明纳米铂粒子显著增加了电极的电传导性能。但沉积时间的继续延长循环伏安响应反而降低，可能是因产生的膜太厚阻碍了电极与电解液之间电子传递。结果表明20min为最佳电沉积时间。图2内插图为电沉积扫描过程图，可见在电压-0.1V处，氧化还原峰响应值随着沉积时间的延长逐渐增大。

2、功能单体和模板分子反应摩尔比

(1)单体与模板分子的摩尔比直接影响分子印记膜中印记孔穴的形成及识别位点的量，进而影响其吸附性能。在自组装过程中加入模板分子，通过氢键作用使E2选择性组装到电极表面，有利于在电极表面形成有效的印记位点，使MIS对目标物有更好的吸附性。取浓度为6mmol L^-1的MNA溶液，配制E2和6-巯基烟酸(MNA)摩尔比为1∶1，1∶2，1∶4，1∶6和1∶8的四氢呋喃系列组装液，在不同配比组装液中分别制备传感器(MIS)。采用DPV法检测电极对PBS溶液中E2(50μmol·L^-1)的响应，均可响应。而当摩尔比为1∶2～1∶4时，MIS电流响应值较大。而当摩尔比为1∶2时，MIS电流响应值最大。

(2)在电聚合过程中补充加入模板分子，可有效增加印记位点，提高MIS对E2的响应灵敏度。取浓度为6mmol L^-1的MNA溶液，配制E2和MNA摩尔比为1∶1，1∶6，1∶12，1∶24，1∶36和1∶48的PBS系列溶液，分别制备MIS。采用DPV法检测电极对PBS溶液中E2(50μmol·L^-1)的响应。结果表明，当摩尔比为1∶12～1∶36时，电聚合形成的分子印记膜响应较大，摩尔比为1∶24时，电聚合形成的分子印记膜响应最大。摩尔比低于1∶1时，响应值很低，推测因单体比例相对较高，单位体积中印记孔穴和识别位点数相应减少，同时过高交联程度造成模板分子很难到达印记孔穴，使响应减弱。摩尔比高于1∶48时，单体量不能满足有效印记孔穴和识别位点形成，使响应降低。优选择E2和MNA摩尔比1∶24为最佳比例。

3、电聚合圈数对印记膜厚的影响

聚合物膜的厚度可以通过电聚合循环扫描的圈数来控制。图3为不同圈数制得的MIS在含20μmol·L^-1 E2的PBS溶液中DPV响应。实验结果表明，循环扫描10圈制得的电极性能最好。聚合圈数少于7圈时，形成的印记孔穴和识别位点相对较少、电流响应值低；聚合圈数多于28圈，尽管产生的印记位点量增多，但因膜太厚，印记位点的可接近性差，阻碍了MIS与电解液之间电子的传递，电流响应值降低。

4、模板分子的洗脱

模板分子是否彻底洗脱对电极的测定结果有着重要的影响。传统的洗脱方法往往采用有机溶剂或缓冲溶液淋洗电极，这些方法一般需要的时间长，且不能够完全除去模板分子。本发明根据静电斥力和氢键在酸性溶液中易断裂的机理，将电聚合后电极浸入H₂SO₄溶液中，在0.2～1.0V电位下处理5～10min使聚合膜上形成正电荷聚集，E2酚羟基上的氧在酸性溶液中可吸氢使其带正电荷，从而发生静电斥力，E2脱离识别孔穴。优选H₂SO₄溶液的浓度为0.5mol·L^-1，在酸性溶液中氢键作用将被破坏，自组装的E2分子可从分子印记膜孔穴中逸出。

(二)MIS制备过程的表征

1、MNA修饰电极和E2预组装傅里叶红外表征

红外分析表明，自组装过程中，MNA上S-H键断裂，S因与Pt有较强的亲和作用，而形成稳定的Pt-S键，使MNA固定在GCE表面，2541cm^-1处为-SH的伸缩振动吸收峰，自组装形成Pt-S键后该处的-SH吸收峰完全消。此外，3420cm^-1和1382cm^-1分别为O-H和C＝O的伸缩振动，-H伸缩振动发生红移至3380cm^-1；C＝O的伸缩振动轻微移向高波数至1400cm^-1，表明MNA上的羧基和E2上羟基的氢键作用使E2聚集到电极表面。

2、PtNPs修饰电极和MIS膜的扫描电子显微镜表征

因玻碳电极无法直接进行SEM表征，本发明在导电玻璃上采用实施例1方法制备了PtNPs/GCE和MIS。采用SEM分别表征了PtNPs修饰导电玻璃(图4a，b)和MIS膜导电玻璃(图4c，b)。从图中可以看出纳米铂呈球状，均匀分散在导电玻璃表面。其粒径范围在50～100nm之间。电聚合反应后形成形成致密、有序的分子印记膜，其粒径明显增大，且模板分子的去除使粒子表面显得较粗糙，证明了印记孔穴的形成。

3、MNA在电极表面的电聚合

在模板分子E2存在下，修饰电极上MNA电聚合过程中的CV曲线见图5。由图可知，MNA阳极峰电位为0.45V；且MNA在电极上的电化学聚合是一个完全不可逆过程，随着扫描圈数的增加，峰电流明显下降，最后趋向于一直线，表明电聚合引发MNA形成了致密、弱导电性聚合膜，并逐渐覆盖在电极表面上，导致伏安响应受到抑制。

4、MIS制备过程的循环伏安表征

以1mmol·L^-1 Fe(CN)₆ ^3-/4-为探针分子，采用CV法表征修饰电极制备过程中膜的电化学行为。纳米铂修饰后(图6b)MIS的峰电流值较裸电极(图6a)显著增加，这是因为纳米铂增大了电极的催化活性。形成分子印记膜后峰电流明显降低(图6c)，是因电聚合时，电位扫描产生自由基负离子，在电极表面引发MNA聚合反应形成致密、有序的弱导电性聚合膜，而模板分子被包埋于聚合膜中，阻碍了探针分子到达电极表面发生电化学反应。洗脱模板分子后(图6d)，在聚合膜内形成了E2的特有识别孔穴，这些带有识别位点的孔穴逐个相连并与电极表面接触，使得探针分子可通过聚合膜到达电极表面发生氧化还原反应，致使峰电流值增大。NIS(图6e)几乎没有电流产生，进一步证实聚合膜为致密的、弱导电性膜。

以上实验表明MIS具有以下优点：①纳米铂具有高比表面积，可容纳较多的结合位点，其高催化活性可有效提高电化学传感器的灵敏度；②分子印记的特异识别性大大提高电化学传感器的选择性；③在纳米铂修饰电极上形成MNA和E2自组装膜，增加表面有效印记位点，并提高形成分子印记膜稳定性；④用电聚合方法制备自组装分子印记膜，克服了传统滴涂法和电沉积法制备的印记膜膜厚难控制所导致的传质和电荷传递慢、模板分子洗脱困难及检测限高等缺点，且提高了膜稳定性。

(三)MIS性能测试

在扫描速度10-200mV·s^-1的范围内，考察了E2在MIS上的电化学行为，结果表明E2在MIS上是一不可逆反应。

1、静态吸附试验

分别用MIS和NIS测试一系列浓度(0.500-250μmol·L^-1)E2标准溶液。如图7所示，浓度为150μmol·L^-1时，电流值变化趋于平缓，认为此时识别位点几乎被全部占据，表明印记空穴及活性结合位点对E2具有高度亲合力和特异的识别能力。NIS几乎无电流变化，提示可能因没有印记孔穴提供通道导致。

2、选择性吸附试验

电子在膜相中传递是由于电活性物质渗透进分子印记膜，进而在电极表面发生氧化还原反应。识别过程中响应分子通过与识别孔穴的空间匹配作用、E2分子上苯环与识别位点苯环间π-π共平面作用及羟基和识别位点羧基间氢键的共同作用，形成稳定的复合物，而产生电化学响应。为证明聚合膜内的识别位点对模板分子具有特异选择性，选择一组与E2结构具有不同类似度的化合物(E3、EE、BPA和phenol)分别进行选择吸附试验。具体方法为：将MIS放入50μmol·L^-1 E2的PBS溶液，50μmol·L^-1 E2分别和2.5mmol·L^-1 E3、EE、BPA的混合PBS溶液中反应达到平衡，DPV法扫描得到氧化峰电流值，最后以浓度对峰电流值比值(I_m/I_o)作图，其中I_m为E2在0.65V处的氧化峰，I_o为干扰物共存时E2的氧化峰。如图8-A所示，在高浓度的干扰物共存时，I_m/I_o的波动范围在0.95-1.03内，表明共存的结构类似物对E2的测定无明显干扰。

MIS在E2和10倍浓度的干扰物E3共存的溶液中获得的峰电流曲线与在E2溶液中接近，如图8-B所示，说明结构类似物E3对E2的测定无明显干扰，进一步证实MIS对E2有良好的选择性。

(四)样品测定方法学研究

1、标准曲线与检测限

E2的DPV氧化峰电流与其浓度在3.0×10^-8-5.0×10^-5mol·L^-1的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为I_P＝0.6368C+11.71，相关系数r＝0.996。

由于铂纳米粒修饰而产生大的比表面积，铂优良的电传导和氧化催化活性，以及MIS具有的选择富集与吸附特性，使检测限(LOD)可达到1.6×10^-8mol·L^-1(S/N＝3)，与已报道的传感器相比有更高的灵敏度，如表1所示。

表1与其它检测方法的比较

SPE：固相萃取；PMIPs/DSPE：名义模板分子印记聚合物/分散式固相萃取；MWNTs：多壁碳纳米管；CNTs：多碳纳米管。

2、MIS的稳定性和重现性

在本实验中，制备5根MIS(按照实施例1方法)，均置于50μmol·L^-1 E2的PBS溶液中吸附后，在相同条件下测定，相对标准偏差为2.9％；将其中一根MIS连续使用50次后，DPV响应的相对标准偏差为2.3％。由结果可以推测，目标分子与印记膜中的识别位点之间存在可逆的结合作用。说明MIS的可逆性、再生性和重现性都较好。

MIS置于PBS溶液中4℃保存35天，间断性测定5次，电流响应降为初始时的90％，说明MIS有较好的稳定性。另外，将MIS置于去离子水中超声10min，其电流响应无明显变化，说明MIS有较好的耐受性。

性能测试表明，本发明制备的MIS选择性高、响应快速、灵敏度高、稳定性和耐受性良好，实现了在水相中进行印记和识别，对环境水样品中的目标物选择性富集测定，获得了较好的准确度和精密度。MIS可实现对环境水样品中EES实时快速检测，具有良好的应用前景。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明首次以环境雌激素污染物E2为模板分子，结合自组装法、电聚合法、纳米材料和表面分子印记技术，在纳米铂修饰电极表面成功构建了MNA自组装膜分子印记电化学传感器，并成功应用于环境水样中痕微量雌激素的测定。本发明兼有纳米材料、分子印记聚合物和传感器的优点，吸附试验结果表明制得的传感器具有高吸附容量和高选择性，对结构相似的雌三醇和炔雌醇响应不灵敏，对结构差异较大的化合物几乎无响应。采用差势脉冲法，在含0.1mol·L^-1 KCl的PBS溶液(0.05mol·L^-1，pH6.86)中，0.2～1.0V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率，利用制备的MIS直接测定医院妇科处理前后水和自来水，结果分别为：加样回收率测得回收率在95.37％～101.4％范围，RSD＜3.69％。表明MIS可实现水样品痕微量雌激素的即时测定。并且，测试样品无需复杂的前处理过程。

附图说明

图1为17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器的制备工艺流程图。

图2为PtNPs/GCE循环伏安电流响应图，内插图为电沉积扫描过程图。

图3为MIS在20μmol·L^-1E2的PBS溶液中DPV响应图。

图中，a→d：电聚合循环扫描的圈数分别为7，10，14，28制得的MIS在含20μmol·L^-1E2的PBS溶液中DPV响应。

图4为电子显微镜扫描图：放大6000倍Pt纳米粒子修饰导电玻璃(a)和MIS膜修饰导电玻璃(b)；放大15000倍Pt纳米粒子修饰导电玻璃(c)和MIS膜修饰导电玻璃(d)。

图5为MNA在电极上电聚合过程图。

图6为(a)裸电极，(b)PtNPs/GCE，(c)MIS洗脱模板分子前，(d)MIS洗脱模板分子后和(e)NIS在1mmol·L^-1 Fe(CN)₆ ^3-/4-和0.1mol·L^-1KCl混合溶液中的CV图。

图7为MIS和NIS静态吸附曲线图。

图8-A为MIS对E2及其类似物选择性吸附试验(E2峰电流值分别和E3、EE、BPA及phenol共存时的峰电流值比值)。

图8-B为MIS分别在E2(a)以及E2与10倍浓度干扰物E3共存(b)时的电流响应曲线。

具体实施方式

药品和试剂：Al₂O₃(0.05μm，上海辰华仪器有限公司)，17β-雌二醇(E2，浙江仙琚制药股份有限公司)，双酚A(Bisphenol，BPA，国药集团化学试剂有限公司)，氯化钾(KCl)、铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆)(分析纯，上海新宝精细化工厂)，无水乙醇、乙腈(分析纯，国家集团化学试剂有限公司)，六氯铂酸(H₂PtCl₆，阿法埃莎化学有限公司)，苯酚(phenol)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)(分析纯，上海凌峰化学有限公司)，6-巯基烟酸、4-巯基苯甲酸、2-巯基哌啶(Sigma-Aldrich公司)，浓盐酸(HCl，上海中试化工总公司)，四氢呋喃(上海试四赫维化工有限公司)，硫酸(H₂SO₄，上海化学试剂有限公司)，实验用水为二次蒸馏水。PBS溶液是0.05mol·L^-1KH₂PO₄和0.05mol·L^-1K₂HPO₄水溶液配制pH 6.86的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)。

实施例1

(1)玻碳电极预处理

玻碳电极(Φ＝3mm)经0.05μm的Al₂O₃悬浊液抛光后，放入Piranha溶液(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝3∶7，V/V)中浸泡2min，然后依次用无水乙醇、去离子水各超声清洗2min。

(2)纳米Pt粒子修饰玻碳电极

将抛光洗净的玻碳电极(GCE)置于0.5mol·L^-1H₂SO₄+5mmol·L^-1H₂PtCl₆溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环扫描10min电沉积Pt，然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗干净，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡5min，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得纳米铂粒子修饰玻碳电极(PtNPs/GCE)，在PBS溶液中保存。

(3)分子自组装膜修饰电极

配制含6mmol·L^-1MNA和3mmol·L^-1E2的四氢呋喃混合溶液，将纳米铂粒子修饰玻碳电极浸入到混合液中，充氮后密封，室温避光环境中保持18h，完成自组装膜修饰电极。

(4)电聚合法制备MIS

配制含6mmol·L^-1MNA，0.25mmol·L^-1E2和0.1mol·L^-1KCl的PBS溶液，氮吹20min后，插入自组装膜修饰电极，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环伏安扫描10圈。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干。

0.2V恒电位下，在0.5mol·L^-1H₂SO₄溶液中5min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器(MIS)。MIS的制备过程示意见图1。

经MIS测定，医院妇科处理前水中E2的含量为32.94nmol L^-1，医院妇科处理后水和自来水中均未检测出E2。分别在已测E2含量的水样品中加入低、中、高3个浓度的E2标准溶液，进行加样回收率试验，每个样品平行测定5次。测得回收率在97.95％-101.4％范围，RSD＜3.69％(见表2)。

表2水样品中E2的含量测定(n＝5)

实施例2

(1)玻碳电极预处理

玻碳电极(Φ＝3mm)经0.05μm的Al₂O₃悬浊液抛光后，放入Piranha溶液(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝3∶7，V/V)中浸泡5min，然后依次用无水乙醇、去离子水各超声清洗2min。

(2)纳米Pt粒子修饰玻碳电极

将抛光洗净的GCE置于0.5mol·L^-1H₂SO₄+5mmol·L^-1H₂PtCl₆溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环扫描10min电沉积Pt，然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗干净，氮气吹干。再置于Piranha溶液中浸泡8min，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得纳米铂修饰玻碳电极(PtNPs/GCE)，PBS溶液中保存。

(3)分子自组装膜修饰电极

配制含12mmol·L^-1MNA和3mmol·L^-1E2的四氢呋喃混合溶液，将修饰电极浸入到混合液中，充氮后密封，室温避光环境中保持16h，完成自组装膜修饰电极。

(4)电聚合法制备MIS

配制含9mmol·L^-1MNA，0.25mmol·L^-1E2和0.1mol·L^-1KCl的PBS溶液，氮吹25min后，插入分子自组装膜修饰电极，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环伏安扫描7圈。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干。

0.2V恒电位下，在0.5mol·L^-1H₂SO₄溶液中处理5min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器(MIS)。

经MIS测定，医院妇科处理前水中E2的含量为29.73nmol L^-1，医院妇科处理后水和自来水中均未检测出E2。分别在已测E2含量的水样品中加入低、中、高3个浓度的E2标准溶液，进行加样回收率试验，每个样品平行测定5次。测得回收率在95.37％-97.93％范围，RSD＜3.91％。

实施例3

(1)玻碳电极预处理

玻碳电极(Φ＝3mm)经0.05μm的Al₂O₃悬浊液抛光后，放入Piranha溶液(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝3∶7，V/V)中浸泡3min，然后依次用无水乙醇、去离子水各超声清洗2min。

(2)纳米Pt粒子修饰玻碳电极

将抛光洗净的GCE置于0.5mol·L^-1H₂SO₄+5mmol·L^-1H₂PtCl₆溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环扫描28min电沉积Pt，然后分别用无水乙醇和去离子水淋洗干净，氮气吹干。再置于Piranha溶液中浸泡3min，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得纳米铂修饰玻碳电极(PtNPs/GCE)，PBS溶液中保存。

(3)分子自组装膜修饰电极

配制含24mmol·L^-12-巯基哌啶和3mmol·L^-1E2的四氢呋喃混合溶液，将修饰电极浸入到混合液中，充氮后密封，室温避光环境中保持24h，完成自组装膜修饰电极。

(4)电聚合法制备MIS

配制含12mmol·L^-12-巯基哌啶，0.25mmol·L^-1E2和0.1mol·L^-1KCl的PBS溶液，氮吹15min后，插入自组装膜修饰电极，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环伏安扫描28圈。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干。

0.2V恒电位下，在0.5mol·L^-1H₂SO₄溶液中处理5min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器(MIS)。

经MIS测定，医院妇科处理前水中E2的含量为33.01nmol L^-1，医院妇科处理后水和自来水中均未检测出E2。分别在已测E2含量的水样品中加入低、中、高3个浓度的E2标准溶液，进行加样回收率试验，每个样品平行测定5次。测得回收率在94.82％-97.40％范围，RSD＜3.76％。

实施例4

(1)玻碳电极预处理

玻碳电极(Φ＝3mm)经0.05μm的Al₂O₃悬浊液抛光后，放入Piranha溶液(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝3∶7，V/V)中浸泡3min，然后依次用无水乙醇、去离子水各超声清洗2min。

(2)纳米Pt粒子修饰玻碳电极

将抛光洗净的GCE置于0.5mol·L^-1H₂SO₄+5mmol·L^-1H₂PtCl₆溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环扫描3min电沉积Pt，然后分别用无水乙醇和去离子水淋洗干净，氮气吹干。再置于Piranha溶液中浸泡5min，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得纳米铂修饰玻碳电极(PtNPs/GCE)，PBS溶液中保存。

(3)分子自组装膜修饰电极

配制含3mmol·L^-14-巯基苯甲酸和3mmol·L^-1E2的四氢呋喃混合溶液，将修饰电极浸入到混合液中，充氮后密封，室温避光环境中保持20h，完成自组装膜修饰电极。

(4)电聚合法制备MIS

配制含0.25mmol·L^-14-巯基苯甲酸，0.25mmol·L^-1E2和0.1mol·L^-1KCl的PBS溶液，氮吹20min后，插入自组装膜修饰电极，于-0.2～0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环伏安扫描10圈。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干。

0.2V恒电位下，在0.5mol·L^-1H₂SO₄溶液中处理10min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器(MIS)。

经MIS测定，医院妇科处理前水中E2的含量为31.59nmol L^-1，医院妇科处理后水和自来水中均未检测出E2。分别在已测E2含量的水样品中加入低、中、高3个浓度的E2标准溶液，进行加样回收率试验，每个样品平行测定5次。测得回收率在94.34％-97.93％范围，RSD＜3.93％。

参考文献

[1]

A，Pyrzynska K，Regan F.Determination of anti-inflammatory drugs and estrogens inwater by HPLC with UV detection[J].Journal of Separation Science，2007，30(7)：985-991.

[2]Wang S，Li Y，Wu X L，Ding M J，Yuan L H，Wang R Y，Wen T T，Zhang J，Chen L N，ZhouX M，Li F.Construction of uniformly sized pseudo template imprinted polymers coupled withHPLC-UV for the selective extraction and determination of trace estrogens in chicken tissuesamples[J].Journal of Hazardous Materials，2011，186(2-3)：1513-1519.

[3]Lin X Q，LiY X.A sensitive determination of estrogens with a Pt nano-clusters/multi-walledcarbon nanotubes modified glassy carbon electrode[J].Biosensors and Bioelectronics，2006，22(2)：253-259.

[4]Liu X Q，Wong D K Ymica A.Electrocatalytic detection of estradiol at a carbonnanotube|Ni(Cyclam)composite electrode fabricated based on a two-factorial design[J].Analytica Chimica Acta，2007，594(2)：184-191.

Claims (9)

1.一种17β-雌二醇分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)电极预处理：将玻碳电极抛光后，放入Piranha溶液中浸泡后洗净；

b)纳米铂粒子修饰电极：将洗净的玻碳电极置于含硫酸和六氯铂酸的混合溶液中，于-0.2~0.6V电位范围内，以50mV·s^-1的扫描速率循环扫描3~28min；然后依次用无水乙醇和去离子水淋洗，氮气吹干，再置于Piranha溶液中浸泡后，去离子水淋洗干净，氮气吹干，即得纳米铂粒子修饰电极；所述的Piranha溶液为30%H₂O₂与浓H₂SO₄的体积比为3:7的溶液；

c) 分子自组装膜修饰电极：将修饰电极浸入到含功能单体和17β-雌二醇的四氢呋喃混合溶液中，充氮后密封，室温避光环境中放置16~24h；其中，17β-雌二醇和功能单体摩尔比为1:1~1:8；所述的功能单体为巯基类化合物；

d)电聚合反应：配制含功能单体、17β-雌二醇和KCl的PBS溶液，氮吹20~30min后，插入“c)”步骤得到的分子自组装膜修饰电极，于-0.2~0.6V电位范围，以50mV·s^-1的扫描速率循环伏安扫描7~28圈，取出，去离子水淋洗，氮气吹干；其中，17β-雌二醇和功能单体摩尔比范围为1:1~1:48；

    e) 洗脱模板分子：将电聚合后电极浸入H₂SO₄溶液中，在0.2~1.0V电位下处理5~10min。

2.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“b)”中所述的混合溶液为含0.5mol·L^-1 硫酸和5mmol·L^-1六氯铂酸的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“b)”中所述的循环扫描时间为15~25min。

4.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于所述的巯基类化合物为6-巯基烟酸、4-巯基苯甲酸或2-巯基哌啶。

5.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“c)” 中所述的混合溶液中，功能单体与17β-雌二醇的摩尔比为2：1~4：1。

6.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“d)”中所述的PBS溶液中含摩尔比为12：1~36：1的功能单体与17β-雌二醇。

7.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“e)”中所述的H₂SO₄溶液的浓度为0.5mol·L^-1。

8.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“e)”中将电聚合后电极浸入H₂SO₄溶液中，在0.2~1.0V电位下处理5min。

9.根据权利要求1所述的分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤“a)”中玻碳电极在Piranha溶液中浸泡2~5min。

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