CN101139421A - 一种17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种17β－雌二醇分子印迹聚合物的制备方法及应用，属于生物样品及食品样品中的17β－雌二醇分析测定技术领域。本发明提出一种制备17β－雌二醇分子印迹聚合物的方法以及利用分子印迹法对生物样品及食品样品中17β－雌二醇进行分离纯化及检测的方法。本发明合成得到的17β－雌二醇分子印迹聚合物具有选择性吸附特征，可以对环境、生物样品及食品样品中的17β－雌二醇分子进行分离提纯、浓缩和快速测定分析。
Description
技术领域
一种17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备方法及应用，本发明涉及一种对17β-雌二醇具有专一识别性能的聚合物的制备方法，还涉及采用分子印迹聚合物分离纯化与测定生物和食品样品中17β-雌二醇的应用。属于生物样品及食品样品中的17β-雌二醇分析测定技术领域。
背景技术
分子印迹是制备有分子识别特性的聚合物，被视为一种特异性的新型亲和技术，作为探索分子间相互作用工具，属于超分子化学的主客体化学范畴。分子印迹聚合物(MIP)依据目标分子“度身量制”(Mosbach K.and Haupt K.1998)，有“分子钥匙”和“人工锁”的美誉，MIP与模板的相互关系类似于抗体、激素受体和酶分别与它们的天然目标分子存在结构上特异性结合，堪比完美的“手与手套”效应(Haupt K.2002)。
MIP之所以发展如此迅速，在于它所具有的构效预定性、选择识别性和广泛实用性三大特点。构效预定性决定了人们可以根据不同的目的制备不同的MIP，以满足不同研究所需；选择识别性是因为MIP是根据印迹分子“度身量制”的，具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子；其广泛实用性表现在它与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比，具有抗恶劣环境的能力，稳定性高和使用寿命长，且制备过程简单。由于MIP的优越特性，使它在许多领域，如作为抗体或受体的位点结合模板、化学传感器及生物传感器、选择性分离、精细合成或催化、生化制药和药物传递等等方面具有蓄势待发的潜力和优势。
MIP具有特效的选择性和亲和性，用作固相萃取剂可简化环境样品体系复杂的预处理程序，为样品的采集、富集和分析提供极大的方便。对毫摩尔水平下的痕量物质经这一方法预富集处理后，达到色谱检测限以上。将MIP与SPE结合而成的MISPE若与LC或GC联用，就可替代传统的SPE(Lanza F.andSellergren B.2001)。但是，要发展具有高选择的MISPE用于在线萃取，特别是从生物样品中萃取目标物还存在严峻的挑战。Stanley发展了一种差量脉冲洗脱，经MISPE上样后联接DPE来降低干扰的结构类似物，采用末端脉冲洗脱方式可实现对头孢菌素IV的直接定量。因为脉冲洗脱不仅可以洗脱在聚合物表面结合的模板分子，还可以克服因离表面较远存在于聚合物内部的以氢键连接的模板分子(Stanley Gang Wu.August 2002)。SPE包含上样；淋洗去除杂质；洗脱三个步骤，而MISPE在线分子识别系统一般由HPLC泵，进样阀，MIP微柱，紫外检测器和积分仪构成。
MIP的结构和形态与印迹效果一起可经过HPLC得以表征。它决定了模板是否被成功地印迹，采用不同的评价因子评估MIP的识别特性。例如在聚合物中的结合位点数可以通过色谱法进行研究，因为他们对作为聚合物分离材料的传质动力学和负载容量有重要的意义。
化合物在固定相和活动相之间的分散作用以及化合物在固定相中的吸附和解析都决定了分析物在HPLC中的分离行为。与固定相具有较强相互作用的分析物将导致其在固定相中有更长的保留。
环境或动物性食品中可能残留的甾醇激素对人们的身体健康具有潜在的危害，成为食品安全领域涉及的重要命题(Hartmann S.，Lacorn M.et al.1998；Wiseman A.，Goldfarb P.et al.1998；International Prostate Health Council StudyGroup 2000；Barnhoorn I.E.J.，Bornman M.S.et al.2004；Harvey P.W.and DarbreP.2004；Hartmann S.and Steinhart H.1997)。2004年Sanderson(Sanderson H.，Brain R.A.et al.2004)在药物的风险评价中，根据它们存在特性和对人体健康和环境的危害从高到低的顺序为：抗生素＞性激素＞心血管药物＞抗肿瘤药物。鉴于类固醇激素的安全性问题，在许多国家，包括欧盟成员国，均禁止采用激素对牛进行催肥。如果不能区分内源性的和添加的天然激素，天然的激素可能被外源性激素影响变得难以区分，所以，分析激素的前体和代谢产物的比例显得意义重大，而甾醇类激素检测技术水平在此起到关键作用。
虽然，当前已有多种的针对制药领域、生物化学和食品工业的激素检测方法，但要加强对专业生产领域和环境中此类化学成分的监控，开发一种迅速、灵敏和经济的分析检测技术显得十分的迫切。目前，普遍应用的类固醇检测技术包括了荧光光谱分析(Van Ginkel G.，Van Langen H.et al.1989)，质谱分析(Palmgrén J.J.，Tyrs A.et al.2005)，液相色谱(Grob K.，Lanfranchi M.et al.1989)，气相色谱(Truong T.T.，Marriott P.J.et al.2003)，薄层色谱(Pazos A.J.，Silva A.et al.2003)，免疫检测(Abraham G.E.1975)和一些组合分析技术，它们之中除了免疫方法，大多需要昂贵的投资，繁琐的样品预处理程序和大量使用有机溶剂。尽管免疫检测已是非常适用的内源激素分析手段，但在实际应用中也存在专一性和灵敏性的问题，并且还依赖于大量的动物实验，受到条件限制，如实验成本高，不可能全面推广，而且费时、费工，重现性、准确性并不理想。
根据近十年来的研究报道，分子印迹聚合物具有克服上述缺陷的潜力。分子印迹是可以用于制备大多数小分子人工聚合受体的便捷手段(Wulff G.1995)。也就是一种可把印迹分子视为创造具有底物-选择性大分子材料仿生型模板的铸模加工技术(Mosbach K.and Ramstrm O.1996)。MIP的合成包括了共价法、半共价法和非共价法，而其中非共价法是最广泛使用的方法，该法具有灵活、简便的特性。MIP已经在诸如液相色谱、固相萃取、膜技术、传感器、人工抗体、人工催化剂、生物转化和药物诊断等方面得以开发和研究(Ye L.，Ramstrm O.et al.1999；Masci G.，Aulenta F.et al.2002)，而且作为敏感材料的传感器MIP具有开发成为迅速、灵敏和经济型检测仪器的良好前景(Ebarvia B.S.and F.2005；Ersz A.，Denizli A.et al.2005；Suedee R.，Intakong W.et al.2006)。用分子印迹技术分离雌二醇异构体始终是一个备受关注的课题，目前已有的相关研究着重在将类固醇激素的分子印迹聚合物作为检测生物性激素的工具，或者是调查在识别过程中各功能基团扮演的角色。关于17β-雌二醇MIP的聚合方法包括了本体聚合(Sreenivasan K.2001；Dong H，Tong A.J.et al.2003)、沉淀聚合(Ye L.，Weiss R.et al.2000；Wei S.T.，Molinelli A.et al.2006)等。由于无表面活性剂或稳定剂的干扰，沉降聚合也已被用于不同分析物的MIP制备，利用此法所合成的MIP容易调解和操控。
发明内容
本发明目的之一是提供一种对17β-雌二醇具有专一识别性能的聚合物的制备方法。具体而言，是以甾醇分子中17β-雌二醇为模板分子，选择丙烯酸类、吡啶类、酰胺类等功能单体中的一种或两种与致孔剂进行超声波处理混和，冲入氮气密封、静置处理；再将上述混合物加入交联剂、致孔剂、引发剂，混合均匀后冲氮气密封，在容器中采用热引发或光引发方式进行沉淀聚合或本体聚合；将聚合反应合成的聚合物从反应容器中取出，用单一或混合的有机溶剂初步萃取模板分子，再添加丙酮去除精细颗粒和模板分子，经真空干燥后制得17β-雌二醇分子印迹聚合物。
本发明的另一目的是提供一种采用所述分子印迹聚合物对甾醇化合物进行分离纯化的方法。将制得分子印迹聚合物填充到SPE柱内，制成分子印迹固相萃取柱(MISPE)，将样品提取液用此MISPE柱进行纯化富集，用有机溶剂冲洗去除干扰物质，然后再用试剂洗脱，收集洗脱液，即得到分离纯化的含17β-雌二醇的洗脱液。
本发明的再一目的是提供一种采用所述分子印迹聚合物对17β-雌二醇进行快速测定的方法。利用本发明合成得到的分子印迹聚合物制成分子印迹色谱柱，将此色谱柱连接到液相色谱系统中对用有机溶剂提取的生物和食品样品进行分离纯化、浓缩和快速测定。
本发明的技术方案：制备17β-雌二醇分子印迹聚合物包括以下步骤：
(1)反应物配料处理：将一种或两种聚合物功能单体、部分致孔剂分别与模板分子17β-雌二醇标准品混合，超声波处理3～5min混合均匀，冲入氮气密封3min，静置处理3小时；
所述聚合物功能单体选自：丙烯酸类：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、三氟甲基丙烯酸，酰胺类：丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺，吡啶类：2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶；
所述致孔剂选自乙腈、氯仿、二氯甲烷或四氯化碳；
(2)聚合反应：将上述混合物加入交联剂、剩余致孔剂、引发剂，混合均匀后冲氮气密封3min；在容器中采用热引发或光引发方式进行沉淀聚合，合成分子印迹聚合物；
所述交联剂选自：三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯季戊四醇三丙烯酸酯或季戊四醇四丙烯酸酯；
采用的引发剂为偶氮二异丁腈；
热引发反应条件为：聚合温度控制在43℃～90℃，反应16～48小时；或光引发反应条件为：用30W～250W紫外灯在48小时之内聚合得到的产物，聚合温度控制在0℃～8℃；
在步骤(1)和(2)中，模板分子17β-雌二醇与聚合物功能单体的摩尔比例为0.1～1∶1；交联剂与聚合物功能单体的摩尔比例为0.5～5∶1；致孔剂总体积用量与交联剂摩尔数比例mL/mmol为15～30∶1；引发剂与聚合物功能单体的摩尔比例为0.08～0.12∶1
(3)去除模板分子，纯化分子印迹聚合物：将(2)中聚合反应合成的分子印迹聚合物从反应容器中取出，用单一或混合的有机溶剂初步萃取模板分子，继续添加丙酮，静置沉淀，去除悬浮的精细颗粒和模板分子，反复几次沉淀直至悬浮液中不再检测出17β-雌二醇，再用丙酮或甲醇混合，经真空干燥得到纯净的分子印迹聚合物；
(4)检测：色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物：将干燥的聚合物颗粒填装到空的色谱柱中，用甲醇和乙酸的混合试剂作为洗脱流动相，经液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为止，说明已将模板分子去除；
液相检测：Waters model 510高效液相泵填实，检测器为waters 490EProgrammable Multiwavelenghth Detector，分别以色谱纯甲醇、乙腈为流动相，以0.5mL·min-1流速洗脱至基线稳定为止，进样10μL，检测波长设置：对17α-E和17β-雌二醇均为281nm，对孕酮和雄烯二酮为235nm，以10μL丙酮乙腈溶液10μL·mL-1测定死时间，色谱工作站为ANASTAR Chromatography DataSystem，考察指标为：容量因子K′＝(t-t0)/t0，t是所测甾醇的保留时间，t0是死时间；分离因子α＝K′(17β-E)/K′compound；印迹因子IF＝K′imp/K′blank；选择性因子S＝IF(17β-E)/IF compound。
17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备方法，优选条件为模板分子17β-雌二醇与聚合物功能单体的摩尔比例为0.1～0.3∶1；交联剂与聚合物功能单体的摩尔比例为1∶1；致孔剂总体积用量与交联剂摩尔数比例mL/mmol为15～20∶1；引发剂与聚合物功能单体的摩尔比例为0.08～0.10∶1；
所用聚合物功能单体为三氟甲基丙烯酸，所用交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所用致孔剂为乙晴；
对反应合成的分子印迹聚合物初步萃取模板分子所用有机溶剂采用甲醇和乙酸混合液，甲醇∶乙酸体积比为9∶1～6∶4。
生物和食品样品中17β-雌二醇的分离纯化方法，包括以下步骤：将按权利要求1方法制得的分子印迹聚合物填充到装有孔径为0.25μm筛板注射器的固相萃取SPE柱内，制成分子印迹固相萃取柱MISPE，将真空干燥的生物和食品样品用有机溶剂提取，然后将提取液用蒸馏水稀释，提取液与蒸馏水的体积比为3∶7，用此混合液作为上样液，确保17β-雌二醇被MISPE保留在柱内，再用甲醇与纯净的水配成混合液，甲醇与水体积比为3∶7的混合液淋洗去除干扰物质，然后增加甲醇用量至与水比例为1∶1，进行洗脱，收集洗脱液用于检测。
测定生物和食品样品中17β-雌二醇的方法，包括如下步骤：将按权利要求1方法制得的分子印迹聚合物填充到色谱柱内，制成分子印迹色谱柱，将此色谱柱连接到液相色谱系统中对按权利要求2方法得到的洗脱液进行检测。
去除模板分子方法：将聚合反应合成的分子印迹聚合物从反应容器中取出，用单一或混合的有机溶剂初步萃取模板分子，再添加丙酮去除精细颗粒和模板分子，有机溶剂最好采用甲醇和乙酸混合液，比例把握在9∶1至6∶4范围，反复提取数次直至提取溶液经紫外检测无甾醇吸收峰为止；优先选择以下浸提模板分子方法，先将添加有丙酮、甲醇等低沸点的有机溶剂和分子印迹聚合物混合液在真空条件下干燥，真空干燥方法优先推荐使用旋转蒸发器。再将干燥的聚合物颗粒填装到空的色谱柱中，用甲醇乙酸的混合试剂作为洗脱流动相，经液相泵进行联机洗脱，洗脱效果可经检测器检测，即当洗脱至基线平直为止，说明已将模板分子去除。打开柱的尾筛及螺帽，依靠泵和流动相产生的压力再将聚合物从柱内压出，用丙酮或甲醇等低沸点的有机溶剂混合，再经真空干燥得到纯净的分子印迹聚合物；
本发明的有益效果：
本发明所开发的制备17β-雌二醇分子印迹聚合物的方法以17β-雌二醇为模板分子，所得的分子识别材料具有良好的分子识别性能，为17β-雌二醇及几种甾醇结构类似物分子印迹聚合物的合成提供了一种可行的制备方案。
本发明制备得到的分子印迹聚合物对17β-雌二醇具有选择行，可以对环境、生物样品和食品样品中的17β-雌二醇进行分离提纯，也可以对目标分子进行快速测定。
附图说明
图117α-雌二醇和17β-雌二醇异构体的HPLC谱图(a)采用0.125mmol17β-雌二醇作为模板分子，(b)采用0.25mmol 17β-雌二醇作为模板分子，(c)则是由(a)和(b)串联的连接柱。(a)和(b)样液中含有0.5mmol·L-1 17α-雌二醇和0.5mmol·L-1 17β-雌二醇乙腈溶液，进样量10μL；(c)样液含0.25mmol·L-1 17α-雌二醇和0.5mmol·L-1 17β-雌二醇乙腈溶液，进样量20μL。流动相：1％乙酸的乙腈溶液；流速：0.5mL·min-1；在281nm下检测，操作温度为12～14℃。
具体实施方式
实施例1
按以下比例，如分别以0.125mmol、0.167mmol和0.25mmol的17β-雌二醇作为模板分子，1mmol甲基丙烯酸甲酯为功能单体，1mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，20mL氯仿为致孔剂，0.102mmol偶氮二异丁腈混合溶解，先将甲基丙烯酸甲酯、17β-雌二醇与10mL乙腈添加到100mL医用盐水瓶中进行超声波处理混和，冲入氮气3min密封、室温静置处理3小时以上；再将上述混合物加入交联剂1mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、剩余的5mL致孔剂和引发剂，混合均匀后冲氮气3min密封，在容器中采用热引发或光引发方式进行沉淀聚合。其中热引发反应条件为，聚合温度控制在43℃～90℃恒温48小时；光引发反应条件为，用30W～250W紫外灯在48小时之内聚合得到的产物，聚合温度控制在0℃～8℃。
将聚合反应物从反应容器中取出，用甲醇和乙酸混合液(9∶1，v/v)初步萃取模板分子，再添加丙酮去除精细颗粒和模板分子，经真空干燥后制得17β-雌二醇分子印迹聚合物。再将按分子印迹聚合物填充到色谱柱内，制成分子印迹色谱柱，将此色谱柱连接到液相色谱系统中，对分别含有浓度为1mmol17β-雌二醇、1mmol雄烯二酮标样的乙腈溶液进行检测。
液相检测：Waters model 510高效液相泵填实，检测器为waters 490EProgrammable Multiwavelenghth Detector。分别以色谱纯甲醇、乙腈为流动相，以0.5mL.min-1流速洗脱至基线稳定为止。进样10μL，分别以甲醇、乙腈为流动相对结构类似物和模板分子保留行为进行了研究。检测波长设置：对17α-E和17β-雌二醇的为281nm，对Pro和And为235nm。以10μL丙酮乙腈溶液(10μL.mL-1)测定死时间。色谱工作站为ANASTAR Chromatography Data System。考察指标为：容量因子K′＝(t-t0)/t0，t是所测甾醇的保留时间，t0是死时间；分离因子α＝K′(17β-E)/K′(compound)；印迹因子IF＝K′imp/K′blank；选择性因子S＝IF(17β-E)/IF(compound)。详细数据见表1。
表1以乙睛为流动相对17β-雌二醇MIP和CP的HPLC分析数据
| 样品(功能单体mol/模板分子mol) | 分析物 | K′CP | K′imp | α | IF | S |
| MMA4/1aMMA6/1aMMA8/1aMMA8/1(UV)bMMA8/1(UV)c | 17β-EAnd17β-EAnd17β-EAnd17β-EAnd17β-EAnd | 1.080.391.080.391.080.391.080.391.280.44 | 1.020.301.290.391.350.441.860.551.860.55 | 1.003.361.003.261.003.081.003.411.003.41 | 0.940.781.191.011.251.121.721.401.461.25 | 1.001.211.001.181.001.111.001.231.001.17 |
a：紫外和热引发聚合；
b：紫外和热引发聚合，数据来自该印迹柱与空白柱的比较；
c：紫外和热引发聚合，数据来自该印迹柱与热聚合的空白柱的比较用热引发聚合制备的MIP，降低17β-雌二醇与甲基丙烯酸甲酯(MMA)比例(1/4＞1/6＞1/8)具有改善MIP的容量因子(1.02＜1.29＜1.34)和印迹因子(0.94＜1.19＜1.25)的作用。以紫外引发聚合制备的MIP，与紫外热聚合制备不含有17β-雌二醇模板分子的对照聚合物(简写：CP)比较IF＝1.46，与热聚合制备CP比较IF＝1.72。
实施例2
按以下比例分别将0.125mmol、0.25mmol 17β-雌二醇作为模板分子，1mmol三氟甲基丙烯酸为功能单体，1mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，15mL乙腈为致孔剂，0.0852mmol偶氮二异丁腈混合溶解，分别加入到100mL医用盐水瓶中，超声波处理3min，通N25min，密封。利用35W紫外灯以365nm照射48h，紫外聚合UV365nm控制在0～8℃，离心分离。CP的合成方法相同，只是不加模板分子。
将所得的聚合物转移至圆底烧瓶内，先用40mL丙酮分两次混合，静置后除去上层精细颗粒，再用旋转蒸发器真空脱去丙酮至干燥。以手工将聚合物填装至色谱柱(4.6×100mm)，并采用Waters model 510高效液相泵冲洗，以45mL左右的10％乙酸甲醇溶液为流动相流速0.1mL·min-1过夜洗脱。然后联接至紫外检测器，以乙腈为流动相洗脱至基线平直。
将洗脱后的聚合物与丙酮混和静置处理，收集沉淀聚合物，真空干燥得到固相聚合物。在室温条件下，采用干法手工填装到色谱柱(4.6×100mm)，并用Waters model 510高效液相泵填实。检测器为Waters 490E ProgrammableMultiwavelenghth Detector。分别以色谱纯甲醇、乙腈为流动相，以流速0.5mL.min-1洗脱至基线稳定为止。用进样器进注样品10μL，分别以甲醇、乙腈为流动相对结构类似物和模板分子保留行为进行了研究。检测波长设置：对17α-E和17β-E均为281nm，对孕酮(Pro)和雄烯二酮(And)为235nm。以10μL丙酮乙腈溶液(10μL·mL-1)测定死时间。色谱工作站为ANASTAR ChromatographyData System。
容量因子被推导：K′＝(t-t0)/t0，t是所测甾醇的保留时间，t0是死时间；分离因子α＝K′(β-estradiol)/K′(compound)；印迹因子IF＝K′imp/K′blank；选择性因子S＝IF(β-estradiol)/IF(compound)。
图1和表2显示了这对异构体的色谱分离结果(a)和(b)，它们分别是用0.125mmol、0.25mmol17β-雌二醇作为模板分子按上述方法制备的分子印迹聚合物，分别作为固定相填装在4.6i.d×100mm不锈钢柱体的色谱分离结果。(c)是将(a)和(b)串联后表征得到的图谱。对于图1(a)和(b)，10μL的上样液中含有0.5mmol.L-1 17α-雌二醇和17β-雌二醇乙腈溶液，流动相则为含有1％乙酸的乙腈溶液，始终保持流速为0.5mL·min-1，分析物在281nm下检测，且柱压维持在300psi。17α-雌二醇在谱图(a)，(b)和(c)中的保留时间分别是6.01、6.28和12.57min，而对于17β-雌二醇在谱图(a)，(b)和(c)中的保留时间分别是8.32、10.16和21.71min，用丙酮测得的死时间分别是3.25、3.25和6.28min，详见表2。因此，谱图(a)，(b)中MIP的分离因子(α)分别是1.84和2.28，串联柱(c)是2.45，这对异构体在串联柱(c)中显示了几乎接近于基线的分离效果。
表2几种17β-雌二醇分子印迹聚合物的HPLC表征数据a
| 聚合物 | 分析物 | k′cp | k′mip | α | IF | S |
| TFMAA-co-TRIM分子印迹聚合物/对照 | 17β-雌二醇(模板分子)17α-雌二醇4-雄烯-3，17-二酮孕酮17α-雌二醇 | 0.710.710.250.422.14 | 2.130.930.310.412.08 | 1.002.286.865.191.45 | 3.011.321.250.970.97 | 1.002.282.423.091.31 |
(a)模板分子与功能单体比例是1/4，用含1％乙酸乙腈溶液作为流动相，流速设置为0.5mL.min-1，分析物检测波长是281nm/235nm，操作温度，室温。
以0.25mmol17β-雌二醇作为模板分子按上述方法制备的聚合物(b)具有更好的分离效果，原因在于其内部孔穴及外表的单位表面的识别位点数目优于用0.125mmol17β-雌二醇作为模板分子按上述方法制备的聚合物(a)。表3是(a)和(b)两种聚合物经激光粒度检测所得数据。
表3CP3/CP4、MIP3和MIP4的颗粒检测数据
| 聚合物 | 浓度(％，V) | 一致性 | 比表面积(m2/g) | D[3，2](μm) | D[4，3](μm) |
| CP3/CP4MIP3MIP4 | 0.01830.01200.0103 | 0.5640.6950.700 | 0.4250.6630.915 | 14.1199.0566.556 | 32.40618.74811.596 |
表4是在此借用基本色谱分离方程推倒出各自的相对保留值(RAB)、分离度(Rs)、有效理论塔板数(neff)和有效理论塔板高(Heff)。
表4三种分子印迹柱的色谱分离参数
| 名称 | t0 | t17α-E | t17β-E | k′17α-E | k′17β-E | RAB | RS | neff(块/10cm) | Heff(mm) |
| (a)(b)(c) | 3.253.256.28 | 6.016.2812.57 | 8.3210.1621.71 | 0.850.931.00 | 1.562.132.46 | 1.842.282.45 | 0.711.191.45 | 38.8972.3996.46 | 2.571.382.07 |
实施例3
按以下比例分别将0.125mmol、0.25mmol17β-雌二醇作为模板分子，1mmol三氟甲基丙烯酸为功能单体，1mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，15mL乙腈为致孔剂，0.0852mmol偶氮二异丁腈混合溶解，分别加入到100mL医用盐水瓶中，超声波处理3min，通N25min，密封。利用35W紫外灯以365nm照射48h，紫外聚合UV365nm控制在0～8℃，离心分离。CP的合成方法相同，只是不加模板分子。
将所得的聚合物转移至圆底烧瓶内，先用40mL丙酮分两次混合，静置后除去上层精细颗粒，再用旋转蒸发器真空脱去丙酮至干燥。以手工将聚合物填装至色谱柱(4.6×100mm)，并采用Waters model 510高效液相泵冲洗，以45mL左右的10％乙酸甲醇溶液为流动相流速0.1mL·min-1过夜洗脱。然后联接至紫外检测器，以乙腈为流动相洗脱至基线平直。
采用干燥的200mg MIP或CP装填到2.0mL聚乙烯注射器中(BD，USA)(5×0.9cmi.d)，预先在注射器底部安置一片0.5μm孔径的筛板，筛板规格与100mg的C18ODS SPE柱一样。待填料装完毕，用1mL乙腈冲洗柱内壁黏附颗粒和湿润填料，然后安装同样孔径的顶部筛板，MISPE柱或对照柱被制成。先用3×2mL甲醇/乙酸(9/1，v/v)，再用3×2mL乙腈清洗去除残余污物。每次上样前用3×2mL乙腈活化SPE柱中的聚合物。表5列出了乙腈洗提液对17β-雌二醇在MISPE和CSPE中的保留效果的比较。
表5乙腈洗提液对17β-雌二醇在MISPE和CSPE中的保留效果的影响
| 洗提程序(每步收集的滤液中的17β-雌二醇含量所占总量的比例％) | 对照萃取柱CSPE | MISPE |
| 1.2×10-4mol.L-117β-雌二醇的乙腈/水溶液上样液(1mL)乙腈/水(4/6)(1mL)乙腈/水(4/6)(1mL)乙腈/水(4/6)(1mL)乙腈/水(4/6)(1mL)乙腈(1mL)乙腈(1mL)回收率 | 0018.2733.1624.2714.541.4091.64 | 00013.8830.3942.497.6794.42 |
将市售品牌奶粉作为实验原料，先将25g奶粉用75mL甲醇浸提过夜，再将混合物在3000r.min-1离心分离20min，收集上清液到100mL的带橡胶塞的硼硅酸盐玻璃瓶中。将部分初始溶液作为对照。然后将3mL上清液用7mLMilli-Q水稀释，以每次1mL量进行上样，适合的流速收集滤液。然后用3mL的乙腈/水(3/7，v/v)淋洗，最后反复每次以0.5mL的MeOH/ACN(1/1，v/v)进行洗脱直至经HPLC检测基线平直为止。
通过GC/MS验证，与奶粉浸提物中17β-雌二醇含量的比较，MISPE柱对奶粉中17β-雌二醇的回收率达85.5％。
Claims (4)
1.一种17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)反应物配料处理：将一种或两种聚合物功能单体、部分致孔剂分别与模板分子17β-雌二醇标准品混合，超声波处理3～5min混合均匀，冲入氮气密封3min，静置处理3小时；
所述聚合物功能单体选自：丙烯酸类：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、三氟甲基丙烯酸，酰胺类：丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺，吡啶类：2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶；
所述致孔剂选自乙腈、氯仿、二氯甲烷或四氯化碳；
(2)聚合反应：将上述混合物加入交联剂、剩余致孔剂、引发剂，混合均匀后冲氮气密封3min；在容器中采用热引发或光引发方式进行沉淀聚合，合成分子印迹聚合物；
所述交联剂选自：三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯季戊四醇三丙烯酸酯或季戊四醇四丙烯酸酯；
采用的引发剂为偶氮二异丁腈；
热引发反应条件为：聚合温度控制在43℃～90℃，反应16～48小时；或光引发反应条件为：用30W～250W紫外灯在48小时之内聚合得到的产物，聚合温度控制在0℃～8℃；
在步骤(1)和(2)中，模板分子17β-雌二醇与聚合物功能单体的摩尔比例为0.1～1∶1；交联剂与聚合物功能单体的摩尔比例为0.5～5∶1；致孔剂总体积用量与交联剂摩尔数比例mL/mmol为15～30∶1；引发剂与聚合物功能单体的摩尔比例为0.08～0.12∶1
(3)去除模板分子，纯化分子印迹聚合物：将(2)中聚合反应合成的分子印迹聚合物从反应容器中取出，用单一或混合的有机溶剂初步萃取模板分子，继续添加丙酮，静置沉淀，去除悬浮的精细颗粒和模板分子，反复几次沉淀直至悬浮液中不再检测出17β-雌二醇，再用丙酮或甲醇混合，经真空干燥得到纯净的分子印迹聚合物；
(4)检测：色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物：将干燥的聚合物颗粒填装到空的色谱柱中，用甲醇和乙酸的混合试剂作为洗脱流动相，经液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为止，说明已将模板分子去除；
液相检测：Waters model 510高效液相泵填实，检测器为waters 490EProgrammable Multiwavelenghth Detector，分别以色谱纯甲醇、乙腈为流动相，以0.5mL·min-1流速洗脱至基线稳定为止，进样10μL，检测波长设置：对17α-雌二醇和17β-雌二醇均为281nm，对孕酮和雄烯二酮为235nm，以10μL丙酮乙腈溶液10μL·mL-1测定死时间，色谱工作站为ANASTAR ChromatographyData System，考察指标为：容量因子K′＝(t-t0)/t0，t是所测甾醇的保留时间，t0是死时间；分离因子α＝K′(17β-E)/K′compound；印迹因子IF＝K′imp/K′blank；选择性因子S＝IF(17β-E)/IF compound。
2.根据权利要求1所述的17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征是模板分子17β-雌二醇与聚合物功能单体的摩尔比例为0.1～0.3∶1；交联剂与聚合物功能单体的摩尔比例为1∶1；致孔剂总体积用量与交联剂摩尔数比例mL/mmol为15～20∶1；引发剂与聚合物功能单体的摩尔比例为0.08～0.10∶1；
所用聚合物功能单体为三氟甲基丙烯酸，所用交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，所用致孔剂为乙晴；
对反应合成的分子印迹聚合物初步萃取模板分子所用有机溶剂采用甲醇和乙酸混合液，甲醇∶乙酸体积比为9∶1～6∶4。
3.一种生物和食品样品中17β-雌二醇的分离纯化方法，其特征是包括以下步骤：将按权利要求1方法制得的分子印迹聚合物填充到装有孔径为0.25μm筛板注射器的固相萃取SPE柱内，制成分子印迹固相萃取柱MISPE，将真空干燥的生物和食品样品用有机溶剂提取，然后将提取液用蒸馏水稀释，提取液与蒸馏水的体积比为3∶7，用此混合液作为上样液，确保17β-雌二醇被MISPE保留在柱内，再用甲醇与纯净的水配成混合液，甲醇与水体积比为3∶7的混合液淋洗去除干扰物质，然后增加甲醇用量至与水比例为1∶1，进行洗脱，收集洗脱液用于检测。
4.一种测定生物和食品样品中17β-雌二醇的方法，其特征是包括如下步骤：将按权利要求1方法制得的分子印迹聚合物填充到色谱柱内，制成分子印迹色谱柱，将此色谱柱连接到液相色谱系统中对按权利要求2方法得到的洗脱液进行检测。
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