CN106324171A - 一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β‑雌二醇方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β‑雌二醇方法，先制备17β‑雌二醇分子印迹聚合物；再将分子印迹聚合物MIP填充到圆柱形不锈钢预柱中，使用高效液相色谱分析检测；绘制17β‑雌二醇标准曲线，根据标准曲线计算出待测环境水中17β‑雌二醇含量。本发明固相萃取的取吸附剂是17β‑雌二醇分子印迹聚合物，可专一识别17β‑雌二醇，具有非常高的选择性；本发明富集倍数超过490倍，大大降低液相色谱的检出限，适用于水中痕量17β‑雌二醇的吸附检测。

Description

一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β-雌二醇 方法
技术领域
本发明涉及一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β-雌二醇方法，属于高分子材料和分离技术领域。
背景技术
17β-雌二醇是主要的内源雌激素之一，它广泛存在于饮用水中，因此成为环境中内源雌激素进入人体的主要途径。在极低浓度下，就会对人和动物的内分泌系统起极强的干扰作用。大量调查结果和实验室研究表明，环境雌激素对近年来男性睾丸病和前列腺癌发病率的上升，精子数量减少，女性乳腺癌，子宫癌发病率的增加，雄性动物的雌性化和免疫功能的改变等具有不容忽视的作用，已成为一类新的研究和检测的热点物质。环境水体中17β-雌二醇是极其微量的，因此，建立特异性强，灵敏度高的检测方法成为包括17β-雌二醇在内的环境雌激素研究领域中一大课题，也是改善食品安全现状和保护人类健康的有效技术手段。
目前国内外有关17β-雌二醇检测方法大都采用分光光度法、液相色谱法或液相、气相色谱与质谱联用的方法进行定性、定量的检测。液相色谱是常用的检测方法，但灵敏度，在17β-雌二醇含量较低(痕量)时很难检出，通常分离需要富集。固相萃取法比传统的溶剂萃取更快速、准确，在进行固相萃取时则需要使用对17β-雌二醇有高选择性的固相吸附材料。分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique,MIT)是当前制备高选择性材料的主要方法之一，通过该技术制备的分子印迹聚合物在固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离技术等许多领域展示了良好的应用前景。利用分子印迹技术合成的聚合物具有很高的选择性和吸附容量，用于17β-雌二醇含量较低(痕量)的样品的前处理可显著提高分离富集效果，与液相色谱在线联用可显著提高检测方法的灵敏度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β-雌二醇的方法。
本发明采取的技术方案
一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β-雌二醇方法，步骤如下：
1.17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备：
5-30mL氯仿溶液中加入17β-雌二醇、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌5-30min，再在混合液中加入0.1-0.3g活化硅球以及四乙氧基硅烷溶液(17β-雌二醇：γ-氨基丙基三乙氧基硅烷：四乙氧基硅烷按摩尔比1:3:4-10的混合液)，搅拌10-30min；最后加入1.0-5.0mL浓度为0.1mol L-1醋酸反应5-10min后，40-70℃水浴孵化24h。洗脱后80℃下真空干燥10h 得分子印迹聚合物MIP。
2.分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用流程：
(1)取100-200mg步骤1)制备的分子印迹聚合物MIP填充到圆柱形不锈钢预柱中，与高效液相色谱的六通阀相连。
(2)以17β-雌二醇溶液作为标准溶液；将100mL17β-雌二醇标准溶液以1.5-2.5mLmin-1的速度通过不锈钢预柱，弃掉流出物。
(3)以超纯水和色谱甲醇(2：3，体积比)混合溶液作为液相色谱的流动相；流动相以1.0mL min-1的流速反冲洗脱，分析物进入高效液相色谱仪，分析检测。
(4)分析检测后，将流动相以1.0mL min-1的流速反冲洗脱MIP预柱5-10min；
3.配制不同浓度的17β-雌二醇标准溶液并重复步骤2操作；以17β-雌二醇标准溶液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制17β-雌二醇标准曲线。
4.取待测环境水100mL，将待测环境水替换步骤2中17β-雌二醇标准溶液并按照步骤2的流程进行检测。根据标准曲线计算出待测环境水中17β-雌二醇含量。
本发明的优点和积极效果是：
1.本发明固相萃取的取吸附剂是17β-雌二醇分子印迹聚合物，可专一识别17β-雌二醇，具有非常高的选择性。
2.该17β-雌二醇吸附功能材料由化学合成方法制备，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力。成本低廉，实验操作简单，反应条件容易控制。
3.本发明建立分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用，富集倍数超过490倍，大大降低液相色谱的检出限，适用于水中痕量17β-雌二醇的吸附检测。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明是采用分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用技术对17β-雌二醇进行检测。
1.17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备：
在10mL氯仿溶液中加入0.200g 17β-雌二醇和0.50mLγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌5-30min，再加入0.2g活化硅球以及1.30mL四乙氧基硅烷溶液(17β-雌二醇：γ-氨基丙基三乙氧基硅烷：四乙氧基硅烷按摩尔比1:3:8的混合液)，搅拌30min；最后加入1.0mL0.1mol L-1醋酸反应5min后，置于50℃水浴锅中水浴孵化24h。抽滤后100℃真空老化10h。制备的聚合物置于圆底烧瓶中，然后加入40mL甲醇和10mL 1.0mol L-1盐酸，磁力搅拌4h,真空抽滤后，分别用0.1mol L-1氢氧化钠、水以及甲醇洗涤5次，80℃下真空干燥10h 得分子印迹聚合物MIP。
2.分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用流程：
(1)取100mg高吸附性能MIP填充到装在一个圆柱形不锈钢预柱中，不锈钢预柱与高效液相色谱的六通阀相连。
(2)将100mL浓度为0.5mg L-1的17β-雌二醇标准溶液通过流动注射泵以2.5mLmin-1的速度通过不锈钢预柱，弃除流出物。
(3)以超纯水和色谱甲醇按照40％：60％(体积比)的混合溶液作为液相色谱的流动相；流动相以1.0mL min-1的流速反冲洗脱，分析物进入高效液相色谱仪，分析检测。
(4)流动相以1.0mL min-1的流速反冲洗脱MIP预柱10min。
3.分别配制浓度为0.5mg L-1、1.0mg L-1、2.0mg L-1、4.0mg L-1、8.0mg L-1的17β-雌二醇标准溶液并重复步骤2操作；以17β-雌二醇溶液浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制17β-雌二醇标准曲线。
4.取待测环境水100mL，将待测环境水替换步骤2中17β-雌二醇标准溶液并按照步骤2的流程进行检测。根据标准曲线计算出环境水中17β-雌二醇含量为0.17mg L-1。

Claims (2)

1.一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β-雌二醇方法，其特征在于步骤如下：
1)17β-雌二醇分子印迹聚合物的制备：
5-30mL氯仿溶液中加入17β-雌二醇、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌5-30min，再在混合液中加入0.1-0.3g活化硅球以及四乙氧基硅烷溶液，搅拌10-30min；最后加入1.0-5.0mL浓度为0.1mol L-1醋酸反应5-10min后，40-70℃水浴孵化24h；洗脱后80℃下真空干燥10h得分子印迹聚合物MIP；
2)分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用流程：
A、取100-200mg步骤1)制备的分子印迹聚合物MIP填充到圆柱形不锈钢预柱中，与高效液相色谱的六通阀相连；
B、以17β-雌二醇溶液作为标准溶液；将100mL17β-雌二醇标准溶液以1.5-2.5mL min-1的速度通过不锈钢预柱，弃掉流出物；
C、使用超纯水和色谱甲醇按照体积比2：3的混合溶液作为液相色谱的流动相；流动相以1.0mL min-1的流速反冲洗脱，分析物进入高效液相色谱仪，分析检测；
D、分析检测后，将流动相以1.0mL min-1的流速反冲洗脱MIP预柱5-10min；
3)配制不同浓度的17β-雌二醇标准溶液并重复步骤2)操作；以17β-雌二醇标准溶液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制17β-雌二醇标准曲线；
4)取待测环境水100mL，将待测环境水替换步骤2)中17β-雌二醇标准溶液并按照步骤2)的流程进行检测；根据标准曲线计算出待测环境水中17β-雌二醇含量。
2.如权利要求1所述的一种分子印迹在线固相萃取与液相色谱联用检测17β-雌二醇方法，其特征在于所述四乙氧基硅烷溶液为17β-雌二醇：γ-氨基丙基三乙氧基硅烷：四乙氧基硅烷按摩尔比1:3:4-10的混合液。
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