CN105466980A - 一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法，包括步骤：S1用微电极阵列构成微电极生物传感器，所述微电极阵列连接有信号采集模块和电化学工作站；S2用微电极生物传感器测试抗坏血酸标准溶液，获取抗坏血酸浓度与电流信号关联的数学模型；S3将微电极生物传感器插入待测的植株活体，获取植株活体对输入的电信号的响应，根据步骤S2的数学模型求得待测植株活体样品中抗坏血酸浓度。本发明提出的检测设备便携，检测条件简单，可田间操作，并实现连续检测。

Description

一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种利用生物传感器检测抗坏血酸的方法。

背景技术

抗坏血酸是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质。它可以直接与单线态氧、超氧自由基、过氧化氢和羟自由基等活性氧反应,因此在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用。同时抗坏血酸也是一些关键性酶的反应底物，因而抗坏血酸在植物的生长发育及植物对环境胁迫响应的过程中起着重要作用,有必要检测和监控植物组织中抗坏血酸含量。

目前抗坏血酸检测时常用经典的碘量法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、火焰原子吸收光谱法、分光光度法等。例如荧光分光光度法将植株鲜样加偏磷酸-乙酸溶液，打碎成匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释。取样品滤液加活性炭，再加入硼酸-乙酸钠溶液，进行荧光光谱检测。

虽然光谱、色谱、质谱检测方法准确度高，但对样品提取的纯度要求也较高，并且以上方法需要对植物材料进行离体取样，对样品前处理要求较高，通过检测浸提液中物质的浓度，所获取的结果是某一状态下的静态浓度，无法体现植物对环境变化的动态响应。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于微电极生物传感器技术的植株活体抗坏血酸快速检测方法，以克服现有技术中样本前处理复杂、不可逆破坏样本、只能静态检测的缺陷。

实现本发明目的的技术方案为：

一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法，包括步骤：

S1用微电极阵列构成微电极生物传感器，所述微电极阵列连接有信号采集模块和电化学工作站；

S2用微电极生物传感器测试抗坏血酸标准溶液，获取抗坏血酸浓度与电流信号关联的数学模型；

S3将微电极生物传感器插入待测的植株活体，获取植株活体对输入的电信号的响应，根据步骤S2的数学模型求得待测植株活体样品中抗坏血酸浓度。

其中，所述微电极阵列通过MEMS工艺设置在硅片基底上，硅片基底具有尖端部分，所述尖端部分上设置有对电极、工作电极和参比电极，所述工作电极为L-半胱氨酸、纳米金、壳聚糖修饰的金电极。

其中，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。

优选地，硅片基底的长度为4～6cm，尖端部分长度为3～20mm；硅片基底的厚度为0.5～2mm，硅片基底另一端上设置有连接元件。

硅片基底上设置微电极阵列的方法采用MEMS标准工艺，在硅基底上涂布光刻胶，再根据制备的形状进行光蚀刻，将蚀刻掉部分电沉积金属，最后剥落蚀刻胶；

针对不同部位沉积不同金属，通过电化学沉积将微电极阵列中分别修饰成镀铂对电极、银/氯化银参比电极、镀金工作电极，获得包括对电极、工作电极和参比电极的微电极阵列，对电极、工作电极和参比电极设置在尖端部分，并导电连接位于硅片基底另一端的连接元件。

进一步地，所述工作电极的制备方法为：

1)配制10mmol/LL-半胱氨酸溶液，将它滴在金电极表面，在室温、湿度100％下修饰15～20h(静置15～20h)，后用去离子水清洗干净，得到L-半胱氨酸修饰的金电极；

2)将直径8～20nm纳米金溶胶滴涂在L-半胱氨酸修饰好的金电极上，在室温、湿度100％下修饰15～20h，后用去离子水清洗干净，得到纳米金修饰的金电极；

3)将抗坏血酸氧化酶超声溶解在含50～80％(质量百分比)壳聚糖溶液中，得浓度为0.1～2mol/L抗坏血酸氧化酶混合溶液，将该混合溶液滴涂在纳米金修饰好的金电极上，在2～5℃、湿度100％下修饰20～30h，后用去离子水清洗干净，得到工作电极，储存在0℃～10℃下。

本发明生物传感器制备过程中，金电极进行修饰之前，先用金相砂纸打磨至光滑，然后用去离子水超声清洗干净；将金电极置于0.5mol/L稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.2～1.6V，得到典型的循环伏安谱图，证明电极表面干净；否则再次打磨和清洗。

纳米金的制备可以为：向40mL的蒸馏水中加入质量分数为2％的HAuCl₄溶液0.5mL，混匀，边加热变搅拌至沸，再加入10mL，10mmol·L^-1的柠檬酸钠溶液，可见溶液颜色由黄色变深蓝色直至酒红色，搅拌下继续加热10min，停止加热。

其中，所述S2为：配制pH＝7～8、浓度为0mmol/L和1～10mmol/L的一系列葡萄糖-磷酸缓冲溶液，使用微电极生物传感器进行循环伏安检测，电压范围为-0.2～1.0V，扫描速度为50～150mV/s，得到一组浓度与还原峰电流的关系曲线，制作微电极工作曲线。

进一步地，所述S2获取微电极工作曲线后，用已知浓度的抗坏血酸标准溶液进行校正，用抗坏血酸标准溶液测得的工作曲线与微电极工作曲线偏差15％以内则说明微电极可正常工作。

其中，所述S3中，将微电极生物传感器插入待测的植株活体，进行循环伏安检测，电压范围为-0.2～1.0V，扫描速度为50～150mV/s。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提出基于微电极阵列的植株活体抗坏血酸检测技术，微电极阵列设置在硅片基底上，整个生物传感器具有尖端，可以穿透植物组织(包括叶片、茎秆、果实等)，基于微电极阵列设置电流或电压扰动，直接获取植株活体的响应信号；植株被检测部位无需离体、无破坏性损伤，只需清洁微电极裸露部分的表面、固定植株组织即可进行活体检测；

本发明的检测设备便携，检测条件简单，可田间操作，并实现连续检测。

附图说明

图1是微电极阵列结构图。

图中，1为硅片基底，2为工作电极，3为参比电极，4为铂电极，5为连接元件。

图2为工作电极修饰过程示意图。

图3为实施例2进行的循环伏安扫描的结果。

具体实施方式

现以以下最佳实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中，如无特别说明，所采用的手段均为本领域公知的技术手段。

实施例1：

如图1，微电极阵列通过蚀刻技术和电沉积技术在硅片基底1上制备而成，长5cm，厚1.5mm，其中尖端部分长4mm，裸露部分上顺次设置工作电极2、参比电极3、对电极4，硅片基底1向外方向为尖端，另一端较宽，其上设置连接元件5(一个电极连接一个相应的连接元件)。其中Ag/AgCl为参比电极，铂为对电极，修饰金电极为工作电极。检测时用电化学工作站连接本微电极阵列中的连接元件5，通过电化学工作站循环伏安法检测电流，再将电流数据换算为浓度数据，由信号采集模块采集数据。

参见图2，金电极的修饰步骤如下：

1)用金相砂纸打磨金电极至光滑，用去离子水并超声清洗干净。随后将微电极置于0.5mol/L稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描(-0.2～1.6V)得到典型的循环伏安谱图，已证电极表面干净。

2)配制10mmol/L的L-半胱氨酸溶液，将它滴在金电极表面，在室温、湿度100％下修饰18h，后用去离子水清洗干净，得到修饰的金电极。

3)将直径13nm纳米金溶胶滴涂在2)中修饰好的金电极上，在室温、湿度100％下修饰18h，后用去离子水清洗干净，得到修饰的金电极。纳米金溶胶用HAuCl₄制备，透射电镜检测其中溶胶颗粒的粒径约为13nm。

4)将抗坏血酸氧化酶超声溶解在含65％的壳聚糖溶液中，将浓度为0.5mol/L抗坏血酸氧化酶混合溶液滴涂在3)中修饰好的金电极上，在4℃、湿度100％下修饰24h，后用去离子水清洗干净，得到修饰的工作电极，储存在4℃下。

实施例2

分别配制浓度为0、1、2、4、6、8、10mmol/L葡萄糖-磷酸缓冲(pH＝7.4)溶液，使用制备的微电极进行循环伏安法检测(电压-0.2～1.0V，扫描速度100mV/s)，得到一组不同浓度下还原峰电流的曲线(图3)，制作微电极工作曲线，线性方程为i＝1.308+0.0515c(电流i的单位为μA，浓度c的单位为mmol/L)，线性范围可达1-10mmol/L。

实施例1制备的微电极在清洗后，首先分别检测三份标准浓度(2,5,8mmol/L)抗坏血酸溶液进行电化学校准，生物传感器系统将通过计算自动调整偏差以符合工作曲线，斜率偏差在15％以内，确定微电极可正常工作。

待测样品为北京市农林科学院温室种植的“京科968”玉米，分别选取两株玉米的茎秆、叶片为检测样本1-1、1-2、2-1、2-2。清洁后，在待测样本上取下一块茎秆或叶片组织，再将微电极尖端部分插入玉米伤口处，连接瑞士万通Autolab电化学工作站，开始电化学检测；作为对比，将取下的组织进行色谱检测。

校正后对样品进行循环伏安扫描(电压-0.2～1.0V，扫描速度100mV/s)，稳定测试5min后，获得的电流信号被生物传感系统通过工作曲线计算得到被测样品浓度。

作为对比，同样的样品用国标方法(GB12392-90蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法)检测，检测结果列于表1。

表1测试结果对比

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，包括步骤：

S1用微电极阵列构成微电极生物传感器，所述微电极阵列连接有信号采集模块和电化学工作站；

S2用微电极生物传感器测试抗坏血酸标准溶液，获取抗坏血酸浓度与电流信号关联的数学模型；

S3将微电极生物传感器插入待测的植株活体，获取植株活体对输入的电信号的响应，根据步骤S2的数学模型求得待测植株活体样品中抗坏血酸浓度。

2.根据权利要求1所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，所述微电极阵列通过MEMS工艺设置在硅片基底上，硅片基底具有尖端部分，所述尖端部分上设置有对电极、工作电极和参比电极，工作电极为L-半胱氨酸、纳米金、壳聚糖修饰的金电极。

3.根据权利要求2所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，所述对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。

4.根据权利要求2所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，硅片基底的长度为4～6cm，尖端部分长度为3～20mm；硅片基底的厚度为0.5～2mm，硅片基底另一端上设置有连接元件。

5.根据权利要求2所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，所述工作电极的制备方法为：

1)配制10mmol/L的L-半胱氨酸溶液，将它滴在金电极表面，在室温、湿度100％下修饰15～20h后用去离子水清洗干净，得到L-半胱氨酸修饰的金电极；

2)将直径8～20nm纳米金溶胶滴涂在L-半胱氨酸修饰好的金电极上，在室温、湿度100％下修饰15～20h，后用去离子水清洗干净，得到纳米金修饰的金电极；

3)将抗坏血酸氧化酶超声溶解在含50～80％壳聚糖溶液中，得浓度为0.1～2mol/L抗坏血酸氧化酶混合溶液，将该混合溶液滴涂在纳米金修饰好的金电极上，在2～5℃、湿度100％下修饰20～30h，后用去离子水清洗干净，得到工作电极，储存在0℃～10℃下。

6.根据权利要求5所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，金电极进行修饰之前，先用金相砂纸打磨至光滑，然后用去离子水超声清洗干净；将金电极置于0.5mol/L稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.2～1.6V，得到典型的循环伏安谱图，证明电极表面干净；否则再次打磨和清洗。

7.根据权利要求1～6任一所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，所述S2为：配制pH＝7～8、浓度为0mmol/L和1～10mmol/L的一系列葡萄糖-磷酸缓冲溶液，使用微电极生物传感器进行循环伏安检测，电压范围为-0.2～1.0V，扫描速度为50～150mV/s，得到一组浓度与还原峰电流的关系曲线，制作微电极工作曲线。

8.根据权利要求1～6任一所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，所述S2获取微电极工作曲线后，用已知浓度的抗坏血酸标准溶液进行校正，用抗坏血酸标准溶液测得的工作曲线与微电极工作曲线偏差15％以内则说明微电极可正常工作。

9.根据权利要求1～6任一所述的植株活体抗坏血酸检测方法，其特征在于，所述S3中，将微电极生物传感器插入待测的植株活体，进行循环伏安检测，电压范围为-0.2～1.0V，扫描速度为50～150mV/s。