CN108398476B - 活体检测水杨酸的生物传感器及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微电极生物技术领域，具体涉及一种活体检测水杨酸的生物传感器及其构建方法与应用。针对现有检测技术的缺点，本发明通过使用印刷电极作为工作电极，实现植物叶片等部位的水杨酸的活体检测，真实的对水杨酸信息的即时获取，获得更多活体的、即时的信息。并且印刷电极成本低廉，可一次性使用，从而可以解决水杨酸氧化产物吸附的问题。

Description

活体检测水杨酸的生物传感器及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微电极生物技术领域，具体涉及一种活体检测水杨酸的生物传感器及其构建方法与应用。

背景技术

作为存在最广泛的植物激素，水杨酸是一种典型的内源性信号分子，参与调节多种生理过程：种子萌发、新陈代谢、开花结果、植物抗逆等，因此检测植物体内水杨酸的含量有助于研究其代谢过程及作用机理。

植物激素的检测方法，现有生物测定法、免疫分析法、荧光法、气相色谱法、液相色谱法等等。然而，这些方法需要昂贵的仪器和复杂的样品制备过程。样本的采集通常会造成植物体的损伤甚至死亡。并且这些方法都属于离体检测，只能反映静态结果及累积效应，不能反应植物对环境变化的即时相应，因此急需发展水杨酸的活体检测方法。但是目前水杨酸的电化学传感器通常采用的是传统的玻碳电极、金电极等，直径在5mm左右，不能进行活体检测应用。并且水杨酸的氧化产物极易吸附到电极表面，造成电极毒化，影响检测效果。

发明内容

针对现有检测技术的缺点，本发明通过使用印刷电极作为工作电极，实现植物叶片等部位的水杨酸的活体检测，真实的对水杨酸信息的即时获取，获得更多活体的、即时的信息。并且印刷电极成本低廉，可一次性使用，从而可以解决水杨酸氧化产物吸附的问题。

本发明提供的生物传感系统由印刷电极、信号采集系统等主要模块构成，获取的电流为μA级。

本发明使用的印刷电极为常见的市售印刷电极，其中工作电极需要用金铂纳米颗粒、石墨烯、全氟磺酸溶液修饰而成。

用已知标准浓度的水杨酸溶液对电极和系统进行校正，获取斜率S和截距I，斜率偏差在15％之内表明电极可通过计算校正以正常使用。然后将印刷电极置于待测植株部位，连接电化学系统获取电流I，单位为μA，通过校正的工作曲线计算得到被测部位水杨酸浓度C，单位为μM。

本发明方案如下：

一种用于活体检测植物体水杨酸的印刷电极，制备方法包括如下步骤：

1)取市售普通印刷电极，用去离子水清净表面，然后将该印刷电极置于磷酸缓冲溶液(例如0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲溶液)中进行电压为1.7V的计时电流法扫描，对该印刷电极通过电化学工作站(例如瑞士万通电化学工作站)进行活化；

所述印刷电极工作电极为碳黑，参比电极为Ag/AgCl，对电极为碳；

2)经步骤1)活化后的印刷电极在-0.2V下通过计时电流法在含有氯铂酸和氯金酸的硫酸溶液中进行电沉积(优选沉积300s)，随后用去离子水清洗干净，得到金/铂纳米花修饰的碳黑电极；

3)将步骤2)修饰好的印刷电极放入氧化石墨烯分散液中在0～-1.5V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积(优选10min)，随后用去离子水清洗干净，得到石墨烯修饰的金/铂纳米花/碳黑电极；

4)将浓度为0.005～0.1％的nafion溶液(优选浓度为0.02％)滴涂在步骤3)中修饰好的印刷电极上，再烘干干燥，随后用去离子水清洗干净，得到nafion修饰的石墨烯/金/铂纳米花/碳黑电极；

5)将厚度≤5mm、分子量≥50kd的透析膜用绝缘胶带固定覆盖在印刷电极的反应区上，使得被测液体能够通过透析膜进入电极反应区，即得用于活体检测植物体水杨酸的印刷电极。

一般地，步骤1)所述市售普通印刷电极为长条形电极，一端为反应区，另一端用于连接导电；所述反应区近似为正方形，其中心的圆形区域是工作电极，外环形区域分割成参比电极和对电极。

进一步地，步骤2)中所述含有氯铂酸和氯金酸的硫酸溶液中氯铂酸、氯金酸、硫酸浓度均小于等于1mol/L即可。

更进一步地，步骤2)中所述含有氯铂酸和氯金酸的硫酸溶液中氯铂酸、氯金酸、硫酸浓度分别为1mmol/L、9mmol/L、0.1mol/L。

进一步地，步骤3)中所述氧化石墨烯分散液的浓度≤2mg/mL即可；更进一步地，所述氧化石墨烯分散液的浓度为1mg/mL。

进一步地，步骤5)所述透析膜厚度为1～5mm、分子量为50～100kd。

本发明还包括上述方法制备的用于活体检测植物体水杨酸的印刷电极。

本发明还提供一种生物传感系统，包括上述印刷电极、信号采集系统等主要模块，获取的电流为μA级。

本发明还提供上述印刷电极或上述生物传感系统在活体检测植物体水杨酸等方面的应用。

本发明还提供一种活体检测植物体水杨酸的方法，包括以下步骤：

1)分别配制一系列不同浓度的水杨酸-磷酸缓冲溶液(pH＝6.0)，使用上述印刷电极进行伏安法检测，检测电位需包含0.9-1.2V，得到一组浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，制作电极工作曲线；

2)选取待测植物的适当部位，刮去表皮(以渗透出植物体液为准)作为检测部位，将上述印刷电极的工作区域贴在检测部位并固定，然后按步骤1)相同方法进行伏安法检测，检测电位需包含0.9-1.2V；将获得的电流信号通过上述校正后的工作曲线计算得到被测样品的水杨酸即时浓度。

进一步地，上述方法还包括分别检测标准水杨酸溶液(例如三份标准浓度1，10，100μmol/L的水杨酸溶液)进行电化学校准，计算工作曲线与标准曲线斜率偏差如在15％以内，认为电极可正常工作。校正后对样品进行伏安扫描，获得的电流信号通过校正后的工作曲线计算得到被测样品的即时浓度。

进一步地，待测植物包括作物、绿植、花卉等。

进一步地，检测部位包括植物体的根、茎、叶、果实等组织，尤其适用于叶片组织。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用原料均可市售购得。

本发明的关键点：

1)本发明是在活体检测分析植物体中水杨酸的即时浓度；

2)基于印刷电极的能够专一检测水杨酸的独特电极修饰方法；

3)印刷电极成本低廉，可一次性使用，从而可以解决水杨酸氧化产物吸附的问题；

4)检测目标材料是植物体，包括作物、绿植、花卉等；

5)检测部位是植物体的叶片、果实等组织，尤其适用于叶片组织；

6)植株被检测部位无离体、无破坏性损伤。

本发明的有益效果：

本发明能够实现植株水杨酸活体检测分析，印刷电极成本低廉，可一次性使用，从而可以解决水杨酸氧化产物吸附的问题。相对于传统的生物鉴定、化学检测方法来说，该方法无需离体取样、处理等步骤，检测方法直接可靠快速简便。

附图说明

图1为本发明印刷电极制备过程示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

用于活体检测植物体水杨酸的印刷电极的制备

1、市售普通印刷电极约为长30mm宽6mm厚0.5mm的长条形电极，一端为反应区约为长6mm的正方形，其中中心直径2.5mm的圆形区域是工作电极，外环形区域分割成参比电极和对电极，其中参比电极为Ag/AgCl，对电极为碳，工作电极为碳黑；另一端用于连接导电。

2、用去离子水清洗干净电极表面，随后将印刷电极置于0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲溶液中进行电压为1.7V的计时电流法扫描对印刷电极通过瑞士万通电化学工作站进行活化。

3、配制含有1mmol/L氯铂酸和9mmol/L氯金酸的0.1mol/L硫酸溶液，印刷电极在-0.2V下通过计时电流法在上述配制的硫酸溶液中进行电沉积300s，随后用去离子水清洗干净，得到金/铂纳米花修饰的碳黑电极。

4、将步骤3中修饰好的印刷电极放入1mg/mL的氧化石墨烯分散液中，在0～-1.5V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积10min，随后用去离子水清洗干净，得到石墨烯修饰的金/铂纳米花/碳黑电极。

5、将浓度为0.02％nafion溶液滴涂在步骤4中修饰好的印刷电极上，再烘干干燥，随后用去离子水清洗干净，得到nafion修饰的石墨烯/金/铂纳米花/碳黑电极。

6、将分子量100kd、厚1mm的透析膜用绝缘胶带固定覆盖在印刷电极的反应区上，使得被测液体通过透析膜进入电极反应区，即得用于活体检测植物体水杨酸的印刷电极。制备过程参见图1。

实施例2

利用印刷电极生物传感器技术检测芦荟叶片样本中的水杨酸含量。

1、分别配制浓度为0、0.5、1、10、50、100、200、300、400、500μM水杨酸-磷酸缓冲溶液(pH＝6.0)，使用实施例1制备的印刷电极进行伏安法检测，检测电位需包含0.9-1.2V；得到一组浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，制作电极工作曲线，线性方程为i＝11.94+1.24c(电流单位μA，浓度单位μM)，线性范围可达0.5～500μM。

2、将上述实施例1制备的印刷电极在清洗后，首先分别检测三份标准浓度(1，10，100μmol/L)标准水杨酸溶液进行电化学校准，计算工作曲线与标准曲线斜率偏差如在15％以内，认为电极可正常工作。检测方法与按步骤1相同(伏安法检测)，检测电位需包含0.9-1.2V；校正后对样品进行伏安扫描，获得的电流信号通过校正后的工作曲线计算得到被测样品的即时浓度。

3、植物活体检测应用：待测芦荟为购买的中华芦荟，进行不同浓度的盐胁迫处理：对照组(0mm NaCl)，处理组1(50mm NaCl)，处理组2(150mm NaCl)三组。选取芦荟叶片为检测样本。清洁后选择叶片大小约直径2mm作为检测部位，刮去芦荟叶片表皮，使之渗透出植物体液，将制备的水杨酸检测印刷电极工作区域贴在芦荟叶片检测部位并固定，然后按步骤1)相同方法进行伏安法检测，检测电位需包含0.9-1.2V。

4、切取微电极检测部位的组织进行HPLC-MS检测，与传感器检测的即时结果进行对比，如表1所示。

该微电极传感检测结果的变化趋势与HPLC-MS的趋势一致，但结果更为准确可靠。

表1

处理组	传感器(ng/g)	HPLC-MS(ng/g)
			0mm	256.38±50.23	238.46±40.55
50mm	182.65±36.42	172.55±34.68
			100mm	156.53±30.22	138.65±27.92

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种用于活体检测植物体水杨酸的印刷电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取普通印刷电极，用去离子水清净表面，然后将该印刷电极置于磷酸缓冲溶液中进行电压为1.7V的计时电流法扫描，对该印刷电极通过电化学工作站进行活化；

所述印刷电极工作电极为碳黑，参比电极为Ag/AgCl，对电极为碳；

2)经步骤1)活化后的印刷电极在-0.2V下通过计时电流法在含有氯铂酸和氯金酸的硫酸溶液中进行电沉积，随后用去离子水清洗干净，得到金/铂纳米花修饰的碳黑电极；

3)将步骤2)修饰好的印刷电极放入氧化石墨烯分散液中在0～-1.5V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积，随后用去离子水清洗干净，得到石墨烯修饰的金/铂纳米花/碳黑电极；

4)将浓度为0.005～0.1％的nafion溶液滴涂在步骤3)中修饰好的印刷电极上，再烘干干燥，随后用去离子水清洗干净，得到nafion修饰的石墨烯/金/铂纳米花/碳黑电极；

5)将厚度≤5mm、分子量≥50kd的透析膜用绝缘胶带固定覆盖在印刷电极的反应区上，使得被测液体能够通过透析膜进入电极反应区，即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述含有氯铂酸和氯金酸的硫酸溶液中氯铂酸、氯金酸、硫酸浓度均小于等于1mol/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述含有氯铂酸和氯金酸的硫酸溶液中氯铂酸、氯金酸、硫酸浓度分别为1mmol/L、9mmol/L、0.1mol/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述氧化石墨烯分散液的浓度≤2mg/mL；所述nafion溶液的浓度为0.02％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述氧化石墨烯分散液的浓度为1mg/mL。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)所述透析膜厚度为1～5mm、分子量为50～100kd。

7.权利要求1-6任一项所述方法制备的印刷电极。

8.一种生物传感系统，其特征在于，包括权利要求7所述印刷电极、信号采集系统；所述生物传感系统获取的电流为μA级。

9.权利要求7所述印刷电极或权利要求8所述生物传感系统在活体检测植物体水杨酸方面的应用。

10.一种活体检测植物体水杨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别配制一系列不同浓度的水杨酸-磷酸缓冲溶液，使用权利要求7所述印刷电极进行伏安法检测，检测电位需包含0.9-1.2V，得到一组浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，制作电极工作曲线；

2)选取待测植物的适当部位，刮去表皮作为检测部位，将上述印刷电极的工作区域贴在检测部位并固定，然后按步骤1)相同方法进行伏安法检测，检测电位需包含0.9-1.2V；将获得的电流信号通过校正后的工作曲线计算得到被测样品的水杨酸即时浓度。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，待测植物包括作物、绿植、花卉；检测部位包括植物体的根、茎、叶、果实。

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