CN105319256B - 基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法 - Google Patents

基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，能够在不破坏待测植物待测器官的情况下，实现对待测器官内脯氨酸浓度的准确检测。方法包括：S1、将对电极、参比电极和工作电极集成为一个微电极阵列；S2、将微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，利用电化学工作站，采用循环伏安法采集待测部位中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流，在电流变化平稳后，计算预设时长的电流的平均值，通过将平均值代入预先计算的脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式，得到待测部位内的脯氨酸浓度。

Description

基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法
技术领域
本发明涉及植物脯氨酸检测领域，具体涉及一种基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法。
背景技术
植物体内生物活性有机小分子的合成、代谢、运输和积累贯穿植物整个生长周期，影响植物的生长、开花、发育、结实等生命过程。当植物受干旱、低温、高盐、重金属等非生物因素的影响时，都会直接或间接地发生水分胁迫。为了适应逆境，植物通常会在短时间内，通过迅速大量地合成和积累如脯氨酸、甜菜碱等一系列渗透调节物质，以此来增强其对渗透胁迫的抵抗能力。脯氨酸(Pro)作为一种重要的渗透调节物质，以游离状态存在于植物细胞中，通过调节细胞渗透压或参与信号的长距离传导，参与植物抗逆过程。通过检测植物体内脯氨酸的浓度，对作物抗逆机理、品种筛选等研究至关重要。
目前的植物生理研究中，对植物脯氨酸浓度的检测多还是利用化学分析方法和仪器分析法进行离体测定，例如染料结合法、酸性茚三酮法、色谱法。受限于该类检测技术的时间响应灵敏度问题，获取到的脯氨酸信息通常反应的是环境变化造成的累积效应，这些静态分析指标可以在一定程度解释脯氨酸活动规律，但脯氨酸代谢过程和作用机理仍存在大量未解决的问题。比如在遭遇逆境时的瞬时变化和即时效应是现有检测手段捕捉不到的。而且现有检测脯氨酸技术均采用离体取样，对样本材料构成破坏或损害，尤其珍贵材料可能造成彻底破坏。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，能够在不破坏待测植物待测器官的情况下，实现对待测器官内脯氨酸浓度的准确检测。
为此目的，本发明提出一种基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，包括：
S1、将对电极、参比电极和工作电极集成为一个微电极阵列，其中，所述工作电极为修饰过的玻碳电极，所述修饰过的玻碳电极是将玻碳电极依次经全氟磺酸、金纳米和碳纳米管修饰得到的，所述对电极、参比电极和修饰过的玻碳电极连接电化学工作站；
S2、将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，利用所述电化学工作站，采用循环伏安法采集所述待测部位中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流，在所述电流变化平稳后，计算预设时长的电流的平均值，通过将所述平均值代入预先计算的脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式，得到所述待测部位内的脯氨酸浓度。
本发明实施例所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，基于电化学工作站，采用循环伏安法采集待测部位中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流，并进行处理得到待测部位内的脯氨酸浓度，整个过程不会对环境造成过大的改变，因而检测得到的脯氨酸浓度较为准确，能够反映待测部位在自然环境条件下积累的脯氨酸的浓度且操作简便、检测速度较快，不对待测植物的待测部位进行不可逆的损害，因此能够在不破坏待测植物待测器官的情况下，实现对待测器官内脯氨酸浓度的准确检测，为揭示植物生命活动规律、植物生命现象本质提供更多的理论依据。
附图说明
图1为本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法一实施例的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本实施例公开一种基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，包括：
S1、将对电极、参比电极和工作电极集成为一个微电极阵列(微电极阵列通过蚀刻技术、喷涂技术、电沉积技术等制备，其外形具有穿透植物组织的能力)，其中，所述工作电极为修饰过的玻碳电极，所述修饰过的玻碳电极是将玻碳电极依次经全氟磺酸、金纳米和碳纳米管修饰得到的，所述对电极、参比电极和修饰过的玻碳电极连接电化学工作站；
S2、将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，利用所述电化学工作站，采用循环伏安法采集所述待测部位中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流(反复测试，可以得到可重复的较好的工作曲线)，在所述电流变化平稳后，计算预设时长的电流的平均值，通过将所述平均值代入预先计算的脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式，得到所述待测部位内的脯氨酸浓度。
本发明实施例所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，基于电化学工作站，采用循环伏安法采集待测部位中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流，并进行处理得到待测部位内的脯氨酸浓度，整个过程不会对环境造成过大的改变，因而检测得到的脯氨酸浓度较为准确，能够反映待测部位在自然环境条件下积累的脯氨酸的浓度且操作简便、检测速度较快，不对待测植物的待测部位进行不可逆的损害，因此能够在不破坏待测植物待测器官的情况下，实现对待测器官内脯氨酸浓度的准确检测，为揭示植物生命活动规律、植物生命现象本质提供更多的理论依据。
可选地，在本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法的另一实施例中，在所述将对电极、参比电极和工作电极集成为一个微电极阵列之前，还包括：
对玻碳电极依次进行抛光、超声清洗，直至表面洁净光滑；
配制全氟磺酸，在所述玻碳电极上修饰所述全氟磺酸，并利用所述电化学工作站，对所述玻碳电极进行交流阻抗扫描，直至修饰成功；
制备金纳米颗粒溶胶，将所述金纳米颗粒溶胶滴加到所述玻碳电极表面，并利用所述电化学工作站，对所述玻碳电极进行交流阻抗扫描，直至修饰成功；
在所述玻碳电极上修饰碳纳米管，并利用所述电化学工作站，对所述玻碳电极进行交流阻抗扫描，直至修饰成功，得到所述修饰过的玻碳电极。
可选地，在本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法的另一实施例中，在所述通过将所述平均值代入预先计算的脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式，得到所述待测部位内的脯氨酸浓度之前，还包括：
S30、将所述电极的检测端放入校正液中，并利用所述电化学工作站，采用循环伏安法采集所述校正液中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流(反复测试，可以得到可重复的较好的氧化峰电流随电压的工作曲线)，在所述电流变化平稳后，计算所述预设时长的电流的平均值，其中，所述校正液为溶解有脯氨酸的磷酸缓冲液，所述校正液的pH值的范围为4.0～7.0，所述校正液中脯氨酸的浓度为第一浓度；
S31、按照步骤S30再计算至少一组校正液所对应的电流的平均值，其中，步骤S31中所使用的校正液与步骤S30中所使用的校正液的pH值相同，步骤S31中所使用的校正液中脯氨酸的浓度为第二浓度，所述第一浓度与所述第二浓度不同；
S32、利用计算得到的至少两组电流的平均值及其对应的校正液中脯氨酸的浓度进行线性拟合，得到脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式。
本发明实施例中，脯氨酸在溶液中会被碳纳米管吸附，采用循环伏安法对工作电极施加电压时，脯氨酸会在工作电极的催化作用下发生氧化反应(这是一个氨基酸脱羧过程)，产生氧化峰电流，从而得到电压-氧化峰电流工作曲线。在最佳实验条件下，脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流的平均值在脯氨酸浓度为1.0×10-6～2×10-4mol L-1范围内呈现良好的线性关系，关系式为Ip(μA)＝2.461×104C(mol L-1)+4.5432，相关系数为0.9973，检测限为2×10-8mol L-1。
可选地，在本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法的另一实施例中，所述步骤S30和步骤S31中所使用的脯氨酸和磷酸盐的混合溶液中脯氨酸的浓度不小于2×10-8mol L-1，且适宜范围为1.0×10-6～2×10-4mol L-1。
可选地，在本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法的另一实施例中，若所述待测部位为叶片，则所述电极为贴片式电极，所述将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，包括：
将所述微电极阵列上电极的检测端放在所述叶片表面，并压入所述叶片。
可选地，在本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法的另一实施例中，若所述待测部位为除叶片外的其它部位，则所述电极为针式电极，所述将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，包括：
将所述微电极阵列上电极的检测端插入所述待测部位。
可选地，在本发明基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法的另一实施例中，所述预设时长为5～10分钟。
下面对本发明一具体实施例进行详细介绍。
选用玉米“京科1号”品种作为实验材料。精选种子播种在花盆中，在培养室培养。当幼苗长至6～8叶龄、节长6～8cm时，分别选取第3、4和5叶片、第2节茎三个部位进行检测。
对于每一待测部位，将三个制作好的电极连接到电化学工作站，并插入或压入一株玉米的待测部位，然后采用循环伏安法采集脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流。电流变化平稳后，采集数据5-10min，用于脯氨酸浓度计算。
对于每一待测部位，按照本发明的检测方法和现有的液相色谱法分别进行两次实验，最终得到玉米四个待测部位内的脯氨酸浓度如下表所示：
表1测试结果对比
由表可以看出，利用基于本发明微电极技术检测的玉米茎秆、叶片的脯氨酸浓度与采用液相色谱法检测的结果基本吻合。该方法检测结果可靠，利于田间在线检测。
虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出各种修改和变型，这样的修改和变型均落入由所附权利要求所限定的范围之内。

Claims (6)

1.一种基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，其特征在于，包括：
S1、将对电极、参比电极和工作电极集成为一个微电极阵列，其中，所述工作电极为修饰过的玻碳电极，所述修饰过的玻碳电极是将玻碳电极依次经全氟磺酸、金纳米和碳纳米管修饰得到的，所述对电极、参比电极和修饰过的玻碳电极连接电化学工作站；
S2、将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，利用所述电化学工作站，采用循环伏安法采集所述待测部位中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流，在所述电流变化平稳后，计算预设时长的电流的平均值，通过将所述平均值代入预先计算的脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式，得到所述待测部位内的脯氨酸浓度；
在所述将对电极、参比电极和工作电极集成为一个微电极阵列之前，还包括：
对玻碳电极依次进行抛光、超声清洗，直至表面洁净光滑；
配制全氟磺酸，在所述玻碳电极上修饰所述全氟磺酸，并利用所述电化学工作站，对所述玻碳电极进行交流阻抗扫描，直至修饰成功；
制备金纳米颗粒溶胶，将所述金纳米颗粒溶胶滴加到所述玻碳电极表面，并利用所述电化学工作站，对所述玻碳电极进行交流阻抗扫描，直至修饰成功；
在所述玻碳电极上修饰碳纳米管，并利用所述电化学工作站，对所述玻碳电极进行交流阻抗扫描，直至修饰成功，得到所述修饰过的玻碳电极。
2.根据权利要求1所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，其特征在于，在所述通过将所述平均值代入预先计算的脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式，得到所述待测部位内的脯氨酸浓度之前，还包括：
S30、将所述电极的检测端放入校正液中，并利用所述电化学工作站，采用循环伏安法采集所述校正液中脯氨酸电化学反应产生的氧化峰电流，在所述电流变化平稳后，计算所述预设时长的电流的平均值，其中，所述校正液为溶解有脯氨酸的磷酸缓冲液，所述校正液的pH值的范围为4.0～7.0，所述校正液中脯氨酸的浓度为第一浓度；
S31、按照步骤S30再计算至少一组校正液所对应的电流的平均值，其中，步骤S31中所使用的校正液与步骤S30中所使用的校正液的pH值相同，步骤S31中所使用的校正液中脯氨酸的浓度为第二浓度，所述第一浓度与所述第二浓度不同；
S32、利用计算得到的至少两组电流的平均值及其对应的校正液中脯氨酸的浓度进行线性拟合，得到脯氨酸浓度与电流的平均值的线性关系式。
3.根据权利要求2所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，其特征在于，所述步骤S30和步骤S31中所使用的溶解有脯氨酸的磷酸缓冲液中脯氨酸的浓度不小于2×10- 8mol L-1。
4.根据权利要求1所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，其特征在于，若所述待测部位为叶片，则所述电极为贴片式电极，所述将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，包括：
将所述微电极阵列上电极的检测端放在所述叶片表面，并压入所述叶片。
5.根据权利要求1所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，其特征在于，若所述待测部位为除叶片外的其它部位，则所述电极为针式电极，所述将所述微电极阵列上电极的检测端放入待测植物的待测部位，包括：
将所述微电极阵列上电极的检测端插入所述待测部位。
6.根据权利要求1所述的基于生物传感技术的脯氨酸浓度检测方法，其特征在于，所述预设时长为5～10分钟。
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