CN109521070A - 一种植物抗病相关激素的多位点检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物抗病相关植物激素的多位点检测方法，本发明采用碳基材料修饰的平板工作电极检测植物抗病相关植物激素的分布情况，具有步骤包括电极的制备、植物样品的微取样和植物激素的电化学检测。用本发明的该方法消除了复杂的和耗时的样品处理过程，可以实时、微量实现植物组织如番茄叶片中生长素和水杨酸的检测，有助于研究二者在植物抗病中的互作关系。

Description

一种植物抗病相关激素的多位点检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测方法，具体涉及一种植物抗病相关激素的多位点检测方法。

技术背景

植物在生长发育的过程中，常受到多种病原微生物如病毒、细菌、真菌的侵袭，这些胁迫通常会造成植物细胞的损伤，进而严重影响植物的生长发育和作物产量。在长期的进化过程中，植物在抗病方面形成了自己特有的规律，其依赖自身每一个细胞所具有的天然免疫系统以及从病原菌侵染位点发出的系统性信号，产生相关信号分子，在植物体内有效传递，使整株植物产生系统获得性抗性或诱导性系统抗性，进而使整个植株对入侵病害产生高效持久的抵抗能力。作为信号分子的植物抗病相关激素，在抗病反应的过程中活化植物防卫反应基因的协同表达，从而激活植物的整体抗病防卫反应。

在植物免疫反应中具有重要作用的植物内源激素有水杨酸（SA）、吲哚乙酸等，其在植物中含量极微，但对植物的抗病行为具有极为重要的调节功能。水杨酸是植物体内普遍存在的具有酚类结构的一种小分子化合物，植物先天免疫和系统获得性免疫的形成都需要水杨酸的参与。此外，水杨酸还可以激活植物细胞发生程序化死亡，以阻止病原物扩散到邻近的健康细胞，诱导一系列防卫反应的发生，进而引发整株植物对病原物的抗性。生长素常被认为扮演毒力因子的角色，许多植物病原体通过操纵植物生长素（IAA）合成来介入植物的正常发育过程，感染病原菌后植物体内增加的 生长素水平可能给植物的细胞信号途径和生理带来一系列的变化如引起细胞壁的松弛、细胞膜渗透性的增加、气孔的开放，从而导致病原菌进出植物细胞畅通无阻，加速病原菌的传播。

需要强调的是，当植物感应病害侵袭后，会将用于生长和发育的能量与资源运输到免疫系统，为了节省能量和资源以维持植物正常的发育，植物激素信号路径间可以偶联成复杂的网络，灵活搭配不同激素的组合、精密控制激素水平以及信号的传导，为植物提供了强有力的调控潜能，并促使植物针对入侵者定制最适合的防御反应。植物抗病相关激素水杨酸和生长素，在植物防御反应的过程中存在交叉，目前的研究发现 水杨酸 能通过抑制 生长素 信号途径，如 TIR1 受体基因的全面抑制，增加Aux/IAA 抑制蛋白的稳定性，减少了对生长素的应答，进而影响植物或病原体生长，生长素信号的抑制效应是水杨酸参与抗病反应的一个重要组成部分。

尽管目前研究表明水杨酸和生长素间的相互作用、抗病信号的启动时机和顺序可能由它们在植物体内的相对浓度决定，但目前仍然缺乏直接的实验证据。而这些证据很大程度上源于确定水杨酸和生长素在植物体内的浓度分布及其动态变化。这些问题的真正解答在很大程度上取决于上述植物激素在植物体抗病不同部位的浓度分布及其动态变化。因此，其原位、实时、同步检测已成为抗病调控网络机制研究中的关键。

植物激素目前的检测较多采用气质联用或液质联用等技术进行。这些方法的主要局限于检测前需要复杂耗时的样品前处理，其原因是植物组织与细胞需要进行冷冻破碎以及样品抽提和纯化。由于上述植物激素为易于发生氧化还原反应的小分子，复杂的样品处理过程会导致这些小分子的损失，使得其浓度降低，检测限难以进一步提高。更为重要是，复杂的样品处理过程一般使用较多量的植物样品、且需要较长的时间，难以真实再现植物激素原位实时的浓度，使得我们难以获得准确及时的信息，致使水杨酸与生长素在植物体内的形成及传导过程，以及其在植物抗病机制中的作用研究难以深入进行。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种植物抗病相关植物激素的多位点检测方法，主要包括电极制备、标准曲线的制备、植物样品取样及样品中相关植物激素含量测定，其创新点在于：本发明的电极采用碳基材料制成，本发明的植物样品取样方法为微取样，本发明的相关植物激素含量测定方法采用电化学检测，具体内容如下：

（1）电极制备：平板型工作电极在导电支持材料上采用碳基材料制作和修饰，并在使用前进行氧化处理；

（2）植物样品微取样：植物样品取自植物多个不同位点，样品量控制在0.1~50mg；

（3）植物激素的电化学检测：将植物样品置于步骤（1）中的工作电极表面，结合纸基分析装置进行电化学检测；

进一步的，本发明的植物相关激素为植物生长素和水杨酸。

进一步的，本发明的步骤（1）中导电支持材料包括导电玻璃或者金属片。

进一步的，本发明的步骤（1）中碳基材料的修饰方法包括浸泡、滴涂或其它表面改性方法的一种。

进一步的，本发明的步骤（2）中植物样品取样的形状为圆形或者长方形或者正方形或者其他不规则图形。

进一步的，本发明的圆形有效检测面积的直径为0~10 mm。

进一步的，本发明的步骤（3）中的电化学工作站为多通道电化学工作站或者单通道电化学工作站。

进一步的，本发明的步骤（2）中的植物样品为番茄叶片，本发明的微量取样处理方法包括以下步骤：

（1）将已经培养好的番茄植株上长势良好的叶片，剪取并置于铺有用蒸馏水浸湿的育苗纸的托盘内，将湿润的棉花放置于叶片的剪切处；

（2）制备灰霉菌浸染液，将其接种在步骤（1）中培养好的番茄叶片上为实验组，以直接接种相同质量的Buffer缓冲液接种到叶片上为对照组，实验组和对照组各为的叶片为40~60片，放入托盘中盖上保鲜膜保湿培养48~96h；

（3）将培养好的叶片用3~5mm的打孔器打孔，每个叶片在相同的位置打9~15个孔取样。

本发明的优点在于：

1.本发明采用电化学方法检测生长素和水杨酸，电化学检测具有灵敏度高、响应快、体积小等适合于原位检测的优势。更值得一提的是，其具有表面效应、量子尺寸效应的碳基材料的广泛应用，使得电化学检测性能进一步提高。

2.由于生长素和水杨酸具有氧化还原活性，可以用电化学分析方法直接检测，本发明拟通过碳基材料对平板型工作电极的修饰，结合植物微取样技术，可以与植物如番茄叶片多个位点集成，构建生长素和水杨酸多位点实时电化学分析系统，实现番茄叶片多个位点中生长素和水杨酸快速电化学检测。在此基础上，监测在灰霉菌侵染番茄叶片不同发病位点中生长素和水杨酸 实时变化，研究病害胁迫下二者浓度的差异和变化规律。

3.本发明的方法，最主要的优势是直接将植物组织不同位置的取样样品放置在碳基材料修饰的平板工作电极上，无需进行植物样品的处理，消除了复杂、耗时的样品处理过程，以实时、微量分析的方法研究生长素和水杨酸在植物抗病过程中的互作关系。

附图说明

图1为本发明检测方法的流程图；

图2为本发明实验组和对照组番茄叶片取样位点图；

图3为本发明实验组和对照组番茄叶片样本的质量的柱状图；

图4A为本发明实验组和对照组水杨酸在番茄叶片上分布情况示意图；

图4B为本发明实验组各个样本水杨酸浓度的柱状图；

图5A为本发明实验组和对照组生长素在番茄叶片上分布情况示意图；

图5B为本发明实验组各个样本生长素浓度的柱状图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下以番茄叶片为例，用本发明的检测方法检测番茄叶片抗病相关激素生长素和水杨酸的分布情况，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于以下示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。

一种植物抗病相关激素生长素和水杨酸多位点检测方法具体工作流程见图1，具体操作步骤如下：

（1）步骤一，碳基材料修饰的平板工作电极制备：将平板工作电极黏贴在导电支持材料上，然后用碳基材料修饰，通过绝缘胶带调节其有效检测面积，然后在有效检测面上施加与有效检测面面积形状完全相同的滤纸，完成碳基材料修饰的平板型工作电极的制备，备用。

步骤二，生长素和水杨酸标准曲线的制备：将生长素和水杨酸溶解到甲醇溶液形成母液，用中性缓冲溶液将生长素和水杨酸稀释成不同浓度的工作液，用移液枪滴加不同浓度的生长素和水杨酸工作液到碳基材料修饰的平板电极有效检测区域，盖上圆形滤纸片，利用多通道或单通道电化学工作站进行标准品的检测。

步骤三，番茄叶片样品的处理：用取下已经培养好的番茄植株上长势良好的叶片，置于铺有用蒸馏水浸湿的育苗纸的托盘内，将湿润的棉花放置于叶片的剪切处，将灰霉菌浸染液接种在番茄叶片上为实验组，以直接接种相同质量的Buffer缓冲液接种到叶片上为对照组，实验组和对照组各为的叶片为50片，放入托盘中盖上保鲜膜保湿培养72h，将培养好的叶片用打孔器打孔，每个叶片在相同的位置打11个孔取样如图2所示。称取每个番茄样本的质量，如图3所示灰霉菌侵染中心番茄叶片样品的重量明显低于其它部位，在直径相同的情况下，侵染区的最低叶重可达0.1mg，这些结果表明，灰霉菌感染后，番茄叶片的固有的水分和营养物质都丢失了。

步骤四，番茄叶片上激素含量的检测：将番茄叶片取样形状和面积与碳基材料修饰的平板工作电极有效检测面积相同的样品放置在碳基材料修饰导电胶电极有效检测面上，用移液枪滴加0~50μL的缓冲液，盖上圆形滤纸片，与多通道电化学工作站相连，对番茄叶片中生长素和水杨酸进行多位点检测，检测结果见图4、5。

图4A展示了8通道电化学站检测接种灰霉菌和未接种灰霉菌的番茄叶样本在多个位点([0，3]，[0，2]，[0，1]，[0，0]，[0，-1]，[0，-2]，[0，-2]，[0，-2]，[0，-2]，[0，-3]）电流值，根据电流标准曲线可以判断生长素和水杨酸的DPV峰值电位分别为0.50V和0.78 V，检测结果发现，在[0，3]、[0，2]和[0，-2]位置水杨酸的峰值高明显高于生长素，而[0，0]位置的生长素的峰值高于其他位置，结果表明，本方法可用于判断番茄叶片中生长素的水杨酸的分布情况。

如图4B表示的是实验组和对照组水杨酸含量的示意图，由图可知实验组的水杨酸含量显著降低，平均值为3.27μg/g，周围水杨酸含量显著升高，平均值为30.10μg/g。对于对照组的番茄叶片而言，不同部位番茄叶片的水杨酸的平均含量为11.59μg/g，差异不显著。如图5所示，与对照组相比实验组感染中心的水杨酸的含量下降了五分之一，而周围区域的水杨酸含量比中心区增加了2~3倍。结果表明，在灰霉菌侵染后，除侵染中心外周围区域的水杨酸的总含量均显著增加，说明水杨酸在抑制灰霉侵染番茄叶片过程中发挥重要的作用。

对于相同样本位置的生长素的含量则完全不同，如图5A所示，在实验组的中心位置生长素的含量显著增加，而周围区域生长素含量显著下降，如图5B所示，结果表明，相对于对照组，实验组感染中心生长素水平升高约7倍，而感染区周围区域的的植物激素水平下降至1/10左右，结果表明灰霉菌感染中心通过分泌更多的生长素来促进其对番茄叶片的侵染。

由上述实验结果可知，灰霉菌侵染的番茄叶片上生长素和水杨酸之间的关系，可以得出水杨酸的生长素在植物受到外界胁迫时是拮抗作用的。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种植物抗病相关植物激素的多位点检测方法，主要包括电极制备、标准曲线的制备、植物样品取样及样品中相关植物激素含量测定，其特征在于：所述电极采用碳基材料制成，所述植物样品取样方法为微取样，所述相关植物激素含量测定方法采用电化学检测，具体内容如下：

（1）电极制备：平板型工作电极在导电支持材料上采用碳基材料制作和修饰，并在使用前进行氧化处理；

（2）植物样品微取样：植物样品取自植物多个不同位点，样品量控制在0.1~50mg；

（3）植物激素的电化学检测：将植物样品置于步骤（1）中的工作电极表面，结合纸基分析装置进行电化学检测。

2.根据权利要求1所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，其特征在于：所述植物相关激素为植物生长素和水杨酸。

3.根据权利要求1所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中导电支持材料包括导电玻璃或者金属片。

4.根据权利要求1所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中碳基材料的修饰方法包括浸泡、滴涂或其它表面改性方法的一种。

5.根据权利要求1所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中植物样品取样的形状为圆形或者长方形或者正方形或者其他不规则图形。

6.根据权利要求5所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，其特征在于：所述圆形有效检测面积的直径为0~10 mm。

7.根据权利要求1所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，所述步骤（3）中的电化学工作站为多通道电化学工作站或者单通道电化学工作站。

8.根据权利要求1所述的一种植物抗病相关激素的多位点检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中的植物样品为番茄叶片，所述微量取样处理方法包括以下步骤：

（1）将已经培养好的番茄植株上长势良好的叶片，剪取并置于铺有用蒸馏水浸湿的育苗纸的托盘内，将湿润的棉花放置于叶片的剪切处；

（2）制备灰霉菌浸染液，将其接种在步骤（1）中培养好的番茄叶片上为实验组，以直接接种相同质量的Buffer缓冲液接种到叶片上为对照组，实验组和对照组各为的叶片为40~60片，放入托盘中盖上保鲜膜保湿培养48~96h；

（3）将培养好的叶片用3~5mm的打孔器打孔，每个叶片在相同的位置打9~15个孔取样。