CN114878659A - 拟南芥抗病相关激素iaa和sa高灵敏多通量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出的是一种拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，采用液体碳导电胶修饰的不锈钢电极检测Pst DC3000侵染的拟南芥叶片上IAA和SA的分布情况，具体步骤包括液体碳导电胶修饰的不锈钢电极的制备、拟南芥叶片的微取样以及采用电化学工作站对拟南芥叶片中IAA和SA进行多通道检测。本发明消除了复杂的和耗时的样品处理过程，可以实时、微量、高灵敏地实现叶片中IAA和SA的检测，有助于研究二者在植物抗病中的互作关系。

Description

拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法
技术领域
本发明涉及一种生物检测方法，具体涉及一种拟南芥叶片抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量的检测方法。
背景技术
植物在其生命周期内不断地遭遇各种生物胁迫（真菌、细菌、病毒等的病原体感染），显著影响植物生长和作物产量。经过数百万年的进化，植物已经形成了复杂的信号网络调控的复杂防御机制，以往的研究表明植物激素是这种活动的中心调节因子，正是复杂的植物激素信号通路网络使植物能够激活对各种病原体的适当和有效的防御反应。
水杨酸（SA）是一种简单的酚类分子，由于其在植物防御中的核心作用而被广泛研究。SA是激活微生物相关分子模式触发免疫（MTI）、效应器触发免疫（ETI）和系统获得性抗性（SAR）等防御反应所必需的。除水杨酸外，生长素作为一种重要的植物激素，调节着植物生长发育的方方面面，也与植物对生物胁迫的反应有关。吲哚-3-乙酸（IAA）是植物体内主要的天然生长素，可由色氨酸（Trp）作为前体合成，这是一条不依赖于Trp的途径。一些细菌和真菌病原体也可以通过多种途径产生IAA。在这方面，植物病原菌调节生长素信号和生物合成，从而影响植物免疫。
以往的研究表明，在植物与病原菌的相互作用过程中，IAA和SA之间存在拮抗作用：过量积累SA突变体的植株表现出类似于生长素缺乏突变体的形态表型，而过度表达NahG转基因植株的SA缺乏植株表现出较高的IAA水平；此外，SA还可以通过抑制生长素信号转导途径来抑制病原菌在植株中的生长。尽管上述研究表明SA和IAA在植物-病原菌相互作用过程中存在拮抗作用，但仍没有足够的直接令人信服的实验证据，这是由于难以获得它们的含量和植物体内的动态变化所致。因此，了解植物体内SA和IAA的实时含量已成为研究这类相互作用的关键。
SA和IAA是小的、简单的和不稳定的分子，因此如何定量实时检测它们在植物中的准确含量是一个具有挑战性的问题。近二十年来，基于高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱（GC-MS）的几种方法已被广泛应用于植物-病原菌相互作用中SA和IAA含量的测定。然而，上述方法需要更大的样本量（至少100 mg植物样品）和复杂的样品处理步骤（如植物样品粉碎、超声提取、色谱柱分离和流动氮气干燥过程），由于IAA和SA本身化学性质的不稳定，这些耗时的步骤使其在取样和处理后不可能保持原来的水平，从而影响最终的数据分析和理论探究。因此，急需一种能够快速多点精确定量测量植物体内激素水平的方法，以更好地研究它们在病原侵染过程中的相互关系。
发明内容
本发明的目的在于解决现有植物激素检测设备和方法存在的上述问题，基于电化学检测方法和纸基分析设备，针对拟南芥叶片抗病相关激素IAA和SA进行高灵敏、多通量检测。
本发明的技术解决方案：拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，该方法包括不锈钢电极的制备、拟南芥叶片样品的处理、IAA与SA激素含量的标准曲线制作和拟南芥叶片样品中IAA与SA激素含量的电化学检测；其特征在于：所述不锈钢电极采用液体碳导电胶进行改良修饰，集成在拟南芥叶片多个组织部位；该方法具体包括如下步骤：
（1）不锈钢电极的制备：用液体碳胶修饰不锈钢电极，将其晾干后再用透明胶带固定其检测面积，得到液体碳导电胶修饰的不锈钢电极；具体步骤如下：
①将剪好的长1-3cm、宽0.6-1cm的不锈钢片放入烧杯中，依次往烧杯中倒入丙酮、乙醇和蒸馏水，进行8-12min超声浸泡处理，其中加入丙酮这一步烧杯口用保鲜膜封口；
②将处理好的不锈钢片放入烘箱中，在40-60℃条件下烘干20-40min；
③将烘干的不锈钢片取出，直接滴加质量比为1:5的液体碳导电胶并晾干；
④将晾干的液体碳导电胶修饰的不锈钢电极贴上透明胶带，备用。
（2）拟南芥叶片样品的处理：培养拟南芥植株，喷洒细菌浸染液模拟感染过程，并设置对照组，培养好后取样，将拟南芥叶片样品放置液体碳导电胶修饰的不锈钢电极上待检测；具体步骤如下：
①以野生型拟南芥种子为材料，用75%乙醇浸泡20min，然后用无菌水反复冲洗20min，共4次；洗涤后的种子在4℃下保存2d，然后放在1%蔗糖、1%琼脂和0.5g/L MES，pH5.8的1/2 MS基本培养基上萌发，得到拟南芥幼苗；再将拟南芥幼苗在22℃的条件下培养，采用-5000Lux冷白荧光灯光照16h，暗光照8h，在植物组织培养室内培养4周，得到培养好的拟南芥植株；
②制备Pst DC3000菌浸染液，将其喷洒在步骤①中培养好的拟南芥叶片上为实验组，同时直接将相同质量的MgCl2溶液接种到拟南芥叶片上作为对照组，实验组和对照组各准备10株，放入透明收纳箱中保湿培养；
③分别将实验组和对照组中接种过的拟南芥叶片用3-5mm的打孔器打孔，每个叶片在相同的位置打孔取样，将拟南芥叶片样品放置液体碳导电胶修饰的不锈钢电极上，用移液枪滴加4-16μL的缓冲液，盖上圆形滤纸片，待检测。缓冲液是0.2M，PH为7.5的PBS缓冲溶液，其配制方法为：依次配制0.2mol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液，将K2HPO4溶液KH2PO4溶液进行混合，调节PH至7.5；拟南芥叶片覆盖在液体碳导电胶修饰的不锈钢电极未贴透明胶带处。
（3）IAA与SA激素含量标准曲线的制作：分别制备梯度浓度为0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、30μM、50μM、100μM的IAA与SA激素标准溶液，采用DPV差分脉冲伏安法测量标准溶液，得到IAA与SA激素DPV图，并分别根据DPV图中的数据计算得到IAA与SA激素含量标准曲线图。
（4）拟南芥叶片样品中IAA与SA激素含量的电化学检测：将放置有拟南芥叶片的液体碳导电胶修饰的不锈钢电极与多通道电化学工作站相连，对拟南芥叶片中IAA和SA进行高灵敏多通量检测；其中采用的电化学工作站是8通道的电化学工作站。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）本发明采用电化学方法检测IAA和SA，具有灵敏度高、响应快、体积小等适合于原位检测的优势；作为电极的不锈钢片具有双面导电性，液体碳导电胶不锈钢电极相对于现有方法中多壁碳修饰的ITO玻璃具有更高的重现性与稳定性，同时操作起来更方便简单；
2）由于IAA和SA具有氧化还原活性，可以用电化学分析方法直接检测，通过液体碳导电胶对不锈钢电极的修饰，与拟南芥植株叶片集合，构建IAA和SA高灵敏多通量实时电化学分析系统，实现拟南芥叶片多个部位中IAA和SA原位同时电化学检测；在此基础上，监测在Pst DC3000侵染拟南芥叶片不同发病位点中IAA和SA 实时变化，研究病害胁迫下二者浓度的差异和变化规律；
3）将浸染液直接喷洒植株后，取样时无需进行植物样品的处理，将不同取样叶片直接放置在液体碳导电胶修饰的不锈钢电极上，即可对拟南芥叶片接种Pst DC3000菌后多个发病位点中的IAA和SA进行检测，避免了复杂和耗时的样品处理过程，从而确保以定量分析的方法研究IAA和SA在植物抗病过程中 互作关系的实施。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程图；
图2为本发明实验组和对照组拟南芥叶片图；
图3A、3B为本发明IAA的DPV图和标准曲线图；
图3C、3D为本发明SA的DPV图和标准曲线图；
图4A为本发明植物激素检测干扰图；
图4B为本发明IAA与SA混合标准曲线图；
图5A为本发明对照组组IAA各个时间点含量DPV图；
图5B为本发明实验组和对照组IAA在拟南芥叶片上检测柱状图；
图5C为本发明实验组SA各个时间点含量DPV图；
图5D为本发明实验组和对照组SA在拟南芥叶片上检测柱状图。
具体实施方式
下面根据实施例进一步说明本发明的技术方案。在本说明书的描述中，各实施例的内容意指结合其描述的具体技术特征包含于本发明的至少一个实施方式中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体技术特征可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
如图1所示，为本发明拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法流程，其具体操作步骤如下：
步骤一，液体碳导电胶修饰的导电胶电极的制备：将切好的长3cm、宽0.8cm 不锈钢片放入烧杯中，依次往烧杯中倒入丙酮、乙醇和蒸馏水进行10min超声浸泡处理，其中加入丙酮这一步烧杯口需用保鲜膜封口，将处理好的不锈钢片放入烘箱中，50℃，烘干30min。取出烘干后的不锈钢电极，滴加1:5比例的液体碳导电胶在不锈钢片上，然后贴上4-6mm的透明胶带，备用。
步骤二，拟南芥叶片样品的处理：将长势4周龄的拟南芥，分别喷洒MgCl2和PstDC3000溶液，Pst DC3000浸染液接种在拟南芥叶片上为实验组，以直接接种相同质量的MgCl2溶液到叶片上为对照组，实验组和对照组各为10株，放入透明收纳箱中保湿培养，将培养好的叶片用4mm的打孔器打孔，每个叶片在相同的位置打孔取样。
经过检测，Pst DC3000侵染拟南芥叶片样品的重量明显低于对照组，在直径相同的情况下，侵染区的最低叶重可达0.1mg，这些结果表明，Pst DC3000感染后，拟南芥叶片的固有的水分和营养物质都丢失了。
步骤三，IAA与SA激素含量的标准曲线制作：在检测植物样品前，我们需要分别做IAA与SA的标准曲线，图3A是0.01uM-100uM的IAA DPV图，在0.01uM时，有明显的峰值，检测限达到0.01uM，相比于以往的ITO玻璃灵敏度更高、重现性更好；图3B是0.01uM-100uM的IAA标准曲线图，与图3A相吻合；图3C是0.01uM-100uM的SA DPV图，检测限达到0.01uM，相比于以往的ITO玻璃灵敏度更高、重现性更好；图3D是0.01uM-100uM的SA 标准曲线图，与图3C结果一致。
图4A是本发明植物激素检测干扰图，从图4A可以看出，当脱落酸、茉莉酸甲酯、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸存在的情况下，IAA与SA依然有明显的峰值，说明其他激素并没有对IAA于SA造成干扰；图4B为IAA与SA混合液的标准曲线，浓度从0.01uM-100uM，从图中可以看出，在浓度为001uM时，依然有良好的峰值，说明液体碳胶修饰的不锈钢片有更高的灵敏度。
步骤四，拟南芥叶片样品中IAA与SA激素含量的电化学检测：将步骤二中处理好的拟南芥叶片放置在未贴透明胶带的液体碳导电胶修饰的不锈钢电极上，用移液枪滴加10μL的pH=7.5的PBS缓冲液，盖上圆形滤纸片，然后与8通道电化学工作站相连，对拟南芥叶片中IAA和SA进行高灵敏多通量检测，检测结果如图5A~图5D所示。
根据电流标准曲线可以判断IAA和SA的DPV峰值电位分别为0.50V和0.78 V，检测结果发现，随着浓度的升高，IAA与SA的电流响应值也越高。图5A是对照组的不同时间点的IAA含量，从图中可以看出，在72h IAA最高，96h次之，而在0h、24h、48h IAA含量差异性不大，这与图5B结果一致；图5B还可以看出，在96h时，实验组无IAA的存在。图5C是实验组SA含量DPV图，可以看出，随着时间的推移，SA的含量越来越高，在96h时，达到最高，在0h时最低；图5D可以看出对照组几乎不存在SA，仅在72h和96h仅存在一些，而实验组SA含量呈递增趋势，结果表明IAA与SA存在拮抗作用。在Pst DC3000侵染后，从图2可以看出植株不仅会发黄，SA含量也会增高，说明SA在抑制Pst DC3000侵染拟南芥叶片过程中发挥重要的作用。Pst DC3000感染中心可能通过分泌更多的IAA来促进其对拟南芥叶片的侵染。
由上述实验结果可知，Pst DC3000侵染的拟南芥叶片上IAA和SA之间的关系，可以得出SA的IAA在植物受到外界胁迫时是拮抗作用的。本方法可用于判断拟南芥叶片中IAA的SA的分布情况。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，该方法包括不锈钢电极的制备、拟南芥叶片样品的处理、IAA与SA激素含量的标准曲线制作和拟南芥叶片样品中IAA与SA激素含量的电化学检测；其特征在于：所述不锈钢电极采用液体碳导电胶进行改良修饰，集成在拟南芥叶片多个组织部位；该方法具体包括如下步骤：
（1）不锈钢电极的制备：用液体碳胶修饰不锈钢电极，将其晾干后再用透明胶带固定其检测面积，得到液体碳导电胶修饰的不锈钢电极；
（2）拟南芥叶片样品的处理：培养拟南芥植株，喷洒细菌浸染液模拟感染过程，并设置对照组，培养好后取样，将拟南芥叶片样品放置液体碳导电胶修饰的不锈钢电极上待检测；
（3）IAA与SA激素含量标准曲线的制作；
（4）拟南芥叶片样品中IAA与SA激素含量的电化学检测：将放置有拟南芥叶片的液体碳导电胶修饰的不锈钢电极与多通道电化学工作站相连，对拟南芥叶片中IAA和SA进高灵敏多通量检测。
2.根据权利要求1所述的拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中用液体碳胶修饰不锈钢电极的过程具体包括如下步骤：
①将剪好的长1-3cm、宽0.6-1cm的不锈钢片放入烧杯中，依次往烧杯中倒入丙酮、乙醇和蒸馏水，进行8-12min超声浸泡处理，其中加入丙酮这一步烧杯口用保鲜膜封口；
②将处理好的不锈钢片放入烘箱中，在40-60℃条件下烘干20-40min；
③将烘干的不锈钢片取出，直接滴加质量比为1:5的液体碳导电胶并晾干；
④将晾干的液体碳导电胶修饰的不锈钢电极贴上透明胶带，备用。
3.根据权利要求1所述的拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中拟南芥叶片样品的处理具体包括如下步骤：
①以野生型拟南芥种子为材料，用75%乙醇浸泡20min，然后用无菌水反复冲洗20min，共4次；洗涤后的种子在4℃下保存2d，然后放在1%蔗糖、1%琼脂和0.5g/L MES，pH5.8的1/2MS基本培养基上萌发，得到拟南芥幼苗；再将拟南芥幼苗在22℃的条件下培养，采用-5000Lux冷白荧光灯光照16h，暗光照8h，在植物组织培养室内培养4周，得到培养好的拟南芥植株；
②制备Pst DC3000菌浸染液，将其喷洒在步骤①中培养好的拟南芥叶片上为实验组，同时直接将相同质量的MgCl2溶液接种到拟南芥叶片上作为对照组，实验组和对照组各准备10株，放入透明收纳箱中保湿培养；
③分别将实验组和对照组中接种过的拟南芥叶片用3-5mm的打孔器打孔，每个叶片在相同的位置打孔取样，将拟南芥叶片样品放置液体碳导电胶修饰的不锈钢电极上，用移液枪滴加4-16μL的缓冲液，盖上圆形滤纸片，待检测。
4.根据权利要求1所述的拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中的缓冲液是0.2M，PH为7.5的PBS缓冲溶液，其配制方法为：依次配制0.2mol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液，将K2HPO4溶液KH2PO4溶液进行混合，调节PH至7.5。
5.根据权利要求1所述的拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中拟南芥叶片覆盖在液体碳导电胶修饰的不锈钢电极未贴透明胶带处。
6.根据权利要求1所述的拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，其特征在于：所述步骤（3）IAA与SA激素含量标准曲线的制作具体包括如下步骤：分别制备梯度浓度为0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、30μM、50μM、100μM的IAA与SA激素标准溶液，采用DPV差分脉冲伏安法测量标准溶液，得到IAA与SA激素DPV图，并分别根据DPV图中的数据计算得到IAA与SA激素含量标准曲线图。
7.根据权利要求1所述的拟南芥抗病相关激素IAA和SA高灵敏多通量检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中的电化学工作站是8通道的电化学工作站。
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