CN110749668B - 用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的标志物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的标志物及方法，所述标志物由吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯组成。本发明中的标志性可应用于适制乌龙茶的高香茶树资源的评分与快速筛选。本发明中筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的方法，操作简单、耗时短、需样量少、可靠性强，可应用于大批量的资源样品筛选。

Description

用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的标志物及方法
技术领域
本发明涉及用于筛选高香型茶树资源的标志物及方法，特别涉及用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的标志物及方法。
背景技术
乌龙茶也成青茶，属于半发酵茶。茶叶香气是反映茶叶品质的重要因子，茶树的品种是决定茶香品质的重要因素之一。高香型乌龙茶是指挥发性好，香气显锐，具有明显的花果香和花蜜香的乌龙茶，高香资源的筛选对茶产业的发展至关重要，也是由来已久的。传统的适制乌龙茶的高香型茶树资源筛选需要将茶叶加工成乌龙茶，再通过感官审评来筛选确定。存在操作繁琐、耗时长、需样量大、人为主观干预等问题，不利于大规模的茶树资源筛选。
随着分子生物学的发展，各种分子标记技术和辅助手段越来越多的应用在筛选特异的茶树种质资源上。比如CN109060995A中公开了一种杏仁香茶树种质资源的筛选方法，通过对茶叶代谢物中扁桃腈的含量进行快速的分析，从而可以快速的实现杏仁香茶树种质资源的筛选工作，将原来通过4年时间选育的工作大大的缩短，可以精确的确定杏仁香茶树质资源，更加满足市场的需求，便于实施，操作方便，实用性强，便于推广使用。
通过分子生物学手段筛选茶树种质资源的一大难点在于标志性物质的选择，茶叶香气成分已知的有四百多种化合物，包括碳氢化合物、醇、醛、酮、酸、酯和内酯、杂环化合物等。迄今为止，在乌龙茶类中检出的香气成分已达160余种，这些香气物质中以醇类、酮类、酯类、醛类和碳水化合物为主。现有技术中暂未发现将乌龙茶中特定香气成分作为适制乌龙茶的高香型茶树资源筛选标志物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的标志物及方法。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出一组用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的标志物，所述标志物由吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯组成。
进一步地，用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的评分公式为：分数＝1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量。
在本发明的另一个方面，提出标志物在筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源中的应用，所述标志物由吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯组成。
进一步地，用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的评分公式为：分数＝1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量。
在本发明的另一个方面，提出一种筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的方法，包括如下步骤：
1)从待筛选茶树采摘茶叶，将新鲜茶叶于23～27℃堆放2～4h，然后放入液氮中速冻；
2)萃取速冻后的新鲜茶叶中的香气物质；
3)定量香气物质中的吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯；
4)根据评分公式计算分数筛选得到适制乌龙茶的高香型茶树资源，评分公式为：分数
＝1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量。
进一步地，分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
进一步地，步骤2)中使用二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯萃取香气物质。
进一步地，步骤3)中通过GC-MS定量香气物质中的吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯。
进一步地，GC-MS分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10，进样口温度为230℃，不分流模式，载气流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40～200。
进一步地，以癸酸乙酯为内标。
本发明的有益效果是：
本发明技术发掘了标志性物质，并拟合了评分公式，可应用于适制乌龙茶的高香茶树资源的评分与快速筛选。本发明中还提供了一种筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的方法，该方法操作简单、耗时短、需样量少、可靠性强，可应用于大批量的资源样品筛选。
具体实施方式
本发明将30份茶树资源加工成成品乌龙茶，随后进行感官审评获得不同香气等级分数，挑选出高香资源和低香资源各6份。感官审评的标准分为三个等级：1-低(挥发性差，香气低沉，花果香和花蜜香不明显)；3-中(挥发性一般，有一定的香气，具有一定的花果香和花蜜香)；5-高(挥发性好，香气显锐，具有明显的花果香和花蜜香)。由7名专业的审评专家进行打分，根据打分结果计算出每个样品的分数。再对这些资源的香气物质的含量，及其相关合成基因的表达量进行测定，并分析了这些因子与感官审评分数的相关性，筛选出了特定的标志性物质。这些标志性物质的含量可应用于拟合评分公式，可应用于适制乌龙茶的高香茶树资源的评分与快速筛选。
本发明中对茶树资源的植物激素和香气物质的含量测定方法如下：
1.样品前处理
将采摘后的新鲜茶叶(10～15g)堆放于23～27℃条件下2～4h，处理后立即放入液氮中速冻，并保存于-80℃条件下。
2.香气物质提取与测定
将样品在液氮中研磨成粉末后，称取500mg茶叶粉末，置于萃取瓶中，加入2mL二氯甲烷(乙醚或乙酸乙酯)和5nmol癸酸乙酯(作为内标)，在室温条件下过夜振荡提取。次日，用无水硫酸钠干燥，然后用氮吹仪(MIULAB NDK200-1；米欧仪器公司，杭州，中国)浓缩至约200μL。浓缩液用GC-MS(QP2010 SE；Shimadzu Corporation，东京，日本)分析，定量浓缩液中的香气物质。
分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10(30m×0.25mm×0.25μm；SupelcoInc.，宾夕法尼亚，美国)，进样体积为1μL，进样口温度为230℃，不分流模式，载气(氦气)的流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40～200。
本发明中筛选出的三组标志物分别为：
1)吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯，评分公式为：分数＝1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量，R2＝0.847，p＝0.057；
2)香叶醇、苯甲醇、苯乙醇，评分公式为：分数＝1.959+0.074香叶醇含量+0.014苯甲醇含量-0.013苯乙醇含量，R2＝0.334，p＝0.019；
3)芳樟醇氧化物、香叶醇、苯甲醇，评分公式为：分数＝1.146+0.128芳樟醇氧化物含量-0.56香叶醇含量+0.24苯甲醇含量，R2＝0.544，p＝0.136。
分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
实施例1～3中分别使用不用的标志物及对应的评分公式进行适制乌龙茶的高香型茶树资源筛选。
实施例1
适制乌龙茶的高香型茶树资源筛选方法
1.样品前处理
将采摘后的新鲜茶叶(10～15g)堆放于25℃条件下3h，处理后立即放入液氮中速冻，并保存于-80℃条件下。
2.香气物质提取与测定
将样品在液氮中研磨成粉末后，称取500mg茶叶粉末，置于萃取瓶中，加入2mL二氯甲烷(乙醚或乙酸乙酯)和5nmol癸酸乙酯(作为内标)，在室温条件下过夜振荡提取。次日，用无水硫酸钠干燥，然后用氮吹仪(MIULAB NDK200-1；米欧仪器公司，杭州，中国)浓缩至约200μL。浓缩液用GC-MS(QP2010 SE；Shimadzu Corporation，东京，日本)分析，定量浓缩液中的吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯。
分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10(30m×0.25mm×0.25μm；SupelcoInc.，宾夕法尼亚，美国)，进样体积为1μL，进样口温度为230℃，不分流模式，载气(氦气)的流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40-200。
3.评分计算及茶树资源判定
分数＝1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量；
分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
实施例2
适制乌龙茶的高香型茶树资源筛选方法
1.样品前处理
将采摘后的新鲜茶叶(10～15g)堆放于25℃条件下3h，处理后立即放入液氮中速冻，并保存于-80℃条件下。
2.香气物质提取与测定
将经过处理二处理后的样品在液氮中研磨成粉末后，称取500mg茶叶粉末，置于萃取瓶中，加入2mL二氯甲烷(乙醚或乙酸乙酯)和5nmol癸酸乙酯(作为内标)，在室温条件下过夜振荡提取。次日，用无水硫酸钠干燥，然后用氮吹仪(MIULAB NDK200-1；米欧仪器公司，杭州，中国)浓缩至约200μL。浓缩液用GC-MS(QP2010 SE；Shimadzu Corporation，东京，日本)分析，定量浓缩液中的香叶醇、苯甲醇、苯乙醇。
分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10(30m×0.25mm×0.25μm；SupelcoInc.，宾夕法尼亚，美国)，进样体积为1μL，进样口温度为230℃，不分流模式，载气(氦气)的流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40-200。
3.评分计算及茶树资源判定
分数＝1.959+0.074香叶醇含量+0.014苯甲醇含量-0.013苯乙醇含量；
分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
实施例3
适制乌龙茶的高香型茶树资源筛选方法
1.样品前处理
将采摘后的新鲜茶叶(10～15g)堆放于25℃条件下3h，处理后立即放入液氮中速冻，并保存于-80℃条件下。
2.香气物质提取与测定
将样品在液氮中研磨成粉末后，称取500mg茶叶粉末，置于萃取瓶中，加入2mL二氯甲烷(乙醚或乙酸乙酯)和5nmol癸酸乙酯(作为内标)，在室温条件下过夜振荡提取。次日，用无水硫酸钠干燥，然后用氮吹仪(MIULAB NDK200-1；米欧仪器公司，杭州，中国)浓缩至约200μL。浓缩液用GC-MS(QP2010 SE；Shimadzu Corporation，东京，日本)分析，定量浓缩液中的芳樟醇氧化物、香叶醇、苯甲醇。
分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10(30m×0.25mm×0.25μm；SupelcoInc.，宾夕法尼亚，美国)，进样体积为1μL，进样口温度为230℃，不分流模式，载气(氦气)的流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40-200。
3.评分计算及茶树资源判定
分数＝1.146+0.128芳樟醇氧化物含量-0.56香叶醇含量+0.24苯甲醇含量；
分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
取12份茶叶样品通过实施例1～3中的方法进行判定，并与专业的审评专家进行打分的结果进行对比如下：
具体的感官审评如下进行：
1.样品前处理
新鲜采摘下来的茶叶放在竹匾上于日光下曝晒(温度43℃，光强93500Lux)，持续时间约70分钟，即日光萎凋(SW)。随后，将竹匾转移到温度27℃、湿度70％的室内环境晾放，持续2个小时，即室内萎凋(IW)。接着，进行5次的连续做青：将茶叶放于稍立体的竹匾中，人工摇晃竹匾5次，持续时间分别为30s、1min、3min、6min和10min，每次摇晃完后将茶叶堆放成火山形状(即形成中间有圆缺口的茶叶堆)，堆放时间为1.5h，即做青1～5(T1～T5)。在第5次做青后，将茶叶转入滚筒式炒茶机中(温度约250℃)进行杀青固样(F)，持续2-3min，以终止样品中的酶活反应。最后，在室温下将杀青后的茶叶揉捻(R)15min，再置于105℃烘干机中烘1.5h至干燥(D)。
2.感官审评
对按乌龙茶加工后的样品进行感官审评。感官审评的标准分为三个等级：1-低(挥发性差，香气低沉，花果香和花蜜香不明显)；3-中(挥发性一般，有一定的香气，具有一定的花果香和花蜜香)；5-高(挥发性好，香气显锐，具有明显的花果香和花蜜香)。由7名专业的审评专家进行打分，根据打分结果计算出每个样品的分数。
标志物含量如下表所示：
Figure BDA0002227899680000061
计算得到评分及感官评审分数如下：
评分 实施例1 实施例2 实施例3 感官审评
1 1.52 2.12 2.56 1.57
2 1.27 1.97 5.04 1.29
3 1.58 3.42 -11.11 1.43
4 1.64 2.22 6.06 1.14
5 1.84 2.02 -1.2 1.29
6 1.49 2.44 -0.45 1.29
7 4.49 4.42 13.02 4.43
8 3 3.94 6.88 4.86
9 4.68 1.96 3.6 4.43
10 3.46 13.46 -58.85 3.86
11 4.35 2.29 -0.42 4.43
12 5.45 2.18 0.74 4.86
通过上述评分结果可知：实施例一拟合出来的方程，分数＝1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量，算出的分数与感官审评的结果最为接近，用于筛选适制乌龙茶的高香茶树资源更为准确。
本发明中采用的判定方法中，不需要将茶叶制成乌龙茶，而是将采摘后的新鲜茶叶(10-15g)堆放于23～27℃条件下2～4h，处理后立即放入液氮中速冻，该处理方法操作简单、耗时短、需样量少、可靠性强，下述实施例4中采用了与本发明中不同的前处理方法。
实施例4
1.样品前处理
将采摘后的新鲜茶叶立即放入液氮中速冻，并保存于-80℃条件下。
2.香气物质提取与测定
将样品在液氮中研磨成粉末后，称取500mg茶叶粉末，置于萃取瓶中，加入2mL二氯甲烷(乙醚或乙酸乙酯)和5nmol癸酸乙酯(作为内标)，在室温条件下过夜振荡提取。次日，用无水硫酸钠干燥，然后用氮吹仪(MIULAB NDK200-1；米欧仪器公司，杭州，中国)浓缩至约200μL。浓缩液用GC-MS(QP2010 SE；Shimadzu Corporation，东京，日本)分析，定量浓缩液中的吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯。
分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10(30m×0.25mm×0.25μm；SupelcoInc.，宾夕法尼亚，美国)，进样体积为1μL，进样口温度为230℃，不分流模式，载气(氦气)的流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40-200。
3.评分计算及茶树资源判定
拟合得到的评分公式为：分数＝1.597+0.082吲哚含量-0.118橙花叔醇含量+0.314茉莉内酯含量，R2＝0.639，p＝0.013；
分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
取12份茶叶样品通过实施例1及实施例4中的方法进行判定，并与专业的审评专家进行打分的结果进行对比如下：
Figure BDA0002227899680000071
Figure BDA0002227899680000081
通过上述评分结果可知：采用实施例1中的前处理方法测得的标志物含量计算得到的分数与感官审评的结果更为接近，使用实施例1中的前处理方法能够更准确地筛选出高香型茶树资源。

Claims (4)

1.一种标志物在筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源中的应用，其特征在于，所述标志物由吲哚、橙花叔醇和茉莉内酯组成；用于筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的评分公式为：分数=1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量，分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
2.一种筛选适制乌龙茶的高香型茶树资源的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从待筛选茶树采摘茶叶，将新鲜茶叶于23～27℃堆放2～4h，然后放入液氮中速冻；
2)萃取速冻后的新鲜茶叶中的香气物质；
3)定量香气物质中的吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯；
4)根据评分公式计算分数筛选得到适制乌龙茶的高香型茶树资源，评分公式为：分数=1.489-0.006吲哚含量+0.004橙花叔醇含量+0.181茉莉内酯含量；
步骤2）中使用二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯萃取香气物质，具体提取过程为：在速冻后的鲜叶茶叶中加入二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯，在室温条件下过夜震荡提取，用无水硫酸钠干燥，然后用氮吹仪浓缩；
步骤3）中通过GC-MS定量香气物质中的吲哚、橙花叔醇、茉莉内酯；
分数大于等于3时为高香茶树资源，分数小于3时为低香茶树资源。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：GC-MS分析条件如下：柱子型号为SUPELCOWAXTM 10，进样口温度为230℃，不分流模式，载气流速为1.0mL/min；GC柱温箱温度程序是60℃保持3min，再以4℃/min的速度升温至240℃，然后在240℃保持20min；质谱采用Scan模式，质荷比范围是40～200。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：以癸酸乙酯为内标。
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