CN104820059A - 一种快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法 - Google Patents

一种快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及经济作物种质创新技术领域，特别涉及一种快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法。本发明的方法包括以下步骤：(1)样品溶液的制备；(2)对照品溶液的制备；(3)将样品溶液和对照品溶液点在同一聚酰胺薄层板上，用展开剂展开，所述展开剂中按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝(8～10)：(4～6)：3，取出、晾干、扫描、显色，将样品与对照品对比，如果样品出现与对照品相同的Rf，则样品中含有EGCG3"Me，如果样品不出现与对照品相同的Rf，则样品中不含EGCG3"Me。本发明提供的方法前处理简单、快速，每次可以同时测定10个以上的茶叶样品，适合大量样品的分析测定。

Description

一种快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法
技术领域
本发明涉及经济作物种质创新技术领域，特别涉及一种快速筛选含有EGCG3″Me茶树资源的方法。
背景技术
(-)-表没食子儿茶素3-O(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG3″Me)和(-)-表没食子儿茶素3-O(4-O-甲基)没食子酸酯(EGCG4″Me)是茶树中两种重要的儿茶素衍生物。研究发现，EGCG3″Me和EGCG4″Me对治疗花粉过敏等过敏反应症有极其显著的效果，其生物学功能己经在体外和体内的临床实验中得以证实。EGCG3″Me和EGCG3″Me抑制小鼠皮肤被动过敏反应的效果是EGCG的两倍。甲基化EGCG不仅能抑制组胺释放从而抑制肥大细胞的活性，还能抑制肥大细胞的PTK活性，抑制由FCεRI引发的神经刺激以及直接抑制PS/TK活性。近年来，花粉症已成为变态反应性疾病中最常见的疾病之一，如大约有30％的日本人患有不同程度的花粉过敏症，因此有关茶叶甲基化EGCG的研究受到高度重视。然而，由于富含甲基化EGCG的茶树资源稀少，国内甲基化EGCG的研究报道甚少。我国是茶树原产地，生态资源优越，茶树种资源丰富。截至2013年底，国家种质杭州茶树圃和勐海分圃已收集保存国内19个省市、8个国家的茶组植物资源共3000多份，其中野生资源约占10％、地方品种60％、选育品种和育种材料30％，有77个国家级茶树良种和110个省级良种。这些茶树种质资源是茶树种质创新、品种选育、生产利用的物质基础。因此，建立快速高通量的茶叶内含成分分析方法，快速获取茶树优异资源，是当前茶树育种和种质创新的重要方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速筛选含有EGCG3″Me茶树资源的方法。
为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：
一种快速筛选含有EGCG3″Me茶树资源的方法，包括以下步骤：
(1)样品溶液的制备：称取茶叶样品研磨成粉末，然后加入甲醇回流提取，所述茶叶样品与甲醇的质量体积比(g/ml)为1:125～1:250过滤，得到样品溶液；
(2)对照品溶液的制备：将EGCG、ECG、EGCG3″Me、EGC、EC溶解在甲醇中得到对照品溶液；
(3)将样品溶液和对照品溶液点在同一聚酰胺薄层板上，用展开剂展开，所述展开剂中按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝(8～10)：(4～6)：3，取出，晾干，在薄层扫描仪中扫描，显色，将样品与对照品对比，将样品与对照品对比，如果样品出现与EGCG3″Me相同的Rf，则样品中含有EGCG3″Me，如果样品不出现与EGCG3″Me相同的Rf，则样品中不含EGCG3″Me。
进一步的，在本发明技术方案的基础上，还可以快速筛选出富含EGCG3″Me茶树资源，其中一种具体的实施方式为：当步骤(3)出现与EGCG3″Me相同的Rf，则样品中含有EGCG3″Me，此时计算EGCG3″Me的峰面积，如果EGCG3″Me≥0.5％，则认为样品中富含EGCG3″Me。
本发明所述茶叶样品由茶树鲜叶一芽二三叶冷冻干燥18-24h得到。
茶树鲜叶取样时要求取样的茶树为茶树资源生长条件及生长势基本一致、且取样时间点一致。
步骤(3)中的显色可选用现有技术中所有的显色方法，例如将晾干后的聚酰胺薄层板放入薄层扫描仪中扫描，用5％的三氯化铁乙醇溶液显色，用电吹风吹干薄层板至斑点显色。
优选的，为了使EGCG3″Me的响应信号最强，扫描后峰面积最大， 使得样品的检测更加灵敏，通过光谱扫描(200-600nm)，确定EGCG3″Me的最大吸收波长为280nm。
作为步骤(1)一种优选的技术方案，步骤(1)为：称取茶叶样品研磨成粉末，然后加入甲醇回流提取10-20min，所述茶叶样品与甲醇的质量体积比为1:125～1:250，此时样品中EGCG3″Me提取效率最高，而且样品浓度适中，有利于薄层色谱点样。
步骤(1)的一种具体的实施方式为：准确称取0.10g茶叶样品，研磨成粉末，然后加入50ml甲醇，加热回流提取10min，过滤，即得样品溶液。
步骤(1)得到的样品溶液可以在冷冻(-20℃)的条件保存备用。
具体的，步骤(2)中EGCG、ECG、EGCG3″Me、EGC、EC与甲醇的质量体积比均为(0.1～1)mg：1ml；优选地，EGCG、ECG、EGCG3″Me、EGC、EC与甲醇的质量体积比均为0.5mg：1ml。
优选地，步骤(3)中取样品溶液和对照品溶液各5～10μl点在同一聚酰胺薄层板上，用展开剂展开。
作为展开剂的优选实施方式有以下三种：
(1)按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝8：5：3；
(2)按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝10：5：3；
(3)按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝10：6：3；
当展开剂选用上述三种方式的任意一种时，样品中EGCG3″Me均能与样品中其它儿茶素达到良好的分离，有利于EGCG3″Me的定性定量。
本发明提供的方法前处理简单、快速，每次可以同时测定10个以上的茶叶样品，适合大量样品的分析测定；而高效液相色谱每次只能测定1个茶叶样品，分析时间长，且前处理复杂，与高效液相色谱法相比，本发明提供的方法能够简便、快速、高通量的筛选出含有(富含)EGCG3″Me的茶树资源。
附图说明
图1为实施例1的薄层分离图谱；
图中1、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；2、表儿茶素没食子酸酯(ECG)；3、EGCG3″Me；4、表没食子儿茶素(EGC)；5、表儿茶素(EC)；6-8均为茶叶样品。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
以湖南省茶叶研究所高桥茶叶实验茶场茶树品种资源为考察对象，于2014年3月30号取样，总共采集20个样品，采集茶树鲜叶一芽二三叶，冷冻干燥18-24h得茶叶样品。
快速筛选富含EGCG3″Me茶树资源的方法，具体包括以下步骤：
(1)准确称取0.20g茶叶样品，研磨成粉末，然后加入50ml甲醇，加热回流提取10min，过滤，得到样品溶液；
(2)准确称取EGCG 0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到EGCG对照品溶液，浓度为0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
准确称取ECG 0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到ECG对照品溶液，浓度为0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
准确称取EGCG3″Me 0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到EGCG3″Me对照品溶液，浓度0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
准确称取EGC 0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到EGC对照品溶液，浓度为0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
准确称取EC 0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到EC对照品溶液，浓度为0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
(3)吸取对照品溶液和样品的溶液各6μl，点在同一聚酰胺薄层板上、距板底1cm处同一水平线上，展开剂是甲醇、乙酸和丙酮，甲醇、乙酸和丙酮的体积比是8:5:3，平衡5～10min，展开，展开至距板顶1cm处取出，晾干，放入薄层扫描仪中扫描，波长280nm，用5％ 的三氯化铁乙醇溶液显色，用电吹风吹干薄层板至斑点显色。
实验结果如图1所示，在图1中从左到右依次为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、EGCG3″Me、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、茶叶样品、茶叶样品、茶叶样品的薄层分离图谱，在图1中仅列出了富含EGCG3″Me的茶叶样品的图谱。
结果表明，20个茶树资源中，EGCG3″Me的含量≥0.5％有3个。含有EGCG3″Me茶树品种资源适合加工抗过敏的绿茶和乌龙茶，也适用于EGCG3″Me的提制，筛选到的3个茶树资源被认为富含EGCG3″Me的茶树资源。
实施例2
以湖南省农业大学长安茶叶基地茶树品种资源为考察对象，于2014年4月10号取样，总共采集15个样品，采集茶树鲜叶一芽二三叶，冷冻干燥的茶叶18-24h得茶叶样品。
快速筛选富含EGCG3″Me茶树资源的方法，具体包括以下步骤：
(1)准确称取0.20g茶叶样品，研磨成粉末，然后加入50ml甲醇，加热回流提取10min，过滤，得到样品溶液；
(2)准确称取EGCG3″Me0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到EGCG3″Me对照品溶液，浓度0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
(3)吸取对照品溶液和样品的溶液各6μl，点在同一聚酰胺薄层板上、距板底1cm处同一水平线上，展开剂是甲醇、乙酸和丙酮，甲醇、乙酸和丙酮的体积比是10:5:3，平衡5～10min，展开，展开至距板顶1cm处取出，晾干，放入薄层扫描仪中扫描，波长280nm，用5％的三氯化铁乙醇溶液显色，用电吹风吹干薄层板至斑点显色。实施例2的图谱与实施例1相似，在此不再赘述。
结果表明，15个茶树资源中，EGCG3″Me的含量≥0.5％有2个。含有EGCG3″Me茶树品种资源适合加工抗过敏的绿茶和乌龙茶，也适用于EGCG3″Me的提制，筛选到的2个茶树资源被认为富含 EGCG3″Me的茶树资源。
实施例3
以湖南省茶叶研究所高桥茶叶实验茶场茶树品种资源为考察对象，于2014年3月25号取样，总共采集20个样品，采集茶树鲜叶一芽二三叶，冷冻干燥的茶叶18-24h得茶叶样品。
快速筛选富含EGCG3″Me茶树资源的方法，具体包括以下步骤：
(1)准确称取0.20g茶叶样品，研磨成粉末，然后加入25ml甲醇，加热回流提取20min，过滤，得到样品溶液；
(2)准确称取EGCG3″Me0.5mg，加1ml甲醇溶解，得到EGCG3″Me对照品溶液，浓度0.5mg/ml，作为定性和半定量的标准；
(3)分别吸取对照品溶液和样品的溶液各6μl和3μl，点在同一聚酰胺薄层板上、距板底1cm处同一水平线上，展开剂是甲醇、乙酸和丙酮，甲醇、乙酸和丙酮的体积比是10:6:3，平衡5～10min，展开，展开至距板顶1cm处取出，晾干，放入薄层扫描仪中扫描，波长280nm，用5％的三氯化铁乙醇溶液显色，用电吹风吹干薄层板至斑点显色。实施例3的图谱与实施例1相似，在此不再赘述。
结果表明，20个茶树资源中，EGCG3″Me的含量≥0.5％有2个。含有EGCG3″Me茶树品种资源适合加工抗过敏的绿茶和乌龙茶，也适用于EGCG3″Me的提制，筛选到的2个茶树资源被认为富含EGCG3″Me的茶树资源。
实施例4
实施例4与实施例1-3的区别仅在于步骤(3)中的展开剂不同，在实施例4中甲醇、乙酸和丙酮的体积比是9:4:3，结果表明，实施例4的实验结果与实施例1～3的实验结果均相同。
对比例1
对比例1与实施例1～3的区别仅在于展开剂中各组分的用量不同，在对比例1中按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝6:3:2，样品中EGCG3″Me 不能与样品中表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)达到理想分离，导致样品中EGCG3″Me不能正确定性定量。
对比例2
对比例2与实施例1～3的区别仅在于展开剂中各组分选择及用量均不同，在对比例1中按体积比8:3:3，样品中EGCG3″Me不能与样品中EGC达到理想分离，导致样品中EGCG3″Me不能正确定性定量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品溶液的制备：称取茶叶样品研磨成粉末，然后加入甲醇回流提取10～20min，所述茶叶样品与甲醇的质量体积比为1:125～1:250过滤，得到样品溶液；
(2)对照品溶液的制备：将EGCG、ECG、EGCG3"Me、EGC、EC分别溶解在甲醇中得到对照品溶液；
(3)将样品溶液和对照品溶液点在同一聚酰胺薄层板上，用展开剂展开，所述展开剂中按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝(8～10)：(4～6)：3，取出、晾干、扫描、显色，将样品与对照品对比，如果样品出现与EGCG3"Me相同的Rf，则样品中含有EGCG3"Me，如果样品不出现与EGCG3"Me相同的Rf，则样品中不含EGCG3"Me。
2.根据权利要求1所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，当步骤(3)样品出现与EGCG3"Me相同的Rf，则样品中含有EGCG3"Me，此时还包括计算EGCG3"Me的峰面积，如果EGCG3"Me≥0.5％，则认为样品中富含EGCG3"Me。
3.根据权利要求1或2所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，步骤(1)为准确称取0.20g茶叶样品，研磨成粉末，然后加入50ml甲醇，加热回流提取10min，过滤，得到样品溶液。
4.根据权利要求1或2所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，步骤(2)中EGCG、ECG、EGCG3"Me、EGC、EC与甲醇的质量体积比均为(0.1～1)mg：1ml。
5.根据权利要求1或2所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，步骤(3)中取样品溶液和对照品溶液均为5～10μl。
6.根据权利要求1或2所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扫描为在波长为280nm的薄层扫描仪中扫描。
7.根据权利要求1或2所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，所述茶叶样品由茶树鲜叶一芽二三叶冷冻干燥18-24h得到。
8.根据权利要求1-7任一项所述的快速筛选含有EGCG3"Me茶树资源的方法，其特征在于，步骤(3)所述展开剂中按体积比甲醇：乙酸：丙酮＝8：5：3；或甲醇：乙酸：丙酮＝10：5：3；或甲醇：乙酸：丙酮＝10：6：3。
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