CN101177422A

CN101177422A - 从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法

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Publication number: CN101177422A
Application number: CNA2007100931145A
Authority: CN
Inventors: 龚正礼; 罗正飞; 杨坚; 童华荣; 谢进平
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2027-12-07
Also published as: CN100582102C

Abstract

一种从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，茶粉末先经乙醇提取，再经石油醚萃取以去除叶绿素和脂溶性成分，然后经乙酸乙酯萃取得甲基化儿茶素粗提物干粉A，再经粗聚酰胺树脂和细聚酰胺树脂分离纯化，得甲基化儿茶素粗品，最后经高效逆流色谱进一步提纯，得甲基化儿茶素纯品。本发明首先在国内建立了甲基化儿茶素的提纯工艺，得到较高纯度的甲基化儿茶素；而且本发明采用高速逆流色谱(HSCCC)制备工艺，相比于高效液相色谱(HPLC)制备工艺，高速逆流色谱不需要固体支撑体，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。且高速逆流色谱具有制备量大，综合成本低，易于工业推广等优点。

Description

从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法

技术领域

本发明涉及从天然产物中制备活性成分的方法，具体地说，涉及从茶叶中提取甲基化儿茶素的工艺方法。

背景技术

二十世纪90年代末期，日本科学家最早成功从台湾冻顶乌龙茶中分离鉴定出两种具有抗过敏功能的新型儿茶素衍生物，经分离、纯化后鉴定证明其分子结构分别为(-)-表没食子儿茶素3-O(3-O-甲基)没食子酸酯(C-1)和(-)-表没食子儿茶素3-O(4-O-甲基)没食子酸酯(C-2)。为白色粉末状物质，易溶于水和有机溶剂，其结构式如式(1)所示：

R₁ R₂

EGCG H H

EGCG3″Me CH₃ H

EGCG4″Me H CH₃

EGCG3″Me和EGCG4″Me对抗过敏，尤其是抗花粉症过敏具有非常显著的功效。花粉症是变态反应中最具代表性的，其发病率逐年升高，尤其是二十世纪八十年代以后其发病率迅速升高，已经成为世界性卫生问题。WHO于1997年将之列为“二十一世纪重点研究和预防的疾病”。但是，甲基化儿茶素仅在极少数的中叶种茶树品种中存有，所以该项研究受到日本业界高度重视，小川制药、太阳制药、三井农林等几大公司均投以重金，加紧秘密研发。因甲基化儿茶素对治疗花粉过敏等过敏反应症有极其显著的效果，抑制小鼠皮肤被动过敏反应的效果是EGCG的两倍，已被视为人们期待已久的抗过敏症材料。随着甲基化儿茶素的功能研究逐步得到权威机构的认可，其相关方面的研究也逐步得到国际学术机构的高度重视。目前，甲基化儿茶素的提取与分离纯化技术的前沿研究主要集中在日本，受商业秘密的保护，甲基化EGCG的提取与分离纯化技术方法尚未见到报导。

目前，工业化提取儿茶素的方法主要是溶剂萃取法和离子沉淀法，溶剂萃取法是目前最广泛采用的方法，该方法工艺成熟稳定，提取率较高，但生产时使用多种有机溶剂，且用量大，有些甚至是有毒溶剂(如氯仿)，因而很难为食品和医药等行业所接受。离子沉淀法减少了有机溶剂的使用量，生产的儿茶素纯度高，但工艺操作要求较高，需严格控制pH值，否则儿茶素可能会氧化，同时，工艺中大量使用酸碱液，废渣处理量大，容易造成环境污染。其次，还有几种提取技术正处于试验阶段：(1)超临界流体萃取技术，该技术是一种新型的提取天然物质的分离技术，具有低能耗、无污染、高分离能力、质量好、速度快等优点，这些特点迎合崇尚纯天然的发展潮流，但设备要求高，一次性投资大，对于提取儿茶素来说，超临界CO₂提取效果不是很好，而超临界萃取剂、助溶剂在超临界状态下的溶解度等研究尚未成熟，因此很难进入规模化大生产；(2)吸附树脂法提取儿茶素工艺简单，能耗少，树脂再生容易，可反复利用，提取效率高，提取过程无污染，符合环保要求，条件温和，不会破坏儿茶素活性，具有良好的发展前景。但关键问题在于怎样找到一种对儿茶素吸附能力强、解吸容易的树脂。儿茶素单体制备方法主要有凝胶层析法、HPLC制备以及高速逆流色谱法等技术，前两种技术操作繁琐、耗时长、设备材料昂贵，高速逆流色谱则具有适应性好、操作简单、回收率高、重现性好、分离效率高、分离量大等特点，因而具有良好的应用和开发价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从茶叶中提取、分离、纯化甲基化儿茶素的工艺方法，以得到高纯度的甲基化儿茶素。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

制备步骤1、先将茶鲜叶萎凋5～12小时，进行滚筒杀青处理，然后在80～120℃条件下干燥，经粉碎机制成颗粒大小为60～80目的茶粉。

制备步骤2、用茶粉和60～80％乙醇溶液同时置于提取罐中进行固液萃取，萃取温度为70～90℃，时间为30～120分钟，料液比为1∶3～1∶10，过滤，滤渣反复萃取2～5次；参照茶叶中茶多酚的提取方法进行初步提取，茶多酚的提取方法一般采用水提法、乙醇提取法、丙酮提取法、酸液提取法。其中水提法提取率不高，而且沸点较高，不能采用连续回流的方法进行提取，同时会给随后的浓缩过程带来困难，因此不可取；丙酮提取法提取的多酚提取率较高，但是相对成本较高、毒性较大，不可取；酸液提取法可以提高多酚的提取率，但其易使多酚分子降解，不能真实地反应材料中的多酚成分。乙醇价廉易得，无毒，选择性好，提取液易于浓缩、干燥，可以回收再利用，通过综合考虑各个因素，本发明采用乙醇作为提取剂进行提取。

制备步骤3、合并所有萃取液后进行浓缩，浓缩液和石油醚溶液按体积比1∶1～1∶2混合后，进行液液萃取，时间为5～30分钟，反复操作2～5次；用石油醚萃取去除萃取液中叶绿素和脂溶性成分杂质。

制备步骤4、将所得萃余液再与乙酸乙酯按体积比为1∶1～1∶2混合，进行液液萃取，时间为5～30分钟，反复操作2～5次，所得萃取液过滤、浓缩，得浓缩液，浓缩液在60～100℃条件下干燥，得甲基化儿茶素粗提物干粉A；乙酸乙酯对多酚类物质溶解性较强，经过乙酸乙酯萃取后，多酚类物质的含量进一步富集，纯化后多酚物质的质量分数可以达到80％左右，对下一步提取分离的效果显著提高。

制备步骤5、用经预处理过的20～50目粗聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混匀，装入层析柱，然后用20～95％的乙醇洗脱，流速为0.5～1BV/h，收集洗脱液，浓缩，在60～100℃条件下干燥得甲基化儿茶素粗提物干粉B；利用粗聚酰胺树脂初步去除茶多酚中与甲基化儿茶素化学性质差异较大的杂质。

制备步骤6、用经预处理过的60～200目细聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混匀，装入层析柱，用甲醇和三氯甲烷按体积比为1∶1～4∶1的洗脱液进行洗脱，流速为0.1～0.5BV/h，收集洗脱液，浓缩，在60～100℃条件下干燥，得甲基化儿茶素粗品；利用细聚酰胺树脂进一步去除茶多酚中与甲基化儿茶素化学性质差异较大的杂质。

制备步骤7、用水和甲醇按体积比7∶2～5∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按体积比6∶1～10∶1，配制混合液B，将混合液A和混合液B均匀混合，充分饱和后，静置6～12h，取上相作为固定相，下相作为流动相；将甲基化儿茶素粗品，用流动相配制成0.5～2mg/mL的溶液M，将固定相推进逆流色谱的螺旋管柱中，调节转速为正转600～800r/min，以1～2mL/min的流速将流动相泵入，待机器稳定后将溶液M注入逆流色谱，用分布收集器进行收集，将所有含有甲基化儿茶素的收集液合并、浓缩后，浓缩液在60～100℃条件下干燥，得甲基化儿茶素纯品。

所述制备步骤3、制备步骤4、制备步骤5、制备步骤6和制备步骤7的浓缩条件是温度为20～65℃，负压为0.06～0.1MPa。

所述粗聚酰胺树脂树脂和细聚酰胺树脂树脂的预处理方法如下：步骤1、乙醇浸泡：将树脂浸泡在90～95％的乙醇中，不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分的接触、溶胀，一般为24h。以便从中赶出空气并对树脂进行浮选；步骤2、乙醇冲洗：将浸泡了24h后的树脂湿法上柱，再用90～95％的乙醇冲洗，直至流出液清亮无混浊，蒸干无残留物为止；步骤3、3％的氢氧化钠冲洗：以2BV、3％的氢氧化钠冲洗树脂，并浸泡4h，然后用蒸馏水冲洗至中性；步骤4、5％的柠檬酸冲洗：以2BV、5％的柠檬酸冲洗树脂，并浸泡4小时，然后用蒸馏水冲洗至中性。粗聚酰胺树脂树脂和细聚酰胺树脂树脂也可以采用其他预处理方法。

所述制备步骤4中通过以下方法使儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂充分混匀：先将儿茶素粗提物干粉A全部溶于甲醇制成溶液，在80～100℃加热条件下，边加入溶液，边搅拌粗聚酰胺树脂直到儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂充分混匀。

所述制备步骤5中通过以下方法使儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂充分混匀：先将儿茶素粗提物干粉B全部溶于甲醇制成溶液，在80～100℃加热条件下，边加入溶液，边搅拌粗聚酰胺树脂直到儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂充分混匀。

所述制备步骤2、制备步骤3、制备步骤4、制备步骤5和制备步骤6的浓缩条件是温度为20～65℃，负压为0.06～0.1MPa。

所述制备步骤1的过滤采用80～200目的滤网进行负压抽滤或离心过滤。

所述制备步骤4和制备步骤5中的层析柱为中压层析柱，该层析柱的柱长30～100cm，柱直径5～100cm，柱压0.1～5MPa。

所述制备步骤6中，固定相以9.99ml/min的流速泵入管路中，甲基化儿茶素粗品溶于流动相后，然后超声溶解均匀、过滤即得溶液M。由首端向尾端洗脱，然后泵入流动相进行洗脱，当流动相流出色谱分离柱时，调整紫外检测器零点，并在254nm下连续检测，记录仪同步记录，用自动部分收集器收集下相洗脱液，根据谱峰收集样品。

本发明的优点：

(1)首先在国内建立了甲基化儿茶素的提纯工艺，得到纯度90％以上的甲基化儿茶素；

(2)本发明采用高速逆流色谱(HSCCC)制备工艺，相比于高效液相色谱(HPLC)制备工艺，高速逆流色谱不需要固体支撑体，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。且高速逆流色谱具有制备量大，综合成本低，易于工业推广等优点。

(3)浸提过程中选用乙醇做溶剂，成本低，安全性能好，污染低，易于回收；

附图说明

图1为甲基化儿茶素标样的HPLC图谱；

图2为本发明实施例1所制得产品的HPLC图谱；

图3为本发明实施例2所制得产品的HPLC图谱；

图4为本发明实施例3所制得产品的HPLC图谱；

具体实施方式

下面结合实施例进一步对本发明加以说明：

本发明的制备步骤如下：

(1)样品制备：采摘一芽二、三叶茶鲜叶，在通风条件下，在萎凋室中，用萎凋筛萎凋5～12小时后，进行滚筒杀青处理，然后在80～120℃条件下，用烘干机干燥，将茶叶用粉碎机粉碎成60～80目粉末；

(2)乙醇提取：用茶粉与60～80％乙醇溶液同时置于提取罐中进行固液萃取，萃取温度为70～90℃，时间为30～120分钟，料液比为1∶3～1∶10，用真空抽滤机进行抽滤，滤渣反复萃取2～5次；

(3)粗提液的纯化：合并所有萃取液后进行在浓缩罐中进行真空浓缩，浓缩液和石油醚溶液按体积比1∶1～1∶2混合，在萃取罐中进行液液萃取，时间为5～30分钟，反复操作2～5次，以去除叶绿素和脂溶性成分；

(4)乙酸乙酯进行萃取：将所得萃余液再与乙酸乙酯按体积比为1∶1～1∶2混合，在萃取罐中进行液液萃取，时间为5～30分钟，反复操作2～5次，所得萃取液用真空抽滤机进行抽滤，在温度为20～65℃，负压为0.06～0.1MPa真空浓缩，得浓缩液，浓缩液在60～100℃条件下经真空干燥箱干燥，得甲基化儿茶素粗提物干粉A；

(5)粗聚酰胺初步分离、纯化：

a粗聚酰胺树脂的预处理：

步骤1、乙醇浸泡：将树脂浸泡在90～95％的乙醇中，不时搅拌，使树脂和乙醇充分的接触、溶胀，一般为24h。以便从中赶出空气并对树脂进行浮选。

步骤2、乙醇冲洗：将浸泡了24h后的树脂上柱，再用90～95％的乙醇冲洗，直至流出液清亮无混浊，蒸干无残留物为止。

步骤3、3％的氢氧化钠冲洗：以2BV、3％的氢氧化钠冲洗树脂，并浸泡4h，然后用蒸馏水冲洗至中性。

步骤4、5％的柠檬酸冲洗：以2BV、5％的柠檬酸冲洗树脂，并浸泡4小时，然后用蒸馏水冲洗至中性。

b按干法装柱法，用经预处理过的20～50目粗聚酰胺树脂装进层析柱，先将儿茶素粗提物干粉A全部溶于甲醇制成溶液，在80～100℃加热条件下，边加入溶液，边搅拌粗聚酰胺树脂直到儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂充分混匀，甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂的重量比为1∶1～3.5∶1。装入层析柱，然后用20～95％的乙醇洗脱，流速为0.5～1BV/h，收集洗脱液，在温度为20～65℃，负压为0.06～0.1MPa的条件下用浓缩罐真空浓缩，在60～100℃条件下经真空干燥箱经干燥得甲基化儿茶素粗提物干粉B；

(6)细聚酰胺分离、纯化：

a细聚酰胺的预处理：预处理工艺同粗聚酰胺树脂的预处理；

b按干法装柱法，用经预处理过的20～50目粗聚酰胺树脂装进层析柱，先将儿茶素粗提物干粉B全部溶于甲醇制成溶液，在80～100℃加热条件下，边加入溶液，边搅拌粗聚酰胺树脂直到儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂充分混匀，甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂的重量比为1∶1～3.5∶1，装入层析柱，然后用20～95％的乙醇洗脱，流速为0.5～1BV/h，收集洗脱液，在温度为20～65℃，负压为0.06～0.1MPa的条件下用浓缩罐浓缩，在60～100℃条件下经液喷雾干燥得得甲基化儿茶素粗品；

(7)高速逆流色谱纯化：用水和甲醇按体积比7∶2～5∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按体积比6∶1～10∶1，配制混合液B，将混合液A和混合液B混合，充分饱和后，静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；将甲基化儿茶素粗品，用流动相配制成0.5～2mg/mL的溶液M，将固定相推进逆流色谱的螺旋管柱中，调节转速为正转600～800r/min，以1～2mL/min的流速将流动相泵入，待机子稳定后进样，分布收集器进行收集，将所有含有甲基化儿茶素的收集液合并，在温度为20～65℃，负压为0.06～0.1MPa的条件下用浓缩罐浓缩后，浓缩液喷雾干燥，得甲基化儿茶素纯品。

(8)甲基化儿茶素的高效液相色谱(HPLC)检测

HPLC检测条件：KromasilC18柱(200mm×4.6mm id，5um)色谱柱；流动相A：乙睛，流动相B：0.1mol/L的磷酸二氢钠；流速1.0ml/min；检测波长：280nm；灵敏度：1.000AUFS；柱温：40℃；进样量：10ul。

甲基化儿茶素标样的HPLC图谱见图1。

下面，用具体实施例对本发明进一步加以说明，但是本发明并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1

采摘一芽二、三叶茶鲜叶，在通风条件下，在萎凋室中，用萎凋筛萎凋5小时后，进行滚筒杀青处理，然后在80℃条件下，用烘干机干燥，将茶叶用粉碎机粉碎成60目粉末；按料液比1∶3添加60％乙醇到茶粉中，在70℃，萃取30分钟，萃取完成后，过滤，滤渣反复萃取2次，合并所有萃取液后进行浓缩，浓缩液和石油醚溶液按体积比1∶1混合，进行液液萃取，时间为5分钟，反复操作2次；将所得萃余液再与乙酸乙酯按体积比为1∶1混合，进行液液萃取，时间为5分钟，反复操作2次，所得萃取液过滤、浓缩，得浓缩液，浓缩液经干燥，得甲基化儿茶素粗提物干粉A；用经预处理过的20目粗聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂按重量比1∶1充分混匀，装入层析柱，然后用20％的乙醇洗脱，流速为0.5BV/h，收集洗脱液，浓缩，经干燥得甲基化儿茶素粗提物干粉B；用经预处理过的60目细聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂按重量比1∶1充分混匀，装入层析柱，用甲醇和三氯甲烷按体积比为1∶1的洗脱液进行洗脱，流速为0.1BV/h，收集洗脱液，浓缩，干燥，得甲基化儿茶素粗品；用水和甲醇按体积比7∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按体积比6∶1，配制混合液B，将混合液A和混合液B混合，充分饱和后，静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；将甲基化儿茶素粗品，用流动相配制成0.5mg/mL的溶液M，将固定相推进逆流色谱的螺旋管柱中，调节转速为正转600r/min，以1mL/min的流速将流动相泵入，待机子稳定后进样，分布收集器进行收集，将所有含有甲基化儿茶素的收集液合并、浓缩后，浓缩液干燥，得甲基化儿茶素纯品。

将得到的儿茶素纯品进行HPLC检测，如图2，纯度为92.1％。

实施例2

采摘一芽二、三叶茶鲜叶，在通风条件下，在萎凋室中，用萎凋筛萎凋8小时后，进行滚筒杀青处理，然后在100℃条件下，用烘干机干燥，将茶叶用粉碎机粉碎成70目粉末；按料液比1∶6添加70％乙醇到茶粉中，在80℃，萃取60分钟，萃取完成后，过滤，滤渣反复萃取3次，合并所有萃取液后进行浓缩，浓缩液和石油醚溶液按体积比1∶1混合，进行液液萃取，时间为15分钟，反复操作3次；将所得萃余液再与乙酸乙酯按体积比为1∶1混合，进行液液萃取，时间为15分钟，反复操作3次，所得萃取液过滤、浓缩，得浓缩液，浓缩液经干燥，得甲基化儿茶素粗提物干粉A；用经预处理过的30目粗聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂按重量比1∶1充分混匀，装入层析柱，然后用60％的乙醇洗脱，流速为0.8BV/h，收集洗脱液，浓缩，经干燥得甲基化儿茶素粗提物干粉B；用经预处理过的80目细聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂按重量比2∶1充分混匀，装入层析柱，用甲醇和三氯甲烷按体积比为2.5∶1的洗脱液进行洗脱，流速为0.3BV/h，收集洗脱液，浓缩，干燥，得甲基化儿茶素粗品；用水和甲醇按体积比6∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按体积比8∶1，配制混合液B，将混合液A和混合液B混合，充分饱和后，静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；将甲基化儿茶素粗品，用流动相配制成1.5mg/mL的溶液M，将固定相推进逆流色谱的螺旋管柱中，调节转速为正转700r/min，以1.5mL/min的流速将流动相泵入，待机子稳定后进样，分布收集器进行收集，将所有含有甲基化儿茶素的收集液合并、浓缩后，浓缩液干燥，得甲基化儿茶素纯品。

将得到的儿茶素纯品进行HPLC检测，如图3，纯度为96.5％。

实施例3

采摘一芽二、三叶茶鲜叶，在通风条件下，在萎凋室中，用萎凋筛萎凋5小时后，进行滚筒杀青处理，然后在120℃条件下，用烘干机干燥，将茶叶用粉碎机粉碎成80目粉末；按料液比1∶10添加80％乙醇到茶粉中，在90℃，萃取120分钟，萃取完成后，过滤，滤渣反复萃取5次，合并所有萃取液后进行浓缩，浓缩液和石油醚溶液按体积比1∶2混合，进行液液萃取，时间为30分钟，反复操作5次；将所得萃余液再与乙酸乙酯按体积比为1∶2混合，进行液液萃取，时间为30分钟，反复操作5次，所得萃取液过滤、浓缩，得浓缩液，浓缩液经干燥，得甲基化儿茶素粗提物干粉A；用经预处理过的50目粗聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂按重量比3.5∶1充分混匀，装入层析柱，然后用95％的乙醇洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液，浓缩，经干燥得甲基化儿茶素粗提物干粉B；用经预处理过的200目细聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂按重量比3.5∶1充分混匀，装入层析柱，用甲醇和三氯甲烷按体积比为4∶1的洗脱液进行洗脱，流速为0.5BV/h，收集洗脱液，浓缩，干燥，得甲基化儿茶素粗品；用水和甲醇按体积比5∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按体积比10∶1，配制混合液B，将混合液A和混合液B混合，充分饱和后，静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；将甲基化儿茶素粗品，用流动相配制成2mg/mL的溶液M，将固定相推进逆流色谱的螺旋管柱中，调节转速为正转800r/min，以2mL/min的流速将流动相泵入，待机子稳定后进样，分布收集器进行收集，将所有含有甲基化儿茶素的收集液合并、浓缩后，浓缩液干燥，得甲基化儿茶素纯品。

将得到的儿茶素纯品进行HPLC检测，如图4，纯度为93.8％。

Claims

1.一种从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：

制备步骤1、先将茶鲜叶萎凋5～12小时，进行滚筒杀青处理，然后在80～120℃条件下干燥，经粉碎机制成颗粒大小为60～80目的茶粉；

制备步骤2、用茶粉和60～80％乙醇溶液同时置于提取罐中进行固液萃取，萃取温度为70～90℃，时间为30～120分钟，料液比为1∶3～1∶10，过滤，滤渣反复萃取2～5次；

制备步骤3、合并所有萃取液后进行浓缩，浓缩液和石油醚溶液按体积比1∶1～1∶2混合后，进行液液萃取，时间为5～30分钟，反复操作2～5次；

制备步骤4、将所得萃余液再与乙酸乙酯按体积比为1∶1～1∶2混合，进行液液萃取，时间为5～30分钟，反复操作2～5次，所得萃取液过滤、浓缩，得浓缩液，浓缩液在60～100℃条件下干燥，得甲基化儿茶素粗提物干粉A；

制备步骤5、用经预处理过的20～50目粗聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混匀，装入层析柱，然后用20～95％的乙醇洗脱，流速为0.5～1BV/h，收集洗脱液，浓缩，在60～100℃条件下干燥得甲基化儿茶素粗提物干粉B；

制备步骤6、用经预处理过的60～200目细聚酰胺树脂装进层析柱，将甲基化儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混匀，装入层析柱，用甲醇和三氯甲烷按体积比为1∶1～4∶1的洗脱液进行洗脱，流速为0.1～0.5BV/h，收集洗脱液，浓缩，在60～100℃条件下干燥，得甲基化儿茶素粗品；

制备步骤7、用水和甲醇按体积比7∶2～5∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按体积比6∶1～10∶1，配制混合液B，将混合液A和混合液B均匀混合，充分饱和后，静置6～12h，取上相作为固定相，下相作为流动相；将甲基化儿茶素粗品，用流动相配制成0.5～2mg/mL的溶液M，将固定相推进逆流色谱的螺旋管柱中，调节转速为正转600～800r/min，以1～2mL/min的流速将流动相泵入，待机器稳定后将溶液M注入逆流色谱，用分布收集器进行收集，将所有含有甲基化儿茶素的收集液合并、浓缩后，浓缩液在60～100℃条件下干燥，得甲基化儿茶素纯品；

2.按照权利要求1所述的从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：所述粗聚酰胺树脂树脂和细聚酰胺树脂树脂的预处理方法如下：

步骤1、乙醇浸泡：将树脂浸泡在90～95％的乙醇中，不时搅拌，使树脂和乙醇充分的接触、溶胀，一般为24h。以便从中赶出空气并对树脂进行浮选；

步骤2、乙醇冲洗：将浸泡了24h后的树脂湿法上柱，再用90～95％的乙醇冲洗，直至流出液清亮无混浊，蒸干无残留物为止；

步骤3、3％的氢氧化钠冲洗：以2BV、3％的氢氧化钠冲洗树脂，并浸泡4h，然后用蒸馏水冲洗至中性；

3.按照权利要求1所述的从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：所述制备步骤5中通过以下方法使儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂充分混匀：先将儿茶素粗提物干粉A全部溶于甲醇制成溶液，在80～100℃加热条件下，边加入溶液，边搅拌粗聚酰胺树脂直到儿茶素粗提物干粉A与粗聚酰胺树脂充分混匀。

4.按照权利要求1所述的从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：所述制备步骤6中通过以下方法使儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂充分混匀：先将儿茶素粗提物干粉B全部溶于甲醇制成溶液，在80～100℃加热条件下，边加入溶液，边搅拌粗聚酰胺树脂直到儿茶素粗提物干粉B与细聚酰胺树脂充分混匀。

5.按照权利要求1所述的从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：所述制备步骤2的过滤采用80～200目的滤网进行负压抽滤或离心过滤。

6.按照权利要求1所述的从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：所述制备步骤5和制备步骤6中的层析柱为中压层析柱，该层析柱的柱长30～100cm，柱直径5～100cm，柱压0.1～5MPa。

7.按照权利要求1所述的从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法，其特征在于：所述制备步骤7中，固定相以9.99ml/min的流速泵入管路中，甲基化儿茶素粗品溶于流动相后，然后超声溶解均匀、过滤即得溶液M；由首端向尾端洗脱，然后泵入流动相进行洗脱，当流动相流出色谱分离柱时，调整紫外检测器零点，并在254nm下连续检测，记录仪同步记录，用自动部分收集器收集下相洗脱液，根据谱峰收集样品。