CN104998263B - 一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents
一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104998263B CN104998263B CN201510552232.2A CN201510552232A CN104998263B CN 104998263 B CN104998263 B CN 104998263B CN 201510552232 A CN201510552232 A CN 201510552232A CN 104998263 B CN104998263 B CN 104998263B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phase
- ethyl acetate
- glucosidase
- under reduced
- reduced pressure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000018597 common camellia Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 229940077274 Alpha glucosidase inhibitor Drugs 0.000 title abstract description 20
- 239000003888 alpha glucosidase inhibitor Substances 0.000 title abstract description 20
- 240000001548 Camellia japonica Species 0.000 title description 30
- 238000010262 high-speed countercurrent chromatography Methods 0.000 claims abstract description 45
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000209507 Camellia Species 0.000 claims abstract 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 101
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 24
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 21
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 19
- DOAOYJIOTYDTNV-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;ethyl acetate;hydrate Chemical compound O.CCCCO.CCOC(C)=O DOAOYJIOTYDTNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 11
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 11
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 11
- 102000011759 adducin Human genes 0.000 claims description 10
- 108010076723 adducin Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 10
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000007872 degassing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000837 restrainer Substances 0.000 claims 4
- QGBSISYHAICWAH-UHFFFAOYSA-N dicyandiamide Chemical compound NC(N)=NC#N QGBSISYHAICWAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 2
- MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O.CCCCO MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 claims 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 26
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 20
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 10
- 229940038481 bee pollen Drugs 0.000 abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 3
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 3
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 4-nitrophenyl alpha-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 0.000 description 2
- 101000623895 Bos taurus Mucin-15 Proteins 0.000 description 2
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C21 MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 235000009024 Ceanothus sanguineus Nutrition 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 206010023379 Ketoacidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- 240000003553 Leptospermum scoparium Species 0.000 description 1
- 235000015459 Lycium barbarum Nutrition 0.000 description 1
- IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N Miglitol Chemical compound OCCN1C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1CO IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- FZNCGRZWXLXZSZ-CIQUZCHMSA-N Voglibose Chemical compound OCC(CO)N[C@H]1C[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FZNCGRZWXLXZSZ-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 208000013527 cardiovascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960001110 miglitol Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960001729 voglibose Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从茶花粉中快速分离α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法，主要包括如下步骤：以茶花粉为原料，经提取、萃取、酸解处理后，采用高速逆流色谱制备分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥得3个组分，活性研究表明这3个组分均能高效抑制α‑葡萄糖苷酶活性。本发明方法生产周期短，样品用量少，分离操作简单，获得的α‑葡萄糖苷酶抑制剂活性高，确定了茶花蜂花粉降血糖的物质基础，为制备降血糖活性药物提供了适于推广的实用技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品分离纯化的技术领域，尤其涉及一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。
背景技术
随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，糖尿病患者的数量在世界范围内急剧增加，糖尿病已成为继心血管疾病、肿瘤之后的第三大疾病。糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌绝对或相对不足引起的以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，临床以高血糖为主要共同特征，久病会导致人体多器官损坏，病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。目前糖尿病基本无法治愈，主要控制血糖并使其接近正常值，有效减少糖尿病病人的并发症。
α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGI,α-glucosidase inhibitor)是20世纪70年代开始研究的一类新型的口服降血糖药物，可有效抑制小肠体内的α-葡萄糖苷酶活性，使摄取的多糖、寡糖和双糖消化变成葡萄糖、果糖等单糖的过程受阻，从而降低餐后高血糖，是一种有广阔应用前景的治疗糖尿病的药物。目前，用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂有三种：阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)和米格列醇(Miglitol)；但它们都存在胃肠道的副作用，因此，更安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂越来越为人们所重视。
茶花粉是指蜜蜂从茶树花药内采集的花粉球，它含有丰富的不饱和脂肪酸、黄酮、多酚、多糖等活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等功能，尽管目前国内外有关蜂花粉的生物活性研究已经取得了长足的进步，但蜂花粉抑制α-葡萄糖苷酶活性方面的研究还不够深入。在《蜂花粉成分分析、功能物质提取和体外活性研究》，浙江大学，博士学位论文中，杨开研究了不同蜂花粉粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；在《油菜蜂花粉黄酮抗糖尿病及其并发症的研究》，中国论文科技，2015年第6期中及在《油菜蜂花粉黄酮体外降糖活性研究》，食品工业科技，2015年第12期中，孙岩等用大孔树脂分离了油菜蜂花粉中黄酮并测定了分离组分抑制α-葡萄糖苷酶的活性，但运用高速逆流色谱仪(HSCCC)从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究还未见报道。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，以茶花粉为原料，经提取、萃取、酸解处理后，采用高速逆流色谱(HSCCC，high-speedcounter-current chromatography)制备分离，收集组分，以获得活性高的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
步骤一、提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
步骤三、酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:3～3:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积0.5～4mol/L的盐酸，于80～100℃水浴中酸水解15～90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
步骤四、HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为：2:(0.8～1.4):(2.6～3.2)，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速750～900rpm，同时流动相以5～8ml/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为乙酸乙酯酸解物，用10mL等体积上下相溶解(上下相各5ml)，同时通过紫外检测器检测流出物，收集各峰组分并减压干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
作为实施例的优选方式，所述步骤三中，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为2:1:3，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC。
采用本发明的技术方案后，具有以下有益效果：
1.本发明中HSCCC可以快速有效地制备茶花粉中的α-葡萄糖苷酶抑制剂，工艺简单，操作方便；
2.本发明分离组分抑制活性强。本发明分离得到的3个组分对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.51mg/mL、0.61mg/mL、0.35mg/mL，均低于阳性照阿卡波糖的0.66mg/mL。
附图说明
图1为高速逆流色谱分离纯化茶花粉α-葡萄糖苷酶抑制剂的色谱图，收集图中峰I、峰II、峰III对应的流出物并浓缩干燥后既得组分I、组分II、组分III。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式以对本发明作进一步说明。
α-葡萄糖苷酶活性的具体测试如下：从茶花粉中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂溶解于蒸馏水中，取8μl上述溶液，加入pH 6.8，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液112μL，20μL 0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃水浴10min，再加入2.5mM对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)20μL于37℃反应10min，加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应，在405nm下测定吸光值。
α-葡萄糖苷酶抑制率计算如下：
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/[a-b]×100
a：未加提取物而加酶的混合液所测的吸光度；
b：未加提取物也未加酶的混合液所测的吸光度；
c：加提取物和酶的混合液所测的吸光度；
d：加提取物而未加酶的混合液所测的吸光度。
半抑制浓度(IC50)即为对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到50％时所需的样品浓度。
实施例1
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:3(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积0.5mol/L的盐酸，于85℃水浴中酸水解30min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:0.8:3.2)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以20mL/min流速泵入高速逆流色谱(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速750rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，如图1所示，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.53mg/mL、0.62mg/mL、0.37mg/mL。
实施例2
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:2(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积1mol/L的盐酸，于90℃水浴中酸水解40min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:0.8:3.2)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以25mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.57mg/mL、0.61mg/mL、0.36mg/mL。
实施例3
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积1.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解50min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速850rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.53mg/mL、0.62mg/mL、0.37mg/mL。
实施例4
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比2:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积2mol/L的盐酸，于100℃水浴中酸水解60min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.2:2.8)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速900rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.49mg/mL、0.60mg/mL、0.40mg/mL。
实施例5
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比3:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积2.5mol/L的盐酸，于100℃水浴中酸水解70min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.4:2.6)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速900rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.51mg/mL、0.63mg/mL、0.36mg/mL。
实施例6
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:2(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解80min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3)溶剂体系，充分摇匀静置25min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以25mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速850rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.55mg/mL、0.69mg/mL、0.30mg/mL。
实施例7
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.51mg/mL、0.53mg/mL、0.40mg/mL。
实施例8
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:2(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积4mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解60min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.2:2.8)溶剂体系，充分摇匀静置20min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以20mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速850rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.46mg/mL、0.59mg/mL、0.32mg/mL。
将上述8个实施例的α-葡萄糖苷酶抑制剂进行α-葡萄糖苷酶抑制效果验证：
分离组分及阳性对照对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为50％时的化合物的浓度(IC50)见表1(表中组分I、组分II和组分III的IC50值均为8个实施例测得的平均值)，由表可得，应用本发明技术制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用，可以应用于降血糖药物和保健品开发等领域。
表1茶花粉分离组分及阳性对照对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
本发明方法生产周期短，样品用量少，分离操作简单，获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂活性高，确定了茶花蜂花粉降血糖的物质基础，为制备降血糖活性药物提供适于推广的实用技术。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
步骤三、酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:3～3:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积0.5～4mol/L的盐酸，于80～100℃水浴中酸水解15～90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
步骤四、HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为：2:(0.8～1.4):(2.6～3.2)，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速750～900rpm，同时流动相以5～8ml/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为乙酸乙酯酸解物，用10mL等体积上下相溶解，同时通过紫外检测器检测流出物，收集各峰组分并减压干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤三中，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
3.如权利要求1或2所述的一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤四中，配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为2:1:3，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510552232.2A CN104998263B (zh) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | 一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510552232.2A CN104998263B (zh) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | 一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104998263A CN104998263A (zh) | 2015-10-28 |
| CN104998263B true CN104998263B (zh) | 2017-11-03 |
Family
ID=54371296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510552232.2A Active CN104998263B (zh) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | 一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104998263B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109288844A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-02-01 | 集美大学 | 咖啡因作为酪氨酸酶抑制剂的用途 |
| CN109111444B (zh) * | 2018-09-13 | 2021-06-15 | 集美大学 | 一种从茶花粉中分离纯化咖啡因的方法 |
| CN109223798A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-18 | 集美大学 | 咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途 |
| CN112480196A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-03-12 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 一种茶花蜂花粉中降血糖成分及其提取方法与应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101177422A (zh) * | 2007-12-07 | 2008-05-14 | 西南大学 | 从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法 |
| CN101525357A (zh) * | 2008-03-07 | 2009-09-09 | 首都医科大学 | 一种从中药中分离制备五没食子酰基葡萄糖的方法 |
| CN102268052A (zh) * | 2011-08-09 | 2011-12-07 | 南京泽朗医药科技有限公司 | 一种山茶苷a的制备方法 |
| CN104027478A (zh) * | 2013-03-06 | 2014-09-10 | 广西医科大学 | 金花茶叶活性部位，其制备方法及其用途 |
| CN104861019A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-08-26 | 湖南农业大学 | 高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法 |
-
2015
- 2015-09-02 CN CN201510552232.2A patent/CN104998263B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101177422A (zh) * | 2007-12-07 | 2008-05-14 | 西南大学 | 从茶叶中制备甲基化儿茶素的工艺方法 |
| CN101525357A (zh) * | 2008-03-07 | 2009-09-09 | 首都医科大学 | 一种从中药中分离制备五没食子酰基葡萄糖的方法 |
| CN102268052A (zh) * | 2011-08-09 | 2011-12-07 | 南京泽朗医药科技有限公司 | 一种山茶苷a的制备方法 |
| CN104027478A (zh) * | 2013-03-06 | 2014-09-10 | 广西医科大学 | 金花茶叶活性部位，其制备方法及其用途 |
| CN104861019A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-08-26 | 湖南农业大学 | 高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104998263A (zh) | 2015-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104998263B (zh) | 一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 | |
| CN102846784B (zh) | 鸡矢藤水提取物、其制备方法和用途 | |
| CN101585885A (zh) | 一种玉竹多糖的制备方法 | |
| CN108659068A (zh) | 一种矢车菊素-3-o-芸香糖苷的分离纯化方法及其应用 | |
| CN102964460A (zh) | 从桑叶中连续提取分离多糖及 1-脱氧野尻霉素的方法 | |
| CN108409805B (zh) | 一种飞燕草素-3-o-半乳糖苷的分离纯化方法及其应用 | |
| CN113968916B (zh) | 一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的提取方法及其应用 | |
| CN107522761A (zh) | 一种分离纯化飞燕草素‑3‑o桑布双糖苷的方法及其降糖用途 | |
| CN109232757B (zh) | 核桃叶多糖提取物及应用 | |
| CN107281258A (zh) | 一种豆芋叶黄酮类提取物及其制备方法和应用 | |
| CN103641807B (zh) | 一种芹菜素的提取方法、用于治疗糖尿病的药物组合物及其应用 | |
| CN101224246B (zh) | 一种枇杷叶总三萜酸的制备方法及其降血糖功能 | |
| CN109010456A (zh) | 一种从覆盆子中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 | |
| CN102309542A (zh) | 用于慢性肾炎的肾茶正丁醇部位药及其制备方法 | |
| CN104710484A (zh) | 一种天麻素的提取及分离方法 | |
| CN108822168B (zh) | 一种锦葵素-3-o-半乳糖苷的分离纯化方法及其应用 | |
| CN107184621A (zh) | 一种辣木叶有效成分的提取方法及其应用 | |
| CN108864224B (zh) | 一种锦葵素-3-o-阿拉伯糖苷的分离纯化方法及其应用 | |
| CN101638404B (zh) | 高纯度丹酚酸b、制备方法及应用 | |
| CN107163157A (zh) | 五味子酸性多糖及其制备方法和应用 | |
| CN111494475A (zh) | 一种制备赤芍提取物的方法 | |
| CN105030914A (zh) | 粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用 | |
| CN108079025A (zh) | 裙带菜提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用 | |
| CN102670698B (zh) | 千斤拔提取物在制备防治糖尿病药物中的应用 | |
| CN113398166A (zh) | 一种桑叶降血糖活性物质的提取工艺及降血糖保健品 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |