CN104998263B - 一种从茶花粉中快速分离 α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从茶花粉中快速分离α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法，主要包括如下步骤：以茶花粉为原料，经提取、萃取、酸解处理后，采用高速逆流色谱制备分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥得3个组分，活性研究表明这3个组分均能高效抑制α‑葡萄糖苷酶活性。本发明方法生产周期短，样品用量少，分离操作简单，获得的α‑葡萄糖苷酶抑制剂活性高，确定了茶花蜂花粉降血糖的物质基础，为制备降血糖活性药物提供了适于推广的实用技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品分离纯化的技术领域，尤其涉及一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。
背景技术
随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，糖尿病患者的数量在世界范围内急剧增加，糖尿病已成为继心血管疾病、肿瘤之后的第三大疾病。糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌绝对或相对不足引起的以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，临床以高血糖为主要共同特征，久病会导致人体多器官损坏，病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。目前糖尿病基本无法治愈，主要控制血糖并使其接近正常值，有效减少糖尿病病人的并发症。
α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGI,α-glucosidase inhibitor)是20世纪70年代开始研究的一类新型的口服降血糖药物，可有效抑制小肠体内的α-葡萄糖苷酶活性，使摄取的多糖、寡糖和双糖消化变成葡萄糖、果糖等单糖的过程受阻，从而降低餐后高血糖，是一种有广阔应用前景的治疗糖尿病的药物。目前，用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂有三种：阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)和米格列醇(Miglitol)；但它们都存在胃肠道的副作用，因此，更安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂越来越为人们所重视。
茶花粉是指蜜蜂从茶树花药内采集的花粉球，它含有丰富的不饱和脂肪酸、黄酮、多酚、多糖等活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等功能，尽管目前国内外有关蜂花粉的生物活性研究已经取得了长足的进步，但蜂花粉抑制α-葡萄糖苷酶活性方面的研究还不够深入。在《蜂花粉成分分析、功能物质提取和体外活性研究》，浙江大学，博士学位论文中，杨开研究了不同蜂花粉粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；在《油菜蜂花粉黄酮抗糖尿病及其并发症的研究》，中国论文科技，2015年第6期中及在《油菜蜂花粉黄酮体外降糖活性研究》，食品工业科技，2015年第12期中，孙岩等用大孔树脂分离了油菜蜂花粉中黄酮并测定了分离组分抑制α-葡萄糖苷酶的活性，但运用高速逆流色谱仪(HSCCC)从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究还未见报道。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，以茶花粉为原料，经提取、萃取、酸解处理后，采用高速逆流色谱(HSCCC，high-speedcounter-current chromatography)制备分离，收集组分，以获得活性高的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
步骤一、提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
步骤三、酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:3～3:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积0.5～4mol/L的盐酸，于80～100℃水浴中酸水解15～90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
步骤四、HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为：2:(0.8～1.4):(2.6～3.2)，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速750～900rpm，同时流动相以5～8ml/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为乙酸乙酯酸解物，用10mL等体积上下相溶解(上下相各5ml)，同时通过紫外检测器检测流出物，收集各峰组分并减压干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
作为实施例的优选方式，所述步骤三中，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为2:1:3，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC。
采用本发明的技术方案后，具有以下有益效果：
1.本发明中HSCCC可以快速有效地制备茶花粉中的α-葡萄糖苷酶抑制剂，工艺简单，操作方便；
2.本发明分离组分抑制活性强。本发明分离得到的3个组分对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.51mg/mL、0.61mg/mL、0.35mg/mL，均低于阳性照阿卡波糖的0.66mg/mL。
附图说明
图1为高速逆流色谱分离纯化茶花粉α-葡萄糖苷酶抑制剂的色谱图，收集图中峰I、峰II、峰III对应的流出物并浓缩干燥后既得组分I、组分II、组分III。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式以对本发明作进一步说明。
α-葡萄糖苷酶活性的具体测试如下：从茶花粉中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂溶解于蒸馏水中，取8μl上述溶液，加入pH 6.8，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液112μL，20μL 0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃水浴10min，再加入2.5mM对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)20μL于37℃反应10min，加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应，在405nm下测定吸光值。
α-葡萄糖苷酶抑制率计算如下：
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/[a-b]×100
a：未加提取物而加酶的混合液所测的吸光度；
b：未加提取物也未加酶的混合液所测的吸光度；
c：加提取物和酶的混合液所测的吸光度；
d：加提取物而未加酶的混合液所测的吸光度。
半抑制浓度(IC50)即为对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到50％时所需的样品浓度。
实施例1
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:3(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积0.5mol/L的盐酸，于85℃水浴中酸水解30min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:0.8:3.2)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以20mL/min流速泵入高速逆流色谱(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速750rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，如图1所示，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.53mg/mL、0.62mg/mL、0.37mg/mL。
实施例2
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:2(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积1mol/L的盐酸，于90℃水浴中酸水解40min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:0.8:3.2)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以25mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.57mg/mL、0.61mg/mL、0.36mg/mL。
实施例3
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积1.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解50min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速850rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.53mg/mL、0.62mg/mL、0.37mg/mL。
实施例4
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比2:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积2mol/L的盐酸，于100℃水浴中酸水解60min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.2:2.8)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速900rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.49mg/mL、0.60mg/mL、0.40mg/mL。
实施例5
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比3:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积2.5mol/L的盐酸，于100℃水浴中酸水解70min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.4:2.6)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速900rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.51mg/mL、0.63mg/mL、0.36mg/mL。
实施例6
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:2(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解80min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3)溶剂体系，充分摇匀静置25min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以25mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速850rpm，同时流动相以6mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.55mg/mL、0.69mg/mL、0.30mg/mL。
实施例7
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3)溶剂体系，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.51mg/mL、0.53mg/mL、0.40mg/mL。
实施例8
(1)提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
(2)萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
(3)酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:2(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积4mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解60min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
(4)HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.2:2.8)溶剂体系，充分摇匀静置20min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以20mL/min流速泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)，稳定后，调节逆流色谱仪转速850rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后进样，同时通过紫外检测器检测流出物，按照HSCCC谱图收集各峰对应的成分并减压干燥，得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的3个组分，这3个组分抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为：0.46mg/mL、0.59mg/mL、0.32mg/mL。
将上述8个实施例的α-葡萄糖苷酶抑制剂进行α-葡萄糖苷酶抑制效果验证：
分离组分及阳性对照对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为50％时的化合物的浓度(IC50)见表1(表中组分I、组分II和组分III的IC50值均为8个实施例测得的平均值)，由表可得，应用本发明技术制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用，可以应用于降血糖药物和保健品开发等领域。
表1茶花粉分离组分及阳性对照对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
本发明方法生产周期短，样品用量少，分离操作简单，获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂活性高，确定了茶花蜂花粉降血糖的物质基础，为制备降血糖活性药物提供适于推广的实用技术。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、提取：取干燥粉碎的茶花粉，按料液比(W/V)1:8加入95％的乙醇，50℃水浴恒温提取8小时，过滤，滤渣重复处理3次，合并滤液并于45℃真空浓缩得茶花粉粗提物；
步骤二、萃取：粗提物按料液比(W/V)1:10加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；
步骤三、酸解：取适量乙酸乙酯萃取相，按料液比1:3～3:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积0.5～4mol/L的盐酸，于80～100℃水浴中酸水解15～90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
步骤四、HSCCC制备分离：配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为：2:(0.8～1.4):(2.6～3.2)，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30ml/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速750～900rpm，同时流动相以5～8ml/min流速泵入HSCCC，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为乙酸乙酯酸解物，用10mL等体积上下相溶解，同时通过紫外检测器检测流出物，收集各峰组分并减压干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤三中，按料液比1:1(mg:mL)的比例加入无水乙醇，而后再加入等体积3.5mol/L的盐酸，于95℃水浴中酸水解90min，将水解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干得乙酸乙酯酸解物；
3.如权利要求1或2所述的一种从茶花粉中快速分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤四中，配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，体积比为2:1:3，充分摇匀静置30min后，将上下相分开，超声脱气，下相为固定相，上相为流动相，反接正转，将固定相以30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节逆流色谱仪转速800rpm，同时流动相以5mL/min流速泵入HSCCC。
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2015
- 2015-09-02 CN CN201510552232.2A patent/CN104998263B/zh active Active
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