CN109223798A - 咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，所述用途是以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备醛糖还原酶抑制剂；用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的药物或保健食品。本发明在研究咖啡因的生物活性过程中，发现咖啡因对醛糖还原酶具有明显的抑制作用。糖尿病并发症与糖代谢的多元醇通路有关，醛糖还原酶是该通路的关键限速酶，由糖代谢的多元醇通路激活机制发现，醛糖还原酶抑制剂能有效抑制醛糖还原酶的活性，预防和延迟糖尿病并发症的发生和发展，通过抑制该酶活性可有效改善糖尿病并发症的特点，以发现有效的预防和/或治疗糖尿病并发症的天然药物。

Description

咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及咖啡因应用技术领域，具体涉及咖啡因在医疗领域的新用途。

背景技术

醛糖还原酶属于醛酮还原酶超家族，是烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)为辅酶催化醛类或酮类物质还原为相应的醇的单体多肽。普遍存在于神经、血红细胞、晶状体、视网膜等动物体组织器官中，是多元醇通路的关键限速酶。NADPH与氧化应激关系密切，在糖尿病并发症和多种氧化应激性疾病的发生发展中发挥重要作用。目前抑制醛糖还原酶的药物主要分天然药物提取物和化学合成药物两类。化学合成药物副作用大，限制了其临床使用，迫切需要开发新的安全有效的醛糖还原酶抑制剂。天然药物因其更易获得，副作用小，成本更低，越来越受到人们的青睐，成为人们预防和治疗糖尿病并发症的优先选择。因此将醛糖还原酶作为一个药物靶点，筛选具有抑制醛糖还原酶活性的天然药物成为研究热点。

咖啡因是一类黄嘌呤生物碱化合物。咖啡因具有预防阿尔茨海默病等神经疾病、扩张血管、保护肝损伤等生理功能，其已广泛用于食品、医药和化工等领域，尤其是可乐型及含咖啡因的能量型饮料行业。但关于咖啡因作为预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的开发还没有相关文献报道。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即提供咖啡因在医药领域的新用途，以充分发挥咖啡因在医药领域中的价值。

为此，本发明的一个目的在于提出咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途。

为达到上述目的，本发明第一方面实施例提出了咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，其以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备醛糖还原酶抑制剂。

根据本发明的咖啡因，在研究其生物活性过程中，发现咖啡因对醛糖还原酶具有明显的抑制作用，醛糖还原酶是多元醇通路的关键限速酶，而糖尿病并发症与糖代谢的多元醇通路有关,醛糖还原酶活性的增高是导致糖尿病慢性并发症的主要原因之一。通过抑制该酶活性可有效改善糖尿病并发症的特点，以发现有效的预防和/或治疗糖尿病并发症的天然药物。

另外，根据本发明上述实施例提出的咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明实施例，所述咖啡因对醛糖还原酶具有抑制作用。

根据本发明实施例，所述咖啡因是从茶花粉中分离纯化而制得的。

根据本发明实施例，所述咖啡因分离纯化包括以下步骤：

S1、提取：取茶花粉，加入乙醇，于水浴中浸提，共提取3次，抽滤，合并滤液，并减压浓缩成浸膏，得粗提物；

S2、萃取：粗提物加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；

S3、大孔吸附树脂层析：取乙酸乙酯相，加入蒸馏水复溶，振荡离心12min，取上清液加入大孔树脂中，大孔树脂置于摇床中吸附16h，将吸附后的大孔树脂装柱，使用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，收集各洗脱组分，获得大孔树脂乙醇洗脱相；

S4、酸解：取大孔树脂乙醇洗脱相，加入无水乙醇，而后再加入等体积4M的盐酸，于90℃水浴中酸水解90min，将酸解液减压蒸干，获得大孔树脂乙醇洗脱相酸解物；

S5、HSCCC制备分离：配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，体积比为4:6:4:6，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，将固定相按照一定的流速泵满色谱柱后，调节高速逆流色谱转速至850rpm，并将流动相按照一定的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后，将样品溶液从进样环注入高速逆流色谱管路，样品溶液为步骤S4获得的大孔树脂乙醇洗脱相酸解物，同时通过紫外检测器检测流出组分，紫外检测波长设置为280nm，根据峰形收集各组分；

S6、半制备型高效液相纯化：将步骤S5收集到的组分按顺序编号，以咖啡因标准品作为对照，进行高效液相色谱分析，选择与咖啡因标准品峰保留时间一致的样品作为研究对象进行半制备型高效液相纯化，其上样条件为：质量浓度为5mg/mL-20mg/mL，进样体积为10μL-200μL，根据峰形收集各组分，进行高效液相色谱分析，筛选出目标组分；

S7、结构鉴定：目标组分利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定目标组分为咖啡因；

S8、纯度测定：将S7中的目标组分利用高效液相色谱进行测定，按照峰面积归一法确定其纯度。

本发明第二方面实施例提出了咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，其以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的药物。

本发明第三方面实施例提出了咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，其以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的保健食品。

附图说明

图1是根据本发明实施例一HSCCC分离色谱图；

图2是根据本发明实施例一分离样品peak I-peak IV的高效液相色谱图；

图3是根据本发明实施例一咖啡因标准品的高效液相色谱图；

图4是根据本发明实施例一分离样品compound I的高效液相图；

图5是根据本发明实施例一分离样品compound I的核磁共振图；

图6是根据本发明实施例一咖啡因标准品的核磁共振图；

图7是根据本发明实施例一分离样品compound I的质谱图；

图8为根据本发明实施例的咖啡因对醛糖还原酶的抑制作用示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例和附图说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图1-8以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。

实施例一咖啡因的制备

本发明的咖啡因是从茶花粉中分离纯化而制得的，具体包括以下步骤：

S11、提取

准确称取1000g经高速万能粉碎机粉碎后，过筛(40目)后的茶花粉，按料液比1g:10 mL的比例添加80％乙醇，于80℃水浴条件下浸提6h，共提取3次，抽滤获得上清液，合并上清液，并于50℃下减压浓缩成浸膏，获得粗提物，4℃冷藏备用。

S12、萃取

将步骤S1获得的粗提物按料液比1g:10mL加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，获得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相。

S13、大孔吸附树脂层析

取步骤S2中的乙酸乙酯相，按料液比1g:10mL加入蒸馏水复溶，振荡，4000r/min离心12min，取上清液加入HP-20型大孔树脂，然后将大孔树脂置于37℃下150r/min的摇床中吸附16h，将吸附后的大孔树脂装柱，依次用浓度为0％、10％、30％的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，然后收集各洗脱组分，得大孔树脂30％乙醇洗脱相， 4℃冷藏备用。

S14、酸解

取步骤S3获得的大孔树脂30％乙醇洗脱相，按料液比0.1g:50mL的比例加入无水乙醇,而后再加入等体积4M的盐酸，于90℃水浴中酸水解90min，酸水解后，将酸解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干，获得大孔树脂30％乙醇洗脱相酸解物。

S15、HSCCC制备分离

配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，按照正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体积比为4:6:4:6的比例量取各溶剂于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气30min，以上相作为HSCCC的固定相，下相作为HSCCC的流动相；采用反向模式，即从头到尾进行洗脱，首先将上相溶液(固定相)以30mL/min的流速泵满色谱柱，调节高速逆流色谱转速至850rpm，并将下相溶液(流动相)以3mL/min的流速泵入色谱柱中；两相达到平衡后(主机螺旋管内流动相与固定相达到动力学平衡，即检测器端口有流动相被置换出时)，将样品溶液从进样环注入高速逆流色谱管路，样品溶液为大孔树脂30％乙醇洗脱相酸解物，同时通过紫外检测器检测流出组分，紫外检测波长设置为280 nm，根据峰形手动收集各组分，分离出四个组分，如图1所示。

S16、半制备型高效液相色谱纯化

将步骤S5收集到的四个组分按顺序编号Peak I、Peak II、Peak III、Peak IV。然后以咖啡因标准品作为对照，利用高效液相色谱对峰组分peak I、peak II、peak III、peakIV和咖啡因标准品进行分析，结果如图2和图3所示，通过对比分析，只有样品Peak II含有与咖啡因标准品保留时间一致的色谱峰，初步确定样品Peak II可能含有咖啡因；选择PeakII 作为研究对象用半制备型高效液相色谱纯化，其上样条件为：样品质量浓度为5mg/mL，进样体积200μL，根据峰形收集目标组分。

S17、结构鉴定

将S16收集得到的组分命名为compound I，再利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定收集的组分为咖啡因。

利用高效液相色谱对compound I进行分析，结果如图4所示，与图3中咖啡因标准品对比分析可知，compound I与咖啡因标准品的保留时间一致，初步确定样品compound I可能为咖啡因。

接着，分别对compound I与咖啡因标准品进行核磁共振分析，结果如图5和图6所示。图5中，compound I核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，CD₃OD，δ，ppm，J/Hz)：7.78(1H， s，C8-H)，3.87(3H，s，N7-CH₃)，3.41(3H，s，N3-CH₃)，3.23(3H，s，N1-CH₃)。图6中，咖啡因标准品的核磁数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD，δ，ppm，J/Hz)：7.87(1H， s，C8-H)，3.99(3H，s，N7-CH₃)，3.54(3H，s，N3-CH₃)，3.35(3H，s，N1-CH₃)。通过对比分析，可知咖啡因和样品compound I的核磁数据一致。因此确定样品compound I为咖啡因。

最后，对样品compound I进行质谱分析，结果如图7所示，从图中可以看到m/z 195[M-H]⁺的离子碎片，确定样品compound I的相对分子量为194。样品compound I与咖啡因的相对分子量一致，因此进一步确定样品compound I为咖啡因。

S18、纯度鉴定

将S17中的目标组分利用高效液相色谱进行测定，按照峰面积归一法确定其纯度。

使用高效液相色谱对compound I进行纯度分析，结果如图4所示，使用峰面积归一法测得compound I纯度为94.05％，即从茶花粉中纯化获得的咖啡因纯度为94.05％。

实施例二咖啡因对醛糖还原酶活性的抑制率的测定

S21、试剂的准备：

磷酸盐缓冲液(PBS)的配制：

准确称量3.31g Na₂HPO₄·12H₂O，加蒸馏水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得a液；另取6.36g NaH₂PO₄·2H₂O，加蒸馏水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得b液；接着，分别移取a、b两溶液至500mL容量瓶定容，使用pH计进行校准使磷酸盐缓冲液pH＝6.2。

醛糖还原酶液的配制：

取100U的醛糖还原酶加入1mL的PBS，即醛糖还原酶的酶活为100U/mL。取10μL 的100U/mL醛糖还原酶液，加入990μL的PBS，即醛糖还原酶浓度为10U/mL；取200μL 的10U/mL醛糖还原酶液，加入800μL的PBS，即醛糖还原酶浓度为2U/mL。醛糖还原酶液应现配现用。

辅酶NADPH的配置：

准确称量4.2mg NADPH，加入50mL的PBS，配成0.1mmol/L的NADPH溶液，于 -20℃条件下保存备用。

底物DL-甘油醛的配制：

准确称量1.8mg的DL-甘油醛，加入2mL的PBS，配成10mmol/L的DL-甘油醛溶液，于-4℃条件下避光保存备用。

S22、咖啡因对醛糖还原酶的抑制率的测定

用微量移液器分别按表1准确移取1、2、3、4四组样液，加入96孔板中，将96孔板置于37℃恒温10min后，各孔分别加入22μL的10mmol/L的底物DL-甘油醛，37℃下恒温反应5min后，于340nm下测定吸光度，测得吸光度1组为A1、2组为A2、3组为 A3、4组为A4值；其中，A1值：样液+酶的吸光值；A2值：样液+PBS的吸光值；A3值：溶剂+酶的吸光值；A4值：溶剂+PBS的吸光值。溶剂为甲醇，以槲皮素作为阳性对照，每组实验均测定三次平行。

然后按下面的公式计算抑制率：抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100％

表1各组分的加样量

按上述的方法测定实施例1获得的咖啡因样品对醛糖还原酶的抑制率，然后以样品浓度对醛糖还原酶酶的抑制率作图并进行拟合，得到样品的浓度效应曲线，读取计算IC₅₀值。醛糖还原酶抑制率50％所对应的样品浓度即为样品抑制醛糖还原酶的IC₅₀值。

通过测定，我们得到如图8所示的结果，纵坐标表示抑制率，横坐标表示咖啡因的质量浓度。从图8中可以看出，咖啡因对醛糖还原酶有一定的抑制作用，且随着咖啡因浓度的增大，抑制率也随之增大。阳性对照为槲皮素，是一种常见的醛糖还原酶抑制剂，其IC₅₀值为0.62μg/mL。当咖啡因浓度为20μg/mL时，它对醛糖还原酶的抑制率达到81％。通过回归曲线计算得咖啡因对醛糖还原酶的IC₅₀值为：16.20μg/mL。可见，咖啡因对醛糖还原酶有较好的抑制作用，可作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备醛糖还原酶抑制剂，用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的药物、保健食品；提供咖啡因在医药领域的新用途，以充分发挥咖啡因在医药领域中的价值；而本发明所述的测定方法能够准确的测出咖啡因对醛糖还原酶的抑制率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，其特征在于：以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备醛糖还原酶抑制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述咖啡因对醛糖还原酶具有抑制作用。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述咖啡因是从茶花粉中分离纯化而制得的。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：所述咖啡因分离纯化包括以下步骤：

S1、提取：取茶花粉，加入乙醇，于水浴中浸提，共提取3次，抽滤，合并滤液，并减压浓缩成浸膏，得粗提物；

S2、萃取：粗提物加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；

S3、大孔吸附树脂层析：取乙酸乙酯相，加入蒸馏水复溶，振荡离心12 min，取上清液加入大孔树脂中，大孔树脂置于摇床中吸附16 h，将吸附后的大孔树脂装柱，使用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，收集各洗脱组分，获得大孔树脂乙醇洗脱相；

S4、酸解：取大孔树脂乙醇洗脱相，加入无水乙醇，而后再加入等体积4 M的盐酸，于90°C水浴中酸水解90 min，将酸解液减压蒸干，获得大孔树脂乙醇洗脱相酸解物；

S5、HSCCC制备分离：配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，体积比为4:6:4:6，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，将固定相按照一定的流速泵满色谱柱后，调节高速逆流色谱转速至850 rpm，并将流动相按照一定的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后，将样品溶液从进样环注入高速逆流色谱管路，样品溶液为步骤S4获得的大孔树脂乙醇洗脱相酸解物，同时通过紫外检测器检测流出组分，紫外检测波长设置为280 nm，根据峰形收集各组分；

S6、半制备型高效液相纯化：将步骤S5收集到的组分按顺序编号，以咖啡因标准品作为对照，进行高效液相色谱分析，选择与咖啡因标准品峰保留时间一致的样品作为研究对象进行半制备型高效液相纯化，其上样条件为：质量浓度为5 mg/mL -20 mg/mL，进样体积为10 μL-200 μL，根据峰形收集各组分，进行高效液相色谱分析，筛选出目标组分；

S7、结构鉴定：目标组分利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定目标组分为咖啡因；

S8、纯度测定：将S7中的目标组分利用高效液相色谱进行测定，按照峰面积归一法确定其纯度。

5.咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，其特征在于：以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的药物。

6.咖啡因作为醛糖还原酶抑制剂的用途，其特征在于：以咖啡因作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的保健食品。