CN102964460A

CN102964460A - 从桑叶中连续提取分离多糖及 1-脱氧野尻霉素的方法

Info

Publication number: CN102964460A
Application number: CN2012104629795A
Authority: CN
Inventors: 李翠清; 王腾; 李继文; 张红
Original assignee: Beijing Institute of Petrochemical Technology
Current assignee: Beijing Institute of Petrochemical Technology
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明涉及从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法，该方法包括以下步骤：将桑叶粉碎，在一定条件下，进行超临界CO₂萃取，收集桑叶渣；桑叶渣干燥后，乙醇回流，提取；提取液浓缩，静置，沉淀干燥，即得含量为60％～80％的多糖类化合物；上清液浓缩，通过阳离子交换树脂，活性成分被吸附于树脂上；用含水醇和氨水洗脱树脂；氨水洗脱液浓缩，通过反相C18硅胶基层析柱洗脱液浓缩，干燥，即得桑叶生物碱，其中1-脱氧野尻霉素含量80-86％。详细方法见说明书。本发明的优点：工艺简单、提取率高且所得产品纯度更高，纯化所用树脂及硅胶均可再生，成本低，利于工业化推广和应用。

Description

从桑叶中连续提取分离多糖及 1-脱氧野尻霉素的方法

技术领域

本发明涉及从天然产物中提取有效活性成分及中药现代化领域，具体地说是一种从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素（化学名称：(2R,3R,4R,5S)- 3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢哌啶）的方法。

背景技术

桑叶，是桑科(Moraceae)植物桑 (Morus alba L.)的叶子，自古以来就是中医临床中常用的中药材，最早记载见于《神农本草经》，后在《本草拾遗》、《本草经疏》、《本草纲目》、《中草药手册》和《中药大辞典》中都有记录。近年来，现代药理学的研究也充分证明了桑叶具有降血糖、降血压、抗衰老及抑制癌细胞等作用。1993年我国卫生部公布桑叶为药食两用品，而在《中华人民共和国药典》2010年版中也收录桑叶主治风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花。

有关桑叶化学成分的研究结果表明，桑叶中含有多种有效成分，而其药理生理作用主要由其生物碱及多糖类化合物产生。桑叶中含有的生物碱类化合物主要为1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)，一种糖苷酶抑制剂，是桑叶独有的生物碱。药理研究证实，桑叶中的1-DNJ具有抑制双糖分解酶活性的作用从而抑制小肠对双糖的吸收，降低食后血糖的高峰值达到降血糖的效果。目前，1-DNJ及其衍生物已用于糖尿病人的治疗。桑叶中的多糖类化合物种类较多，是近年来在桑叶中发现的又一活性成分，具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等功能，可开发成一些老年性疾病的重要治疗药品和功能型食品。

目前，有关桑叶中有效成份或有效部位的分离已有一些相关专利。CN 101671294公开了一种将阳离子交换树脂和大孔树脂串联分离1-脱氧野尻霉素的方法，提取物中1-DNJ含量仅为10～15％；CN 100556892公开了一种采用酸化溶剂从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法，提取物含量低于15％；CN 101314586公开了一种从桑叶总生物碱中分离1-脱氧野尻霉素单体的方法，生物碱有效部位经反复重结晶可获得纯度高的1-脱氧野尻霉素单体，方法更注重于产品的纯化；CN 101712726公开了一种高纯度桑叶多糖的制备方法，含量在60％以上；CN 101412703公开了一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺，以大孔树脂及阳离子交换树脂纯化，所得的提取物多糖含量约60％，生物碱DNJ含量约50％。

上述专利获得的产品含量均较低，且多注重于一种有效成分或有效部位的分离或纯化过程。桑叶中具有降血糖作用的主要成份多糖及1-脱氧野尻霉素均为极性较大的化合物，其提取率与组分在提取液中的溶解状态及分散状态有关，溶解性和分散性越好提取率越高。而桑叶作为一种植物类天然产物，除极性较大的有效成分外，仍富含大量诸如叶绿素等在内的低极性脂溶性杂质。低极性脂溶性杂质的存在，一方面给多糖及1-脱氧野尻霉素的提取产生了影响，导致产品得率及纯度较低；另一方面低级性脂溶性杂质的残留也影响了最终产品的外观色泽等品质，导致产品品质降低。因此，在桑叶降血糖产品的分离和纯化过程中，对桑叶药材进行预处理以去除其中的低级性脂溶性杂质的过程必不可少。目前，在桑叶降血糖有效成分提取前，对桑叶进行预处理以去除脂溶性杂质而提高多糖及1-脱氧野尻霉素提取率的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，而提供一种从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法：该方法包括以下顺序的步骤：

a、将桑叶粉碎成粗粉置萃取釜中，在压力为10～40Mpa，萃取温度为30～60℃，萃取时间60～120分钟，CO₂流速为20～50L/h条件下，进行超临界CO₂萃取，卸压，CO₂放空后收集桑叶渣；

b、桑叶渣干燥后，以40～80％的乙醇加热回流提取，料液比1：10～15，60～100℃提取2次，合并提取液；

c、提取液浓缩至1/5～1/4，加入乙醇至乙醇比例为75％～95％，以95%为最优，加入乙醇至上述比例，静置，析出沉淀，干燥即得含量为60％～80％的多糖类化合物；

d、上清液浓缩，通过阳离子交换树脂，活性成分被吸附于树脂上；

e、用5％～30％的乙醇洗脱树脂至洗脱液无色，再以去离子水洗脱树脂至洗脱液无醇味，最后以浓度为0.1～1.0mol/L的氨水洗脱树脂；

f、氨水洗脱液浓缩，通过反相C18硅胶基层析柱，以含水乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得桑叶生物碱，其中1-脱氧野尻霉素含量80％～86％。

另知，加入乙醇浓度为95％。

所述的阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂或001×8型阳离子交换树脂。

所述的反相C18硅胶基层析柱采用YMC-ODS-AQ或YMC-ODS-AA硅胶填料。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.在一定条件下，采用超临界CO₂流体作为萃取剂脱除桑叶中的鞣质、油脂及色素等低级性脂溶性杂质，超临界CO₂流体对脂溶性杂质的溶出率较高，而多糖及1-脱氧野尻霉素由于极性较大仍存留于药渣中。利用这一方法可降低杂质在终产品中的残留，提高产品的纯度、色泽等品质，且超临界CO₂流体萃取技术高效、无污染、无萃取剂残留。

2.在除杂的过程中，超临界CO₂的穿透作用可增加桑叶植物细胞壁的脆性，通透性提高，增强多糖及1-脱氧野尻霉素的溶出性，从而提高提取率。

3.本发明所述的方法中除乙醇外未使用其它有机溶剂，纯化过程中所用的离子交换树脂及层析硅胶均可活化再生，生产成本低，工艺简单，工艺绿色、无毒且环保，适于工业化推广。

附图说明

图1为本发明从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面列举4个实施例,对本发明加以进一步说明，但本发明不仅限于这些实施例。

实施例1

将粉碎后的桑叶原料400g加入料筒并置萃取缸，开启超临界CO₂萃取装置，萃取温度40℃、萃取压力30Mpa下萃取80分钟，CO₂流速30L/h。萃取结束后，取出料筒，得桑叶渣，干燥后加入65％乙醇4L，料液比为1：10，于80℃下搅拌2h，过滤得滤液。滤渣加入65％乙醇4L重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液，浓缩至200mL。浓缩液加95%的乙醇1.8L，静置4h，离心分离，收集沉淀，低温干燥，得浅黄色粉末即为桑叶多糖，经苯酚-硫酸法测定桑叶多糖含量为71％。上清液浓缩约100mL，以1.0mL/min的流速流经装有经预处理的732阳离子交换树脂柱，径高比为1:8。以30%乙醇冲洗树脂直至透过液为无色，以去离子水冲洗树脂直至透过液无乙醇味，最后用0.25mol/L的氨水以1.5mL/min的流速洗脱树脂。收集氨水洗脱液，浓缩至约50mL吸附于YMC-ODS-AA型反相C18硅胶基层析柱，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得淡黄色固体，经高效液相色谱检测，1-脱氧野尻霉素含量为84％。

实施例2

将粉碎后的桑叶原料400g加入料筒并置萃取缸，开启超临界CO₂萃取装置，萃取温度50℃、萃取压力40Mpa下萃取100分钟，CO₂流速50L/h。萃取结束后，取出料筒，得桑叶渣，干燥后加入60％乙醇6L，于80℃下搅拌2h，过滤得滤液。滤渣加入60％乙醇6L重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液，浓缩至200mL。浓缩液加95%的乙醇1.5L，静置4h，离心分离，收集沉淀，低温干燥，得浅黄色粉末即为桑叶多糖，经苯酚-硫酸法测定桑叶多糖含量为69％。上清液浓缩约100mL，以1.0mL/min的流速流经装有经预处理的001×8阳离子交换树脂柱，径高比为1:8。以30%乙醇冲洗树脂直至透过液为无色，以去离子水冲洗树脂直至透过液无乙醇味，最后用0.5mol/L的氨水以1.5mL/min的流速洗脱树脂。收集氨水洗脱液，浓缩至约50mL吸附于YMC-ODS-AA型反相C18硅胶基层析柱，以45％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得淡黄色固体，经高效液相色谱检测，1-脱氧野尻霉素含量为82％。

实施例3

将粉碎后的桑叶原料400g加入料筒并置萃取缸，开启超临界CO₂萃取装置，萃取温度35℃、萃取压力40Mpa下萃取120分钟，CO₂流速40L/h。萃取结束后，取出料筒，得桑叶渣，干燥后加入75％乙醇5L，于80℃下搅拌2h，过滤得滤液。滤渣加入75％乙醇5L重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液，浓缩至200mL。浓缩液加95%的乙醇1.6L，静置4h，离心分离，收集沉淀，低温干燥，得浅黄色粉末即为桑叶多糖，经苯酚-硫酸法测定桑叶多糖含量为74％。上清液浓缩约100mL，以1.0mL/min的流速流经装有经预处理的732阳离子交换树脂柱，径高比为1:8。以20%乙醇冲洗树脂直至透过液为无色，以去离子水冲洗树脂直至透过液无乙醇味，最后用0.25mol/L的氨水以1.5mL/min的流速洗脱树脂。收集氨水洗脱液，浓缩至约50mL吸附于YMC-ODS-AQ型反相C18硅胶基层析柱，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得淡黄色固体，经高效液相色谱检测，1-脱氧野尻霉素含量为86％。

实施例4

将粉碎后的桑叶原料400g加入料筒并置萃取缸，开启超临界CO₂萃取装置，萃取温度55℃、萃取压力35Mpa下萃取90分钟，CO₂流速30L/h。萃取结束后，取出料筒，得桑叶渣，干燥后加入60％乙醇4.5L，于80℃下搅拌2h，过滤得滤液。滤渣加入60％乙醇4.5L重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液，浓缩至200mL。浓缩液加95%的乙醇1.8L，静置4h，离心分离，收集沉淀，低温干燥，得浅黄色粉末即为桑叶多糖，经苯酚-硫酸法测定桑叶多糖含量为72％。上清液浓缩约100mL，以1.0mL/min的流速流经装有经预处理的001×8阳离子交换树脂柱，径高比为1:8。以20%乙醇冲洗树脂直至透过液为无色，以去离子水冲洗树脂直至透过液无乙醇味，最后用0.5mol/L的氨水以1.5mL/min的流速洗脱树脂。收集氨水洗脱液，浓缩至约50mL吸附于YMC-ODS-AQ型反相C18硅胶基层析柱，以40％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得淡黄色固体，经高效液相色谱检测，1-脱氧野尻霉素含量为80％。

Claims

1.从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：该方法包括以下顺序的步骤：

c、提取液浓缩至1/5～1/4，加入乙醇至乙醇比例为75％～95％，加入乙醇至上述比例，静置，析出沉淀，干燥，即得含量为60％～80％的多糖类化合物；

2.根据权利要求1中所述的从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：加入乙醇浓度为95％。

3.根据权利要求1中所述的从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂或001×8型阳离子交换树脂。

4.根据权利要求1中所述的从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：洗脱树脂用氨水的浓度为0.25mol/L 。

5.根据权利要求1中所述的从桑叶中连续提取分离多糖及1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：反相C18硅胶基层析柱采用YMC-ODS-AQ或YMC-ODS-AA硅胶填料。