CN101869605B - 一种桑叶黄酮、生物碱复合物的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

一种桑叶黄酮、生物碱复合物的提取分离方法，是一种集酸水浸提-溶剂萃取-柱层析分离方法。用该方法对桑叶进行深加工，制备不同规格、较高纯度的桑叶黄酮、生物碱复合提取物。用酸化的去离子水浸提；乙酸乙酯萃取；桑叶黄酮采用大孔树脂D101吸附分离，洗脱液为70～90％乙醇溶液；桑叶生物碱采用罗姆哈斯FPC-21系列阳离子交换树脂进行分离，洗脱液为0.3～0.45mol/L氨水。可制得桑叶复合提取物中黄酮含量10～90％、生物碱含量5～50％。该提取分离工艺，方法简便、成本低、易于工业生产应用。

Description

一种桑叶黄酮、生物碱复合物的提取分离方法

一、技术领域

本发明涉及一种天然产物有效成分的提取分离方法，确切地说是一种桑叶黄酮与生物碱复合物的提取分离方法。

二、背景技术

桑叶，又名“铁扇子”，是桑科桑属植物桑Moruslba L.的叶子。桑叶商品野生、栽培均有。中国是桑树的故乡，也是世界上主要的桑叶产地之一。桑树分布于中国大部分地区，以南方养蚕区产量较大，如江苏、安徽、浙江，四川、湖南等省区。

中医将桑树叶称为“桑叶”，认为其药效极其广泛。有止咳、去热，治疗头昏眼花、消除眼部疲劳，消肿、清血，治愈痢疾、腹痛，补肝、美肤等功效。中华人民共和国药典(2005年版)中表明桑叶具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功能，用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花。而世界最早的药书《神农本草经》中已记载了桑叶的药用价值。现在，在中医治疗中，桑叶作为改善糖尿病及其它各种疑难杂症的药物而使用。

桑叶具有上述等功效，是因为其含有黄酮类、生物碱类、糖类，以及甾类、挥发油、氨基酸类、维生素和微量元素等有效成分，而黄酮类化合物和生物碱为主要功效成分，其中黄酮类化合物占桑叶干重的1-3％，具有降血脂、清除自由基、抗炎、抗癌等作用；生物碱中的脱氧野尻霉素(DNJ)的含量虽然只占桑叶干重的0.1％，但其降血糖功效非常显著。

考虑到桑叶黄酮和生物碱具有上述特殊功效，有必要进行分离纯化。而国内对桑叶黄酮和生物碱类化合物提取分离研究较多，大多研究主要总结为：桑叶黄酮提取分离主要采用水、乙醇等溶剂进行提取，获得浸膏，再采用大孔树脂吸附分离(例如，王俊，赵辉，吴福安，杨克迪.树脂吸附法分离纯化桑叶总黄酮，《离子交换与吸附》，2008，24(2)：139-147)；而桑叶中生物碱的提取分离主要采用溶剂提取、大孔树脂吸附除杂、阳离子交换树脂吸附分离(例如，刘韦鋆，赵骏，高秀梅，刘美平，曾森.1-脱氧野尻霉素提取精制工艺的研究，《中华中医药学刊》，2009，27(10)：2079-2081)。

经由国家知识产权局网站检索，截至2010年6月16日，与桑叶黄酮、生物碱的提取分离方法直接相关的授权发明专利或申请主要有：

(1)ZL200710027588.X(《一种桑叶提取物及其制备方法与应用》)：该发明公开了一种桑叶提取物及其制备方法与应用，所述桑叶提取物通过超声波处理、经水提与薄膜浓缩得到，含有多糖类(纯度12％以下)、黄酮及黄酮苷(纯度5％以下)、生物碱(纯度0.8％以上)、甾醇类、维生素类、氨基酸类等多种功能物质。

(2)CN101412703A(申请号200810236144.1，《一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺》)：该发明公开了一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺，其特征在于提取过程为：原料处理、水提取、大孔树脂吸附分离。本发明所用的大孔吸附树脂和氯仿经再生可重复使用，所得有效组分经济价值极高，提高了桑叶资源的药用利用率和经济附加值。

(3)CN101278977A(申请号200810027097.X，《一种桑叶主要活性成分的提取方法及其提取物用途》)：该发明公开了一种桑叶主要活性成分的提取方法，其特征在于只需要采用一种树脂，通过一次提取过程，可以将桑叶中三类主要活性成分生物碱、黄酮和多糖全部提取出来；采用提取溶剂为水、乙醇等极性溶剂，树脂为交换型树脂，但是产品的纯度等不清楚。

(4)CN101244124A(申请号200810059864.5，《一种桑叶活性部位的制备方法及应用》)：该发明提供了一种桑叶活性部位的制备方法，是将桑叶经醇提取、树脂吸附、依次用水、醇洗脱、收集醇洗脱液、浓缩、干燥而获得的活性部位提取物。本发明提供的桑叶活性部位，其总黄酮含量为50-70％，不含桑叶生物碱。

(5)CN101491579A(申请号200710098454.7，《一种从中药桑叶提取液中分离桑叶总生物碱的方法》)：该发明公开了一种分离中药总生物碱的方法，尤其是一种从中药桑叶提取液中分离总生物碱的方法，属中药领域。该方法包括如下技术方案：取桑叶提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加入阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％-15％酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，即得桑叶总碱。

三、发明内容

本发明内容旨在为开发中药新药或保健食品提供高质量的原料-桑叶黄酮、生物碱复合物，所要解决的技术问题是桑叶黄酮和生物碱的提取与分离。

本发明的技术方案是以桑叶为原料，包括粉碎、提取、分离、浓缩、萃取和纯化，其特征是将粉碎过80～100目筛的桑叶用pH2～4的水于25～40℃搅拌提取(动态提取)至少两次，分离后合并提取液，浓缩至原体积的1/2～1/3，用乙酸乙酯萃取至少两次，分离后合并萃取液，同时合并萃取余液；萃取液脱溶后用D101大孔吸附树脂柱分离纯化，，先去离子水洗脱，后用浓度70～90％(质量百分浓度，下同)乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，脱溶干燥后得到纯度60～90％桑叶黄酮提取物；萃余液用碳酸氢钠溶液调pH6.5～7.5，脱溶后用阳离子交换树脂柱分离纯化，先去离子水洗脱，后用0.3～0.45mol/L氨水洗脱，收集氨水洗脱液，脱溶干燥后得到纯度20～50％的桑叶生物碱提取物。

所述的阳离子交换树脂选自罗姆哈斯PPC-21系列阳离子交换树脂(为美国FDA认可的类型)。

将桑叶黄酮和桑叶生物碱根据需要进行复配，即可得到黄酮含量10～90％、生物碱含量5～50％桑叶复合提取物。

具体操作步骤是：

(1)首先将桑叶通过粉碎机进行破碎，过80～100目筛子，溶于5-15倍体积的25～40℃、pH为2～4的酸水中，动态搅拌，转速60r/min，时间120min左右，提取至少2次；

(2)将提取液合并，真空浓缩至原体积的1/2～1/3，再添加3-5倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取至少2次，合并萃取液，浓缩成粉末，再用2倍体积离子水溶解，用于上柱；

(3)进行大孔树脂吸附分离，分离介质选自大孔树脂D101等，流动相选择水、乙醇水，分别进行洗脱，收集70～90％乙醇洗脱液；脱溶后，紫外光谱检测，提取物中桑叶黄酮含量60～90％；

(4)将(2)中萃余液合并，用碳酸氢钠溶液调pH至中性，进一步真空浓缩后用于上柱；

(5)进行阳离子交换树脂分离，分离介质选自罗姆哈斯FPC-21系列阳离子交换树脂等，流动相选择水、0.3～0.45mol/L氨水，分别进行洗脱，收集0.3～0.45mol/L氨水洗脱液；脱溶后，高效液相色谱检测，提取物中桑叶生物碱含量20～50％；

(6)对(3)或(5)收集的目标物质溶液按照比例混合，浓缩、干燥，可制得桑叶黄酮纯度10～90％、生物碱5～50％的高纯桑叶复合提取物。或者将两提取物混合得到复合提取物。

本发明提供了一种集成廉价酸水浸提一溶剂萃取-柱层析分离纯化的方法，制备桑叶黄酮纯度10～90％、生物碱5～50％的高纯桑叶复合提取物。酸水可实现桑叶黄酮与生物碱的同步高效提取；流动相采用水、乙醇、氨水等溶剂，绿色、环保。

四、具体实施方式

实施例1：

①称取10kg桑叶，通过粉碎机进行破碎，过100目筛子，溶于15倍体积的30℃、pH＝3的水中，动态搅拌，转速60r/min，时间120min左右，提取2次；

②将提取液合并，真空浓缩至原体积的1/2，再添加4倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取2次，合并萃取液，浓缩至干，再用2倍体积去离子水溶解，用于上柱；

③柱层析分离，分离介质为大孔树脂D101，先用2倍柱体积去离子水洗脱，再用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；

④将②中萃余液合并，用碳酸氢钠溶液调pH至中性，进一步真空浓缩后用于上柱；

⑤进行阳离子交换树脂分离，分离介质为罗姆哈斯FPC-21系列阳离子交换树脂，先用3倍柱体积去离子水洗脱，再用0.35mol/L氨水，收集氨水洗脱液；

⑥对③、⑤收集的目标物质溶液按照比例混合，浓缩、干燥，可制得桑叶黄酮纯度10～90％、生物碱5～50％的高纯桑叶复合提取物。

实施例2：

①称取10kg桑叶，通过粉碎机进行破碎，过80目筛子，溶于10倍体积的35℃、pH＝4的水中，动态搅拌，转速60r/min，时间120min左右，提取3次；

②将提取液合并，真空浓缩至原体积的1/3，再添加4倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取2次，合并萃取液，浓缩至干，再用2倍体积去离子水溶解，用于上柱；

③柱层析分离，分离介质为大孔树脂D101，先用2倍柱体积去离子水洗脱，再用85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；

④将②中萃余液合并，用碳酸氢钠溶液调pH至中性，进一步真空浓缩后用于上柱；

⑤进行阳离子交换树脂分离，分离介质为罗姆哈斯FPC-21系列阳离子交换树脂，先用3倍柱体积去离子水洗脱，再用0.4mol/L氨水，收集氨水洗脱液；

⑥对③、⑤收集的目标物质溶液按照比例混合，浓缩、干燥，可制得桑叶黄酮纯度10～90％、生物碱5～50％的高纯桑叶复合提取物。

Claims (1)

1.一种桑叶黄酮、生物碱复合物的提取分离方法，以桑叶为起始原料，包括粉碎、提取、分离、萃取、浓缩和纯化，其特征在于：所述的提取是将粉碎过80～100目筛的桑叶采用pH2～4的水于25～40℃进行动态提取至少两次；提取液浓缩至原体积的1/2～1/3后用乙酸乙酯萃取至少两次，萃取液脱溶后用大孔吸附树脂D101柱层析分离，洗脱液为浓度70-90％乙醇溶液，收集乙醇洗脱液，得桑叶黄酮溶液，脱溶干燥后得到纯度60～90％桑叶黄酮提取物；上述萃余液用碳酸氢钠溶液调pH6.5～7.5，用罗姆哈斯FPC-21系列阳离子交换树脂柱进行分离，洗脱液为浓度0.3～0.45mol/L氨水，收集氨水洗脱液，得桑叶生物碱溶液；脱溶干燥后得到纯度20～50％桑叶生物碱提取物。