CN109232757B - 核桃叶多糖提取物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核桃叶多糖提取物及其在制备降糖药物中的应用。本发明通过对提取方法的优化，获得了一种核桃叶多糖，降糖活性的研究表明本发明所述核桃叶多糖提取物具有良好的降糖作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种核桃叶多糖提取物及在制备降糖药物中的应用。
技术背景
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢病，分为I型糖尿病和II型糖尿病，其中90％以上为II型糖尿病。随着我国社会的进步、经济的发展、人们工作生活方式的改变，我糖尿病的发病率逐年提高，目前全国有糖尿病患者9000多万，还有超过1.4亿的糖尿病前期患者，严重影响患者的生活质量，同时糖尿病还会引发心脏、肾、神经等多器官组织的并发症，危及患者生命。II型糖尿病的治疗困难较大，往往需要长期用药，目前西药和中药两种治疗手段，西药治疗虽然起效快，但副作用大，效果不理想。中药虽然起效慢，但由于是多种成分的组合，往往几种成分的作用机制不同，存在协同增效作用，从宏观、系统的层面上治疗，往往能取得良好的治疗效果。
核桃有疏通经络、补血养气、润燥化痰、健脑明目等功效，是人们常食的坚果。常见的核桃属于胡桃科胡桃属或山核桃属，这些植物全身都是宝，除果仁可食用外，其叶、枝、皮、青皮、壳、花均可人药，具有重要的经济和药用价值。目前对这些植物的化学成分和活性成分的研究多集中在果实、青皮和枝皮上而对叶的化学成分和活性成分报道较少见。《核桃属植物叶的化学成分及生物活性研究进展》(西北林学院学报，2010，25(4):165～169)中公开了核桃叶中含有脂肪醇、醌类、多种萜类、长链的烷烃类化合物、脂肪酸类化合、黄酮类、酚类(包括有机酚酸)、鞣质类物质以及挥发油等成分。这些成分具有抗肿瘤、抗氧化清除氧自由基作用、止痛、消炎活性，此外对农作物还具有抑制生长繁殖、杀虫、抗植物病毒的作用。《山核桃叶总黄酮苷元降血糖作用研究》(中华中医药学刊，第35卷第8期，2017年8月)对山核桃叶总黄酮苷元的活性进行了研究，结果显示山核桃叶总黄酮苷元对四氧嘧啶诱导的高血糖动物有明显的降低血糖及血清果糖胺和增加小鼠体质量的作用，但对正常动物血糖和体质量基本无影响。目前尚无对核桃叶多糖类物质的详细研究。
发明内容
本发明首次对核桃叶多糖类物质进行了深入研究，从核桃叶中提取得到具有降糖作用的多糖活性成分，比现有技术报道的核桃叶总黄酮苷元具有更好的降糖活性，能显著降低II型糖尿病小鼠模型的血糖，本发明对更好的利用核桃叶资源，开发新型治疗II型糖尿病的产品具有重要的意义。
本发明的技术方案如下：
一种核桃叶多糖提取物，采用如下方法制备而成：
(1)对核桃叶粉碎后使用有机溶剂浸提脱色，得到的滤渣进行细胞壁破壁处理；
(2)将破壁后的滤渣使用溶剂提取，得到粗提液；
(3)将粗体液依次经过脱脂、除蛋白、醇沉的步骤，得到核桃叶多糖提取物。
上述步骤(1)中核桃叶干燥后粉碎过20目筛，或经超微细破壁技术制成超微粉，如双螺杆挤压膨化技术。
上述步骤(1)所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷中的一种或几种。优选使用乙醇浸提脱色。
上述步骤(1)可采用双螺杆挤压膨化破壁、低温冷冻破壁、超声波破壁等方法中的一种或几种的组合对滤渣进行细胞壁破壁处理。步骤(1)优选超微细破壁技术与超声波结合的破壁方法。
上述步骤(2)所述溶剂选自水、0.1-10％的稀酸溶液、0.1-10％的稀碱溶液中的一种或几种，酸选自盐酸、硫酸、磷酸、醋酸中的一种或几种，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氨水中的一种或几种。优选水做溶剂。
上述步骤(2)优选在40-90℃进行提取。更优选65-80℃。
上述步骤(3)可依次使用石油醚脱脂、savage法除蛋白、乙醇沉淀的步骤，优选醇沉使用浓度在70-90％的乙醇。
一个具体的操作为：
(1)样品破壁预处理：核桃干叶在46℃下干燥5h，粉碎，过20目筛，或经双螺杆挤压膨化技术制成超微粉，用乙醇浸提脱色，每克核桃叶粉加乙醇25mL，抽滤，脱色两次，滤渣用每克原料25mL水在40℃浸泡4h，然后采用低温冷冻破壁、超声波破壁等方法中的一种或几种的组合进行细胞壁破壁处理；
(2)溶剂提取：样品升温至40-90℃，并在该温度下搅拌10h，过滤，滤渣在40-90℃继续提取2次，合并滤液，减压蒸去水至与原料质量(克)等数值的体积(mL)，得核桃叶水粗提液(Ⅰ)；
(3)核桃叶多糖提取：向核桃叶水粗提液(Ⅰ)中加入等体积的石油醚脱脂，再加入1/5体积的savage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)除去蛋白，水层在2000r/min下离心5min，除去不溶物，上清加无水乙醇，调节乙醇浓度为60-95％，静置12h，抽滤得核桃叶多糖(Ⅱ)。
上述方法大大提高了核桃叶多糖的提取率，最高可达8.73％，制得的多糖含量高达85％。本发明的另一目的在于提供上述核桃叶多糖提取物在制备降糖药物中的应用以及含有本发明所述的核桃叶多糖提取物的降糖药物。
将本发明所述核桃叶多糖溶于一定量的蒸馏水中，以糖尿病模型小鼠为实验动物，以上述提取物喂养小鼠2周，以等量蒸馏水喂养的小鼠作为对照组，测定对照组和药物组小鼠的血糖值。优选的，核桃叶多糖的剂量为5-200mg·kg-1·d-1，更优选的剂量为10mg·kg-1·d-1，降糖率可以达到97％。
本发明优点：
(1)本发明以核桃叶为原料，通过进行细胞破壁处理，采用适于工业化的提取工艺，得到核桃叶多糖；
(2)本发明制得的核桃叶多糖具有良好的降糖作用，与核桃叶原叶、核桃叶总黄酮苷元比，降糖作用大大提高，在剂量低至10mg·kg-1·d-1的情况下，降糖率仍可达到97％，而核桃叶原叶在该剂量下不表现任何可测定降糖作用，核桃叶总黄酮苷元只有6％左右的降糖率；
(3)本发明为糖尿病的治疗提供了一种新的药剂原料。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本发明以核桃叶多糖的提取和活性评价为例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1:核桃叶多糖提取物的制备
将100克核桃干叶在46℃下干燥3h，粉碎，过20目筛，或粉碎后再经双螺杆挤压膨化技术制成超微粉，然后用每次用2500mL乙醇浸泡脱色2次，浸泡温度30℃，浸泡时间3h，抽滤，得脱色后的核桃叶粉，加2500mL水，在40℃浸泡4h，然后采用低温冷冻破壁、超声波破壁等方法中的一种或几种的组合进行细胞壁破壁处理；处理完毕，样品升温至40-90℃，并在该温度下搅拌10h，过滤，滤渣在相同条件下继续提取2次，合并滤液，减压浓缩至100mL，得核桃叶水粗提液(Ⅰ)，然后向(Ⅰ)中加入100mL石油醚脱脂，脱脂后再加入20mL的savage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)除去蛋白，水层在2 000r/min下离心5min，除去不溶物，上清加无水乙醇，调节乙醇浓度至特定值，静置12h，抽滤得核桃叶多糖(Ⅱ)。按照下表的条件分别选取不同的破壁方法、提取温度、醇沉时的乙醇浓度，探索多糖提取的条件，计算提取率，得相应的核桃叶多糖(Ⅱ)，研究结果见表1，提取率按下式计算：
表1不同提取条件下核桃叶多糖的提取率。
从表中可以看出：
(1)普通粉碎，不利于细胞壁破壁，即使与超声波和低温冷冻破壁技术结合起来，核桃叶多糖的提取率也普遍较低，最好也只能达到1.12％的提取率；
(2)超微细技术有利于细胞壁破壁，当与超声波和低温冷冻破壁技术结合起来后，核桃叶多糖的提取率显著提高，最高可达到7.39％的提取率；
(3)超微细破壁技术与超声波结合、或与低温冷冻结合、或三者结合都可以得到较高的提取率，但从生产效率的角度来看，超微细破壁技术与超声波结合的破壁方法最好，操作简单，利于降低能耗和提高生产效率；
(4)最合适的提取温度在65-80℃间，最合适的醇沉最终乙醇浓度在80％左右。
因此，在上述研究的基础上，对核桃叶多糖的提取工艺条件进行了进一步的优化，采用超微细破壁技术与超声波结合的方法，提取温度在65-80℃间进行优化，醇沉最终乙醇浓度在70-90％间进行优化，得到如下最佳提取条件：
将100克核桃干叶在46℃下干燥3h，粉碎，双螺杆挤压膨化制成超微粉，然后用每次用2500mL乙醇浸泡脱色2次，浸泡温度30℃，浸泡时间3h，抽滤，得脱色后的核桃叶粉，加2500mL水，在40℃下超声波处理4h，样品升温至72℃，并在该温度下搅拌10h，过滤，滤渣在相同条件下继续提取2次，合并滤液，减压浓缩至100mL，加入100mL石油醚脱脂，脱脂后再加入20mL的savage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)除去蛋白，水层在2 000r/min下离心5min，除去不溶物，上清加无水乙醇，调节乙醇浓度至78％，静置12h，抽滤得核桃叶多糖(Ⅱ)，提取率可达8.73％。
实施例2多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量：取D-无水葡萄糖，加水溶解配置浓度为0.1mg/mL的溶液，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL的葡萄糖于试管中，用水补至2mL，分别加入1mL、6％的苯酚和5mL浓硫酸混匀后冷却至室温，以相应的试剂为空白，489nm处测定其吸光度。葡萄糖的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖的标准曲线。准确称取核桃叶多糖配成特定浓度的溶液，按上法的定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算其浓度，含量可达85％。
实施例3：提取物降糖活性测定
以昆明种小鼠为实验动物，用注射四氧嘧啶溶液造小鼠，将糖尿病小鼠随机分为糖尿病模型对照组、给药组，给药组分高、中、低三个剂量组，每组大约12只，另取同批次的12只未造模小鼠作为正常对照组，给药组分为核桃叶多糖(Ⅱ)，核桃叶粉末和核桃叶总黄酮苷元(按文献《山核桃叶总黄酮苷元降血糖作用研究》(中华中医药学刊，第35卷第8期，2017年8月)方法提取)。高、中和低剂量组分别按提取物200、100、50mg·kg-1·d-1的剂量给药(核桃叶粉剂量增加两个高剂量，见表2)，用时配成等体积不同浓度水溶液或混悬液(每10g小鼠灌胃0.1mL)，每天上午空腹给药1次，连续灌胃15天，模型对照组和正常对照组给等量生理盐水，采用尾静脉取血法采样，采样前禁食不禁水12h。采用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法测定血糖，按照血糖试剂盒中说明书操作，溶液显色后，在505nm处测量吸光度，根据标准曲线计算血糖值，按下述公式计算被测物的降糖率：
核桃叶多糖及其对照物的降糖效果如表2所示。
表2提取物的降糖率与组合物的协同增效作用。
注：上述提取物均为最佳提取条件下的提取物。
从表2可以看出，将核桃叶多糖的降糖效果远远高于核桃叶原粉和核桃叶总黄酮苷元降糖效果，核桃叶中主要的降糖活性成分是其中所含的多糖成分，当剂量低至50mg·kg-1·d-1时，降糖率仍为100％，为此，对剂量在50mg·kg-1·d-1和5mg·kg-1·d-1之间进行优化，优化的结果：核桃叶多糖的剂量为10mg·kg-1·d-1时，降糖率可以达到97％。
Claims (7)
1.核桃叶多糖提取物在制备降糖药物中的应用，其特征在于所述核桃叶多糖提取物采用如下方法制备而成：
（1）对核桃叶粉碎后使用有机溶剂浸提脱色，得到的滤渣进行细胞壁破壁处理；
（2）将破壁后的滤渣使用水提取，得到粗提液；
（3）将粗提液依次经过脱脂、除蛋白、醇沉的步骤，得到核桃叶多糖提取物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（1）核桃叶干燥、粉碎过20目筛，或经超微细破壁技术制成超微粉。
3.如权利要求 1 所述的应用，其特征在于步骤（1）所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（1）采用双螺杆挤压膨化破壁、低温冷冻破壁、超声波破壁方法中的一种或几种的组合对滤渣进行细胞壁破壁处理。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（2）在40-90℃进行提取。
6.如权利要求1所述的应用， 其特征在于步骤（3）依次使用石油醚脱脂、savage法除蛋白、乙醇沉淀的步骤。
7.一种核桃叶多糖提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
将 100 克核桃干叶在 46℃下干燥3h，粉碎，双螺杆挤压膨化制成超微粉，然后用每次用2500mL乙醇浸泡脱色2次，浸泡温度30℃，浸泡时间3h，抽滤，得脱色后的核桃叶粉，加2500mL水，在40℃下超声波处理4h，样品升温至72℃，并在该温度下搅拌10h，过滤，滤渣在相同条件下继续提取2次，合并滤液，减压浓缩至100mL，加入100mL石油醚脱脂，脱脂后再加入20mL的savage 试剂除去蛋白，水层在2000 r/min下离心5min，除去不溶物，上清加无水乙醇，调节乙醇浓度至 78%，静置 12h，抽滤得核桃叶多糖。
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