CN103463181A

CN103463181A - 一种核桃叶水提物的制备方法及所得核桃叶醇液和应用

Info

Publication number: CN103463181A
Application number: CN2013103917997A
Authority: CN
Inventors: 王书汉; 张其坤; 张启明; 王斌
Original assignee: 王书汉
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-02
Also published as: CN103463181B

Abstract

本发明公开了一种核桃叶水提物的制备方法及所得的核桃叶醇液和应用，制备方法包括以下步骤：将核桃叶干燥、用水浸泡，然后加热煮沸，收集馏出成分，即为核桃叶水提物。本发明针对核桃废叶多、未充分利用的问题，以核桃废叶为原料，采用简单的水煮蒸馏的方法提取核桃叶中的有效成分，变废为宝，为核桃叶的药用有效成份的研究提供一种简单易行、清洁高效的制备方法，所得的核桃叶醇液经验证具有抑菌、抑制癌细胞再生的功效，可用于抗肿瘤药物领域。

Description

一种核桃叶水提物的制备方法及所得核桃叶醇液和应用

技术领域

本发明涉及一种核桃叶有效成份的提取方法，具体涉及一种核桃叶水提物的制备方法、所得核桃叶醇液以及核桃叶醇液的应用，属于植物有效成份提取技术领域。

背景技术

核桃又名胡桃、羌桃，是胡桃科核桃属落叶乔木。因其种仁营养丰富，风味独特，为世界四大干果之一；又由于其含油量高，油味清香，成为高级食用及工业用油，同时具有医疗、保健功能。核桃的木材质地坚硬、纹理美观，是军事工业和高级家具、雕刻工艺、乐器等的珍贵木材。其树皮、果皮、根皮、枝叶中均含有大量的单宁，是栲胶、鞣料及染料工业极为重要的原料。核桃花粉量大，营养丰富，是新型花粉食品的重要原料。此外，由于核桃枝叶茂盛，根系庞大，对绿化山川，保持水土和改善环境方面也都发挥着良好的作用。因此，核桃浑身是宝，用途广泛，经济价值极高，是我国特种经济树种之一。

核桃叶中含有多种有效成分，如水溶性成分、维生素C、B、D 、E , 挥发油、黄酮类物质等，核桃叶也可入药，具有抑菌、解毒、消肿、改善新陈代谢、促进肌体强壮的功效，现代研究表明，核桃叶还具有抗癌、抗肿瘤活性的作用。济南周边有20多万亩核桃园，每天有无数的废核桃叶产生，这些废核桃叶一般作为废弃物抛弃或者焚烧，没有充分利用。如果将这些废核桃叶充分收集起来，提取其中的药用有效成分，可以使核桃叶变废为宝，符合节约资源、可循环发展的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核桃叶水提物的制备方法，该方法简便易行，充分提取核桃叶中有效成分，成本低，资源回用，变废为宝。

本发明的目的还在于提供采用上述方法得到的核桃叶水提物——核桃叶醇液。

本发明的目的还在于提供核桃叶醇液的应用。

本发明技术方案如下：

一种核桃叶水提物的制备方法，其特征是包括以下步骤：将核桃叶干燥、用水浸泡，然后加热煮沸，收集馏出成分，即为核桃叶水提物。

本发明制备方法，具体包括以下步骤：

（1）、将核桃叶干燥，放入带有冷凝器的加热容器中，压实，加入水浸泡，水位没过核桃叶；

（2）、浸泡后加热煮沸，同时收集馏出成分，当水位降至接近核桃叶位置时向加热容器中重新加水至初始位置，继续加热煮沸，收集馏出成分，所得馏出成分即为核桃叶水提物。

上述制备方法中，所采用的核桃叶包括核桃落叶或枯叶，可以为泰安、济南附近南部山区核桃树的落叶、枯叶。

上述制备方法中，将核桃叶清洗后干燥，核桃叶干燥方法为自然晾晒或烘干。

上述制备方法中，步骤（1）中，加水至没过核桃叶10-20cm为宜。

上述制备方法中，步骤（2）中，水位降至没过核桃叶2-4cm时重新加入水。

上述制备方法中，浸泡温度为常温或40-70℃，浸泡时间为0.5-2小时。

上述制备方法中，还包括以下优选方法：核桃叶浸泡前，进行以下处理：将核桃叶用液氮在-50～-60℃进行急速冷冻处理，处理时间为10-20min，急速冷冻后再在-10～-20℃下进行冷冻储藏。

上述制备方法中，加热煮沸阶段在氮气气氛下进行。

按照上述方法得到的核桃叶醇液也在本发明保护范围之内。

本发明核桃叶醇液在制备抗肿瘤药物中有较好的作用。

本发明针对核桃废叶多、未充分利用的问题，以核桃废叶为原料，采用简单的水煮蒸馏的方法提取核桃叶中的有效成分，变废为宝，为核桃叶的药用有效成份的研究提供一种简单易行、清洁高效的制备方法。所得的核桃叶醇液经验证具有抑菌、抑制癌细胞再生的功效，可用于抗肿瘤药物领域。

附图说明

图1 核桃叶提取设备的示意图。

图中，1、物料托架，2、反应釜，3、冷凝器，4、冷凝盘管，5、导管。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。

本发明提取有效成分时，可以选用普通的可加热的反应容器，也可以使用下述本发明自行设置的提取装置，该提取装置如图1所示，包括反应釜（即加热容器）2和冷凝器3，反应釜内底部设有物料托架1，冷凝器内设有螺旋状的冷凝盘管4，反应釜上连接一导管5，导管一端与反应釜顶部连通，另一端与冷凝器顶部连通，导管与冷凝器相连的一端向下倾斜，且导管向下倾斜0-30°。

上述装置中，反应釜的供热设施可以是炭火、木材等一次能源加热，也可以采用导热油、电、蒸汽加热，农、工皆宜，使用便捷，可以简便的实现有效成分的提取和分离。

实施例1

本发明提取步骤如下：

1、收集济南或泰安地区的核桃枯叶或落叶，清洗干净，自然晾晒至黄褐色，放置于干燥处待用；

2、称取核桃叶2.5kg放入加热容器（反应釜）内，压实，使废叶紧密的位于加热容器中，压好废叶后，加水至没过核桃叶10-20cm，一般15cm左右，常温浸泡2h；

3、在加热容器上安装上冷凝器，通冷凝水，对加热容器通氮气，将容器内的空气全部置换掉，并在氮气的气氛下开始对容器进行加热，直至沸腾，维持沸腾状态，开始收集馏出成分；待加热容器内水位降至没过核桃叶2-4cm时向加热容器内补充水至原始位置（没过核桃叶10-20cm），继续加热蒸煮并收集馏出成分。把两次收集的馏出成分合并，即为核桃叶水提物——核桃叶醇液。

实施例2

本发明提取步骤如下：

1、收集济南或泰安地区的核桃枯叶或落叶，清洗干净，烘干水分至黄褐色，放置于干燥处待用；

2、称取核桃叶2.0kg放入加热容器（反应釜）内，压实，使废叶紧密的位于加热容器中，压好废叶后，加水至没过核桃叶10-20cm，一般15cm左右，40℃浸泡1h；

4、在加热容器上安装上冷凝器，通冷凝水，对加热容器通氮气，将容器内的空气全部置换掉，并在氮气的气氛下开始对容器进行加热，直至沸腾，维持沸腾状态，开始收集馏出成分；待加热容器内水位降至没过核桃叶2-4cm时向加热容器内补充水至原始位置（没过核桃叶10-20cm），继续加热蒸煮并收集馏出成分。把两次收集的馏出成分合并，即为核桃叶水提物——核桃叶醇液。

实施例3

按照实施例1的方法提取核桃叶水提物，不同的是：将核桃叶在70℃浸泡30min。

实施例4

2、将核桃叶用液氮在-50～-60℃进行急速冷冻处理，处理时间为10-20min，急速冷冻后再在-10～-20℃下进行冷冻储藏；

4、从冷冻储藏室中称取核桃叶2.5kg放入加热容器（反应釜）内，压实，使废叶紧密的位于加热容器中，压好废叶后，加水至没过核桃叶10-20cm，一般15cm左右，常温浸泡2h；

5、在加热容器上安装上冷凝器，通冷凝水，对加热容器通氮气，将容器内的空气全部置换掉，并在氮气的气氛下开始对容器进行加热，直至沸腾，维持沸腾状态，开始收集馏出成分；待加热容器内水位降至没过核桃叶2-4cm时向加热容器内补充水至原始位置（没过核桃叶10-20cm），继续加热蒸煮并收集馏出成分。把两次收集的馏出成分合并，即为核桃叶水提物——核桃叶醇液。

采用此急速冷冻方法处理核桃废叶后，叶子中的有效成分得到充分的保留，不会变质和损失，提取所得有效成分的含量和品质都得到了提升。

一、核桃叶提取物抑菌作用的研究

1、实验材料

1.1主要试剂

乙醇、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、 K₂HPO₄ 、 KH₂PO₄ 、MgSO₄、NaCl

1.2主要材料与仪器

供试细菌：枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，根霉，曲霉；

主要仪器：电热鼓风干燥箱，电子天平，振荡仪，恒温水浴箱，电子调温电热套，低温冷却液循环泵，蒸馏装置，生化培养箱，无菌水高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，滤纸，接种环，刮铲，培养皿，研钵。

2、实验过程

2.1菌悬液的制备

供试菌种为枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，根霉，曲霉。预先将供试验的菌种进行活化。量取5ml 无菌水于试管中，接种环灼烧后挑取菌种放入无菌水中，每试管中取两环菌种，充分摇匀震荡，得菌悬液。

2.2培养基的制备

取3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gNaCl、0.5gMgSO₄, lg K₂HPO₄ ,0.5g KH₂PO₄ ，1000ml水配制牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌待用。

2.3抑菌实验

采用抑菌圈法作为检测指标，检测核桃叶提取物的抑菌效果。

抑菌圈的测定方法

事先将试验所用器材在洁净工作台中用紫外光灭菌，然后在无菌操作条件下，将供试菌菌悬液各 lml ，分别涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用刮铲涂抹均匀，然后取直径 10mm 圆片滤纸，滤纸分别浸渍在本发明实施例1提取物、本发明实施例4提取物和无菌水中，浸渍30s后取出，滤干溶液后均匀贴于培养基上。操作完成后，将平板在28℃下培养，培养24和72h ，观察培养基内各菌的生长状况。用十字交叉法测量抑菌圈直径（mm）。其中核桃叶提取物组为实验组，无菌水组为阴性对照组。

3、结果与分析

本发明提取物抑菌作用见下表1。

从上述数据可以看出，本发明提取物对细菌和真菌都有较好的抑菌效果，且实施例4的提取物比实施例1的提取物抑菌效果明显。

二、核桃叶提取物抗肿瘤活性作用研究

1、药品与试剂

药品：本发明实施例1和实施例4的核桃叶提取物。本发明提取物临用前用培养液配制成所需浓度。

试剂：新生小牛血清、二甲基亚砜、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、甲基偶氮唑盐（MTT）

2、仪器设备

96孔细胞培养板：美国 Costar

spectraMax Plus³⁸⁴酶标仪：美国 Molecular Devices

二氧化碳培养箱：日本三洋

超净工作台：苏净仪器厂

台式离心机：上海安亭

微量震荡器：海门市其林倍尔仪器厂

3、细胞株与细胞培养

人胃癌细胞 SWWC 、人肺腺癌细胞 A549 、人宫颈癌细胞 Hela 及人成纤维肉瘤细胞 HT1080 培养于RPMI-1640中，加入10％新生小牛血清、青霉素 G (100U/ mL)和链霉素（1mg/ml），放置于二氧化碳培养箱中培养，所有实验均在细胞对数生长期进行。

4、实验方法

利用MTT比色法测定细胞毒性。取对数生长期的SWWC、A549、Hela 、HT1080细胞，经0.25％胰酶消化，1000r/min离心5min，调节细胞浓度8×10⁴/ml接种于96孔板上，每孔加 100 μL细胞，同时设置空白对照孔，放置于二氧化碳的培养箱中培养 24h 后分别加入本发明实施例1和4的提取物，空白对照孔加等体积的培养液，放置于培养箱中继续培养44h 后，每孔加入 10μLMTT 溶液 (5mg/mL)，继续培养4h，弃上清，每孔加入 100μL二甲基亚砜（DMSO) 溶液，置微量震荡器上振荡 10min，在酶标仪以570nm波长测吸光度（OD 值），按下列公式求出增值抑制率。

抑制率=(1-用药组平均OD 值／对照组平均OD 值）×l00 %

5、实验结果

5.1对人胃癌细胞（SWWC）的抑制作用，结果见表2。

5.2对人肺腺癌细胞（A549）的抑制作用，结果见表3。

5.3对人成纤维肉瘤细胞（HT1080）的抑制作用，结果见表4。

5.4对人宫颈癌细胞（Hela）的抑制作用，结果见表5。

从上述数据可以看出，本发明提取物对多种癌细胞均有一定的抑制作用，并且实施例4的提取物抑制作用明显强于实施例1的产品。

Claims

1.一种核桃叶水提物的制备方法，其特征是包括以下步骤：将核桃叶干燥、用水浸泡，然后加热煮沸，收集馏出成分，即为核桃叶水提物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是具体包括以下步骤：

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：所述核桃叶包括核桃落叶或枯叶。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：将核桃叶清洗后干燥，核桃叶干燥方法为自然晾晒或烘干。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，加水至没过核桃叶10-20cm为宜；步骤（2）中，水位降至没过核桃叶2-4cm时重新加入水。

6.根据权利要求1、2或5所述的制备方法，其特征是：浸泡温度为常温或40-70℃，浸泡时间为0.5-2小时。

7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：核桃叶浸泡前，进行以下处理：将核桃叶用液氮在-50～-60℃进行急速冷冻处理，处理时间为10-20min，急速冷冻后再在-10～-20℃下进行冷冻储藏。

8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：加热煮沸阶段在氮气气氛下进行。

9.一种核桃叶醇液，其特征是：采用权利要求1-8中任一项所述的方法制得。

10.权利要求9所述的核桃叶醇液在制备抗肿瘤药物中的应用。