CN102273623A - 一种油橄榄叶提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种油橄榄叶提取物的制备方法，采用微波辅助溶剂萃取方法只需极短的时间，提取效率高，而且由于其短得多的萃取时间，高温敏感的物质经提取后的性状变化较小，采用大孔吸附树脂分离可以使提取物中的活性物质富集，提高提取物的选择性和稳定性，将影响提取物的活性的因素降低，保持提取物的活性。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域，尤其涉及一种油橄榄叶提取物的制备方法。
背景技术
油橄榄(Olea europea)又名洋橄榄、齐敦果，主要分布在地中海沿岸国家，主要利用鲜果加工成素有“植物油皇后”之称的橄榄油。现代生物技术分析表明，油橄榄叶中含有丰富的抗氧化活性成分，这些活性物质主要有橄榄多酚、黄酮类、裂环烯醚萜类(包括橄榄苦苷)、双黄酮等。而这些活性物质需要从油橄榄叶中提取出来，现有技术中的提取方法如下：
专利号为200710107642.1，发明名称为“油橄榄叶提取工艺”的中国专利公开如下制备方法：将油橄榄叶低温避光干燥，粉碎；用乙醇或甲醇回流提取、浸泽提取、渗濾提取、超声波提取方法提取；将提取液过滤、真空浓缩、真空干燥、得油橄榄叶粗提取物；将粗提物粉碎，过20-80目筛，加水溶解后过滤，除去杂质，经膜分离，离子交换分离，得到油橄榄叶精提取物。
专利号为200710118209.8，发明名称为“油橄榄叶提取物的制备方法”的中国专利公开如下制备方法是：将油橄榄叶干燥粉碎，回流提取，过滤，真空浓缩，浓缩液加1-2倍体积水，静止24-36h，过滤，滤液经微滤、超滤、纳滤，滤液真空浓缩，冷冻干燥，辐照灭菌，制得油橄榄叶提取物。
另外还有一篇发明专利“富含高纯度橄榄苦甙的油橄榄叶提取物的制备方法”中的油橄榄叶提取物制备方法是：先用极性溶剂对油橄榄叶进行提取，再碱性离心沉降，获得离心清液和沉淀物，接着进行膜耦合分离，得到通过纳滤膜的浓缩液，再介质吸附，对吸附介质进行洗脱得到洗脱液，真空浓缩，再进行真空冷冻干燥或喷雾干燥，获得油橄榄叶提取物。
目前，上述三种油橄榄叶提取物的制备方法都存在以下缺陷：提取时间长，且由于膜分离的选择性低，随着分离时间延长，膜容易发生浓差极化和污染，分离性能降低，导致提取物的活性降低，
发明内容
针对上述缺陷，本发明解决的技术问题在于提供一种油橄榄叶提取物的制备方法，提取时间短，高温敏感的物质经提取后的性状变化较小，将影响提取物的活性的因素降低，保持提取物的活性。
为了解决以上的技术问题，本发明提供的油橄榄叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)油橄榄叶粉碎，得到油橄榄叶的粉末；
(2)将粉末按照固液比为1∶10至1∶40的比例加入萃取溶剂制成萃取溶液，将萃取溶液微波加热萃取20s-180s，离心分离，得到上清液；
(3)将上清液加到非极性吸附树脂的层析柱内，层析柱的径高比为1∶10至1∶20，上清液的流速为0.5ml/min-3ml/min，上柱样为15-20个柱体积；
(4)然后用蒸馏水洗脱1-5个柱体积后，再用5-10个柱体积的浓度为50％-90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；
(5)将乙醇洗脱液在40℃-50℃环境下旋转加热浓缩得到原体积的1/5-1/2倍体积的浓缩液；
(6)将浓缩液在40℃-45℃真空环境干燥得到油橄榄叶提取物的膏状物，将膏状物在负15℃-负25℃冷冻干燥，制成油橄榄叶提取物产品。
优选地，在步骤(1)中，将油橄榄叶在40℃-50℃温度下干燥2h-4h，通过高速组织捣碎机粉碎得到油橄榄叶的粉末，将粉末过40-80目筛。
优选地，在步骤(2)中，萃取溶剂为浓度为蒸馏水或10％-80％的乙醇或甲醇，将萃取溶液置于微波炉中100w-400w加热萃取20s-180s，在离心机转速为2000转/min-4000转/min的情况下离心分离2min-20min。
优选地，在步骤(2)中，离心后的的沉淀重复按照权利要求3所述的步骤得到上清液，将两次上清液混合。
优选地，在步骤(3)中，将上清液加到非极性大孔吸附树脂的层析柱内，上清液的流速为1ml/min-2ml/min。
优选地，在步骤(4)中，用蒸馏水洗脱2-3个柱体积后，再用6-8个柱体积的浓度为60％-80％的乙醇洗脱。
优选地，在步骤(5)中，乙醇洗脱液通过旋转蒸发仪将上清液在40℃-50℃、60转/min-80转/min环境下旋转加热浓缩。
优选地，在步骤(6)中，浓缩液通过真空干燥箱在40℃-45℃真空环境干燥得到油橄榄叶提取物的膏状物。
优选地，在步骤(6)中，膏状物在负20℃冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明提供的油橄榄叶提取物的制备方法，采用微波辅助溶剂萃取方法只需极短的时间，提取效率高，而且由于其短得多的萃取时间，高温敏感的物质经提取后的性状变化较小，采用大孔吸附树脂分离可以使提取物中的活性物质富集，提高提取物的选择性和稳定性，将影响提取物的活性的因素降低，保持提取物的活性。
具体实施方式
为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体实施例进行阐述。
本发明的油橄榄叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将油橄榄叶在45℃温度下干燥3h，通过高速组织捣碎机粉碎得到油橄榄叶的粉末，将粉末过60目筛，得到油橄榄叶的粉末；
(2)将粉末按照固液比为1∶30的比例加入萃取溶剂制成萃取溶液，萃取溶剂为浓度为40％的乙醇或甲醇，将萃取溶液置于微波炉中250w加热萃取100s，在离心机转速为3000转/min的情况下离心分离10min；离心后的的沉淀按照固液比为1∶30的比例加入萃取溶剂制成萃取溶液，萃取溶剂为浓度为40％的乙醇或甲醇，将萃取溶液置于微波炉中250w加热萃取100s，在离心机转速为3000转/min的情况下离心分离10min得到上清液；将两次上清液混合；
(3)将上清液加到非极性大孔吸附树脂的层析柱内，层析柱的径高比为1∶15，上清液的流速为1.5ml/min，上柱样为18个柱体积；
(4)然后用蒸馏水洗脱1.5个柱体积后，再用7个柱体积的浓度为70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；
(5)乙醇洗脱液通过旋转蒸发仪将上清液在45℃、70转/min环境下旋转加热浓缩，得到原体积的1/5-1/2倍体积的浓缩液。
(6)浓缩液通过真空干燥箱在42℃真空环境干燥得到油橄榄叶提取物的膏状物，膏状物在负20℃冷冻干燥，制成油橄榄叶提取物产品。
本发明的油橄榄叶提取物的制备方法得到的油橄榄叶提取物具有良好的抑菌性和抗氧化性。
抑菌性实验：
抑菌流程：培养供试菌种→制备含菌培养基→加入油橄榄叶提取物到含菌培养基→抑菌。
具体步骤：供试菌种有细菌和真菌，其中细菌包括大肠杆菌(Eschericheacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，真菌包括黑曲霉(Aspergillus sp)和根霉(Rhizopus)。将细菌和真菌分别用生理盐水制成菌悬液，使其含孢子或菌体量在106-108个每毫升。
分别将牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯基本培养基经高压蒸汽(121℃，20min)灭菌后，冷却至50～60℃，按每10-20mL培养基里加入1-2mL菌悬液，分别在牛肉膏蛋白胨培养基里加入适量的细菌悬液，马铃薯基本培养基里加入适量的真菌悬液，将含有供试菌种的培养基混合均匀后倾注于灭菌的直径为9cm的培养皿内，每皿约15～20ml。将铺好的带有细菌或真菌的培养皿平板，于无菌操作下用打孔器进行打孔，挖出中心培养基，再将0.5-200mg/ml油橄榄叶醇提取物1-2mL注入挖好的小孔中。将细菌置于35～37℃恒温箱内培养18～24小时，真菌置于28℃的恒温箱内培养44～48小时。所有供试菌株的生长都受到抑制，抑制顺序为黑曲霉＝枯草芽孢杆菌＞根霉＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞蜡样芽孢杆菌，其最低抑制浓度(MIC)分别为0.5mg/ml，0.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，25mg/ml和50mg/ml。油橄榄叶提取物有着广谱的抑菌作用，作为天然防腐剂可应用于食品、水果和蔬菜的保鲜以及药品行业。
抗氧化性实验：
1、油橄榄叶多酚提取物清除DPPH·自由基(二苯代苦味酰自由基)
原理：DPPH·分析法被广泛用于清除自由基物质性质的研究。DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。
具体步骤：称取油橄榄叶提取物干燥粉末，配成0.5-10μg/ml的梯度溶液避光冷藏备用。取不同浓度油橄榄叶提取物各2ml，分别加入2ml 2×10-4mol/lDPPH·(二苯代苦味酰自由基)，摇匀，30min后用无水乙醇作参比测定其吸光度Ai，同时测定2ml 2×10-4ml/L DPPH·溶液与2ml无水乙醇混合液的吸光度A0，以及2ml不同浓度油橄榄叶提取物与2ml无水乙醇混合液的吸光度Aj，根据下列公式计算不同浓度油橄榄叶提取物对DPPH·的抑制率：抑制率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。油橄榄叶提取物清除有机自由基DPPH·的清除率随着油橄榄叶提取物浓度的提高而显著上升，其半清除率(IC50)为1.31μg/ml，略低于抗坏血酸的IC501.5μg/ml。油橄榄叶提取物清除有机自由基DPPH·的能力与抗坏血酸相当，甚至超过抗坏血酸。
2、油橄榄叶多酚物质清除OH·自由基
原理：H2O2与二价铁离子混合后产生OH·，其反应式为：H2O2+Fe2+→OH·+OH-+Fe3+。OH·具有很高的反应活性，其存活时间短。如在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕捉OH·，并产生有色产物，该有色产物在510nm处有强吸收。若在体系中加入具有清除OH·功能的被测物，能及时清除OH·，从而使有色产物的生成量减少导致吸光度减小。采用固定反应时间法，在510nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，便能测定被测物对OH·的清除作用。
具体步骤：称取油橄榄叶提取物干燥粉末，配成0.1-1mg/ml的梯度溶液避光冷藏备用。取不同浓度油橄榄叶提取物各2ml，分别加入8.8mmol/l H2O22ml，9mmol/L FeSO4 2ml，9mmol/l水杨酸-乙醇2ml，将反应体系混匀，在37℃反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm下测量各浓度的吸光度Ax。考虑到油橄榄叶提取物本身的吸收光值，以9mmol/L FeSO4 2ml，9mmol/l水杨酸-乙醇2ml，不同浓度的油橄榄叶提取物溶液2ml和2ml超纯水作为色素的本底吸收A0。其清除率计算式为：清除率(％)＝(A0-Ax)/A0×100％。油橄榄叶提取物清除OH·的清除率随着油橄榄叶提取物浓度的提高而显著上升，其IC50为0.291mg/ml，显著低于抗坏血酸的IC500.425mg/ml。油橄榄叶提取物清除OH·的能力优于抗坏血酸。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)油橄榄叶粉碎，得到油橄榄叶的粉末；
(2)将粉末按照固液比为1∶10至1∶40的比例加入萃取溶剂制成萃取溶液，将萃取溶液微波加热萃取20s-180s，离心分离，得到上清液；
(3)将上清液加到非极性吸附树脂的层析柱内，层析柱的径高比为1∶10至1∶20，上清液的流速为0.5ml/min-3ml/min，上柱样为15-20个柱体积；
(4)然后用蒸馏水洗脱1-5个柱体积后，再用5-10个柱体积的浓度为50％-90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；
(5)将乙醇洗脱液在40℃-50℃环境下旋转加热浓缩得到原体积的1/5-1/2倍体积的浓缩液；
(6)将浓缩液在40℃-45℃真空环境干燥得到油橄榄叶提取物的膏状物，将膏状物在负15℃-负25℃冷冻干燥，制成油橄榄叶提取物产品。
2.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，将油橄榄叶在40℃-50℃温度下干燥2h-4h，通过高速组织捣碎机粉碎得到油橄榄叶的粉末，将粉末过40-80目筛。
3.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，萃取溶剂为浓度为蒸馏水或10％-80％的乙醇或甲醇，将萃取溶液置于微波炉中100w-400w加热萃取20s-180s，在离心机转速为2000转/min-4000转/min的情况下离心分离2min-20min。
4.根据权利要求3所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，离心后的的沉淀重复按照权利要求3所述的步骤得到上清液，将两次上清液混合。
5.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，将上清液加到非极性大孔吸附树脂的层析柱内，上清液的流速为1ml/min-2ml/min。
6.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，用蒸馏水洗脱2-3个柱体积后，再用6-8个柱体积的浓度为60％-80％的乙醇洗脱。
7.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，乙醇洗脱液通过旋转蒸发仪将上清液在40℃-50℃、60转/min-80转/min环境下旋转加热浓缩。
8.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，浓缩液通过真空干燥箱在40℃-45℃真空环境干燥得到油橄榄叶提取物的膏状物。
9.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，膏状物在负20℃冷冻干燥。
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| CN102935101A (zh) * | 2012-12-10 | 2013-02-20 | 青岛海尔软件有限公司 | 一种橄榄叶多酚的提取方法 |
| CN114532364A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-05-27 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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| 《中药材》 20070430 党建章等 D-101大孔树脂富集橄榄叶中橄榄苦苷的研究 第454-457页 1-9 第30卷, 第4期 * |
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| CN114532364A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-05-27 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种利用油橄榄叶提取物制备纳米硒/凹凸棒石复合抗菌材料的方法 |
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