CN103961383A - 具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物及其制备方法，是在海南青梅茎的干燥粉末中加入有机溶剂提取；提取液经过滤、减压浓缩得到总浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分，所得乙酸乙酯部分经氯仿与甲醇混合溶剂系统梯度洗脱，其中体积比为100:30的氯仿与甲醇洗脱组分具有优良的清除自由基活性，该组分包括16个白藜芦醇低聚体类化合物。本发明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备，所得提取物具有优良清除自由基活性，可应用于抗氧化与清除自由基功能的保健食品、药品和食品中。

Description

具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物的制备方法

技术领域

本发明属于植物活性组分提取分离技术领域，涉及一种植物活性组分及其有效成分的提取分离方法，具体是一种具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物的制备方法。

背景技术

青梅属(Vatica)为龙脑香科(Dipterocarpaceae)植物中最大的亚属，约有65种，主要分布于亚洲热带地区，为热带雨林优势树种。我国有三种，海南青梅，即青梅(V.mangachapoi Blanco ssp.hainanensis)，广西青梅(V.guangxiensisX.L.)和版纳青梅(V.xishuangbannaensis G.D.)。其中海南青梅的世界分布主要在越南、泰国、菲律宾、印度尼西亚等地，在我国，海南青梅仅分布在海南省，其叶在民间被长期用作杀菌消毒，治疗肝炎及提取中药龙脑香。

天然白藜芦醇低聚体是一类由白藜芦醇或者是其它二苯乙烯类单体经脱氢后形成聚合度不等的特殊多酚类化合物。自1951年King等人从龙脑香科的两种植物Hopea odorata和Balanocarpus heimii中首次分离得到第一个白藜芦醇的聚合体(hopeaphenol,四聚体)，并于1965年成功应用x-ray单晶衍射技术证实该结构(Coggon P,Janes N F,King F E,et al.Hopeaphenol,an extractive ofthe heart wood of Hpea odorata and Balanocarpus heimii.J.Chem.Soc.1965,1:406–409)。白藜芦醇低聚体因具有与白藜芦醇类似的抗癌、抑癌作用(Ito T,Akao Y,Yi H,et al Antitumor effect of resveratrol oligomersagainst human cancer cell lines and the molecular meehanism of apoptosisindueed by vatieanolC.Careinogenesis2003,24:1489–1497)、抗炎作用(LiuB L,Inami Y,Tanaka H,et al.Vaticanol(B,C and G),α-viniferin,and hopeaphenolinhibit mediator release from bone marrow-derived mouse mast cells in vitro.Chin.J.Nat.Med.2004,2:176–183)、保肝作用(Oshima Y,Ueno Y.Ampelopsin D,E,H andcis-ampelopsin E,oligostilbenes from Ampelopsis brevipeduneulata var.Hancei roots.Phytochemisrtry1993,33:179–182)、抗细菌和真菌(Nitta T,Arai T,Takamatsu H,etal.Antibacterial activity of extracts prepared from tropical and subtropical plants onmethicillin-resistant staphylococcus aurreu.J.Health.Sci.2002,48:273–276；Zgoda-pols J R,Freyer A J,Killmer L B,et al Antimicrobial resveratrol tetramersfrom the stem bark of Vatica oblongifolia ssp.oblongiflolia.J.Nat.Prod.2002,65,1554–1559)、抗氧化和抗衰老作用、清除自由基(Tanaka T,Ito T,NakayaK,et al.Vatieanol D,a novel resveratrol hexamer isolated from Vatica rassak.Tetrahedron Lett.2000,41:7929–7932)以及氧化酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性(QinY H,Zhang J,Cui J T,et al.Oligostilbenes from Vatica mangachapoi with xanthineoxidase and acetylcholinesterase inhibitory activities.RSC Advances,2011,1:135–141)等重要生物活性而备受关注。迄今为止，从青梅属植物中已分离得到单体衍生物到白藜芦醇八聚体共几十种白藜芦醇低聚体，其中以二、三和四聚体居多。

自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。随着对自由基研究的深入，科学家们越来越清楚地认识到，清除人体多余自由基有益于某些疾病(炎症、心血管疾病、肿瘤和氧化性疲劳等)的预防和治疗，开发利用高效无毒的天然抗氧化剂–自由基清除剂，已成为当今科学发展的趋势。

海南青梅叶部分的80％乙醇提取物已证实具有良好抗氧化活性(尹文清,宋鑫明,陈光英,等.青梅叶中多酚含量测定及抗氧化活性研究.食品安全与检测,2009,34:283-286)，但其活性成分是什么尚未确定；而其茎的粗提取物已经被证实具有优良抗HIV(I-W朴,陈光英,韩长日,等.药用植物的提取物及其应用CN102724990)、抗肿瘤(袁媛，王琳，田丽美，等.MTT法筛选青梅对SPCA-1体外增殖抑制作用有效部位的研究，食品工业,2010,1:10-11)、抗炎(陈忠,杨燕,王天山,等.青梅和大叶鱼骨木提取浸膏的抑菌活性.时珍国医国药,2009,20:445-446)等活性。但目前国内外尚未见海南青梅茎提取物的化学活性组分的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物及其制备方法，采用清除DPPH自由基的活性追踪分离策略，利用提取分离方法对海南青梅茎提取物乙酸乙酯萃取部位的不同极性组分进行清除DPPH自由基活性筛选，确定活性组分，经多次柱层析，阐明活性组分中所含的化学成分。

本发明所采用的技术方案：

一种具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物的制备方法，其步骤如下：

1、总浸膏的制备

取海南青梅的茎于室温阴干后粉碎成粉末，然后用溶剂提取，提取的次数为3～5次；提取液过滤合并，经减压浓缩得总浸膏。所述溶剂为甲醇、丙酮或50～95％的乙醇。

2、不同极性部位的制备

将步骤(1)制得的总浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收得到相应的石油醚部分、乙酸乙酯部分。

3、硅胶柱色谱分段

A、将步骤(2)制备的乙酸乙酯部位，通过有机溶剂溶解，然后用100～200或200～300目硅胶与其混匀，硅胶与样品的干重比1～2:1，室温下避光自然风干后经硅胶柱色谱分离，硅胶柱中的硅胶颗粒为200～300或300～400目，且硅胶与样品的干重比为10～12:1；

B、采用氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，每一极性段均洗脱至无色，得到多个极性段的组分；所采用梯度为氯仿与甲醇的体积比分别为100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100。洗脱液每500～750ml收集一瓶。

4、硅胶和凝胶柱色谱分离纯化

将步骤(3)所得的氯仿与甲醇的体积比为100:30极性段的提取物(组分)，经硅胶、凝胶柱色谱细分，共得到16个白藜芦醇低聚体类化合物，其中3个白藜芦醇一倍半聚体，11个白藜芦醇二聚体，2个白藜芦醇四聚体。

上述方法中，所述提取方法包括室温浸泡、加热或超声提取。

上述方法中，海南青梅茎的干燥粉末与溶剂的体积比为1:1～1:10。

上述方法中，柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶LH-20。

本发明的提取物具有优良清除自由基活性，可以广泛应用于具有抗氧化与清除自由基功能的保健食品、功能食品和食品中。

本发明的优点在于：

1)、利用简单的提取分离方法，对海南青梅茎提取物进行极性分段分离制备及清除自由基活性筛选，找到活性组分，经多次柱层析，阐明活性组分的化学成分。

2)、本发明所得提取物的化学成分明确。

3)、所得提取物具有优良清除自由基活性，可以广泛用于具有抗氧化与清除自由基功能的保健食品、功能食品和食品中。

4)、本法明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

海南青梅茎提取物的制备方法步骤如下：

1)、取海南青梅的茎于室温阴干后粉碎，过20-80目筛，然后加入甲醇、丙酮或50-95％的乙醇，室温浸泡、加热或超声提取，提取时间为60分钟至7天，料液比为1:1～1:10；

2)、将提取液过滤、减压回收得到总浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收分别得到石油醚部分和乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分经氯仿与甲醇混合溶剂体系(梯度为100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，体积比)进行梯度洗脱，薄层色谱检测合并相同组分，得6个组分A-F(A，100:0；B，100:5；C，100:30；D，100:40；E，100:60；F，100:100)；

3)、对6个组分进行性能检测，确定C组分具有优良清除自由基活性，将C(100:30)组分进行反复柱层析：氯仿：乙酸乙酯(1:2)硅胶柱层析分别得到化合物(1)、(2)、(3)和(5)；氯仿：乙酸乙酯(1：2)接着是氯仿：甲醇(4:1)硅胶柱层析分离得到化合物(4)、(6)和(7)；氯仿：乙酸乙酯(1：3)硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇(1:1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物(8)、(9)、(10)和(11)；氯仿：乙酸乙酯：甲醇(6:1:1)硅胶柱层析和氯仿：甲醇(1:1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物(12)、(13)、和(14)；氯仿：乙酸乙酯(1:4)硅胶柱层析得到化合物(15)和(16)。

4)、综合应用多种波谱技术(包括MS、1D/2D NMR)结合相关文献参考，对纯化得到的单体化合物进行结构鉴定，分别为16个白藜芦醇低聚体类化合物，具体结构为diptoindonesin G(1)、parviflorol(2)、diptoindonesin D(3)、(+)-ε-viniferin(4)、hopeahainol C(5)、vaticahainol(6)、hopeafuran(7)、vitisinols G(8)、malibatol A(9)、Vaticahainol C(10)、ampelopsin A(11)、balanocarpol(12)、ampelopsin F(13)、isoampelopsin(14)、vaticaffinol(15)、pauciflorol C(16)，测定结构可靠。

下面结合实施例对发明作详细说明。

实例一海南青梅茎有效部位的制备

海南青梅茎(10Kg)，室温阴干后粉碎，室温下采用75％乙醇室温浸泡3次，7天/次，合并提取液，减压浓缩得总提取物(1.0Kg)，加水悬浮分散，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，得石油醚部分(50g)，乙酸乙酯部分(400g)。

乙酸乙酯部分经过硅胶柱层析分离，氯仿：甲醇(100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，体积比)进行梯度洗脱，其中的氯仿：甲醇(100:30)洗脱所获得的组分经反复硅胶柱层析、葡聚糖凝胶(Sephdex LH-20)柱层析，得到16个白藜芦醇低聚体类化合物，分别为反复氯仿：乙酸乙酯(1:2)硅胶柱层析分别得到diptoindonesin G(1)20.5mg、parviflorol(2)25.2mg、diptoindonesinD(3)17.4mg和hopeahainol C(5)31.5mg；氯仿：乙酸乙酯(1:2)接着是氯仿：甲醇(4:1)硅胶柱层析分离得到(+)-ε-viniferin(4)17.8mg、vaticahainol(6)13.2mg和hopeafuran(7)21.1mg；氯仿：乙酸乙酯(1:3)硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇(1:1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到vitisinols G(8)9.5mg、malibatol A(9)16.8mg、vaticahainol C(10)26.1mg和ampelopsin A(11)210.2mg；氯仿：乙酸乙酯：甲醇(6:1:1)硅胶柱层析和氯仿：甲醇(1:1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到balanocarpol(12)1.2g、ampelopsin F(13)176.8mg和isoampelopsin(14)25.4mg；氯仿：乙酸乙酯(1:4)硅胶柱层析得到vaticaffinol(15)2.1g和pauciflorol C(16)36.1mg。化学结构如下：

实施例二海南青梅茎乙酸乙酯萃取部位各极性组分清除DPPH自由基活性研究

1.供试液的配制

将1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)配制成65μM无水乙醇溶液。精密称取供试样品分别溶解于无水乙醇当中备用。

2.实验方法

移取50μL供试样品加入到3mL65μM DPPH溶液中，空白对照用等量无水乙醇，混匀，室温下放置30min后于比色皿中，测定样品和DPPH的混合溶液在517nm处吸光值。每一吸光度平行测3次，取其平均值，计算系列浓度的清除率，得出IC₅₀值。清除率(Y)按下式计算：

Y＝[l一(Ai一Aj)/Ao]×100％

式中：Ao DPPH乙醇溶液在517nm处吸光值；

Ai DPPH乙醇溶液与试样混合液在517nm处吸光值；

Aj乙醇与试样混合液在517nm处吸光值。

3.实验结果：由实施例一得到的海南青梅茎乙酸乙酯萃取部位不同极性组分A-F(A，100:0；B，100:5；C，100:30；D，100:40；E，100:60；F，100:100)对DPPH自由基均显示不同程度的清除活性(见表1)，其中Ｃ组分最强，与维生素C(Vc)的IC₅₀值(26.2μM)相当，IC₅₀值为32.1μM。

表1不同极性组分对自由基的清除活性

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物的制备方法，其特征在于，其步骤如下：

1)、总浸膏的制备

取海南青梅的茎于室温阴干后粉碎成粉末，然后用溶剂提取，提取的次数为3～5次；提取液过滤合并，经减压浓缩得总浸膏；所述溶剂为甲醇、丙酮或50～95％的乙醇；

2)、不同极性部位的制备

将步骤(1)制得的总浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收得到相应的石油醚部分、乙酸乙酯部分；

3)、硅胶柱色谱分段

A、将步骤(2)制备的乙酸乙酯部位，通过有机溶剂溶解，然后用100～200或200～300目硅胶与其混匀，硅胶与样品的干重比1～2:1，室温下避光自然风干后经硅胶柱色谱分离，硅胶柱中的硅胶颗粒为200～300或300～400目，且硅胶与样品的干重比为10～12:1；

B、采用氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，每一极性段均洗脱至无色，得到多个极性段的组分；所采用梯度为氯仿与甲醇的体积比分别为100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100；

4)、硅胶和凝胶柱色谱分离纯化

将步骤(3)所得的氯仿与甲醇的体积比为100:30的极性段的提取物，经硅胶、凝胶柱色谱细分，共得到16个白藜芦醇低聚体类化合物，其中3个白藜芦醇一倍半聚体，11个白藜芦醇二聚体，2个白藜芦醇四聚体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述提取方法包括室温浸泡、加热或超声提取。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：海南青梅茎的干燥粉末与溶剂的体积比为1:1～1:10。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶LH-20。