CN102464685A

CN102464685A - 从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法及其产品

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Publication number: CN102464685A
Application number: CN201010538344XA
Authority: CN
Inventors: 杨国栋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2012-05-23

Abstract

本发明公开了一种从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法及其产品，取罗汉果叶，加水煮沸提取2～3次，每次50～100min，过滤，合并滤液，进大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用乙醇或无水甲醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇或甲醇，于冰箱中放置20～30h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，即得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物。本发明所提供的提取工艺简单，科学合理，可行性强，所得提取物的纯度高，精品纯度可达95％以上；且本发明所得提取物具有良好的自由基清除活性，应用前景广阔。另外，利用本发明技术可对大量废弃的罗汉果叶加以充分利用，提高自然资源的利用率，减少浪费。

Description

从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法及其产品

技术领域

本发明涉及从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法及其产品，特别是提取山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的方法及其产品，属于药用活性成分的提取技术领域。

背景技术

罗汉果作为广西桂北地区的传统特产，也是我国特有的药用植物，主要分布在两广、云南、江西、湖南南部等地区，主产于广西永福、临桂和龙胜等县。罗汉果通常生长在山间阴湿、风凉地带，同属植物共有7种，我国有4种，其中罗汉果、翅子罗汉果[S.siamensis(Craib)C.Jeffrey]均可入药，其果实的提取物对治疗呼吸系统和消化系统疾病有相近的功效。罗汉果中含有丰富的黄酮甙、甘露醇、维生素E等，在防癌、美容等方面有良好功效。这使得罗汉果的开发应用前景异常光明，市场前景广阔。

黄酮是一类重要的化合物，根据类黄酮化学结构进行分类，主要有黄酮醇(flavonols)、黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanoes)、黄烷醇(flananols)或儿茶酚(catechins)、花色昔(anthocyanins)、异黄酮(isoflavones)、二氢黄酮醉(dihydroflavonols)及查尔酮(chalcones)等8类。另外，还有一些其它类型的黄酮，如香豆素(coumarins)等。黄酮类化合物(flavonoids)是许多常用中草药的有效成分，除具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果。

随着对罗汉果研究的深入，罗汉果叶的研究也日益受到人们的关注。罗汉果叶来源充足，仅广西桂林的罗汉果种植面积已超过10000亩，每亩可产叶200公斤，但大量的罗汉果叶秋后割下后便扔掉或者焚烧，没有加以利用。在药理活性方面文献记载罗汉果叶可治疗廯症外，还对致病菌金黄色葡萄糖球菌、白色葡萄糖球菌、卡他双球菌有较强的抑制作用。罗汉果叶晒干后水煎服临床治疗慢性咽喉炎及慢性支气管炎。陈全斌等采用磷钼络合物法研究了罗汉果叶总黄酮提取物的抗氧化能力。从国内外的研究近况来看，有关罗汉果叶方面的研究，陈全斌等测定了其总黄酮含量并从水提取物中分离得到两个黄酮甙：山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-a-L-鼠李糖甙。但是，目前还没有从罗汉果叶中提取黄酮甙成分单体及其单体活性研究的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：采用合理的工艺条件从罗汉果叶中提取制备纯度较高的山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙；经测定，所得提取物具有良好的自由基清除活性。

本发明的技术方案：从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法为：取罗汉果叶，加10～30倍重量的水煮沸提取2～3次，每次提取50～100min，过滤，合并滤液，进大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用30％～75％乙醇或无水甲醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇或甲醇，于冰箱中放置20～30h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，即得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物。

前述山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比为20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙提取物。

优选的提取方法为：取罗汉果叶，加30倍重量的水煮沸提取3次，每次提取50min，过滤，合并滤液，进大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用30％～75％乙醇或无水甲醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇或甲醇，于冰箱中放置24h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物；将粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比为20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙提取物。

前述提取方法中，所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。

前述冰箱中的温度维持在4～10℃。

以上所述从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法提取得到的山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙提取物。

罗汉果叶中黄酮甙提取工艺的选择：

实验过程中，发明人发现利用乙醇-水体系得出的黄酮甙含量稍高于水煮沸条件下的黄酮甙含量，然而从节约药品、能源等方面考虑，决定采用水煮沸提取。并以温度(A)，液料比(B)，提取时间(C)，提取次数(D)进行四因素三水平正交实验，其实验结果如下：

表1四因素三水平正交实验

实验号

因素

Abs

	A	B	C/min	D
						1	60	1∶10	50	1	0.856
2	60	1∶20	100	2	1.193
						3	60	1∶30	150	3	1.411
4	80	1∶10	100	3	1.388
						5	80	1∶20	150	1	0.935
6	80	1∶30	50	2	1.458
						7	煮沸	1∶10	150	2	1.382
8	煮沸	1∶20	50	3	1.578
						9	煮沸	1∶30	100	1	1.169
K₁	3.46	3.626	3.892	2.96	K₁+K₂+K₃
						K₂	3.781	3.706	3.75	4.033
K₃	4.129	4.038	3.728	4.377
						平均K₁	1.153	1.209	1.297	0.987
平均K₂	1.26	1.235	1.25	1.344
						平均K₃	1.376	1.346	1.243	1.459
极差	0.223	0.137	0.054	0.472

由上表可知，四因素对罗汉果叶黄酮甙提取的影响主次顺序为：提取次数＞温度＞液料比＞提取时间，最优组合为A₃B₃C₁D₃，即液料比1∶30，煮沸提取3次，每次提取50min。

总结：本发明采用正交实验确定了从罗汉果叶中提取黄酮甙的最优提取条件，并从中制备出纯度大于60％的山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗品，收率为1.5％～2％；经过硅胶柱层析后，可得到纯度95％以上的精品。

与现有技术相比，本发明所提供的提取工艺简单，科学合理，可行性强，所得提取物山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的纯度高，粗提物纯度大于60％，收率1.5％～2％，经过硅胶柱层析后，纯度可达95％以上；且本发明提取所得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙具有良好的自由基清除活性，应用前景广阔。另外，利用本发明技术可对大量废弃的罗汉果叶加以充分利用，提高自然资源的利用率，减少浪费。

具体实施方式：

本发明的实施例1：从罗汉果叶中提取黄酮甙成分(山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙)的方法：取罗汉果叶100g，加30倍重量的水煮沸提取3次，每次提取50min，过滤，合并滤液，进D101型大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用75％乙醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，于4～10℃冰箱中放置24h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物；粗提物纯度65％(HPLC测定)，收率为2％。将粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比为20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得淡黄色针状晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙；经测定，其纯度为97.1％。

本发明的实施例2：从罗汉果叶中提取黄酮甙成分(山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙)的方法：取罗汉果叶，加20倍重量的水煮沸提取2次，每次提取80min，过滤，合并滤液，进D101型大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，于4～10℃冰箱中放置30h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物；粗提物纯度62％(HPLC测定)，收率为1.8％。将粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得淡黄色针状晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙；经测定，其纯度为95.8％。

本发明的实施例3：从罗汉果叶中提取黄酮甙成分(山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙)的方法：取罗汉果叶，加15倍重量的水煮沸提取3次，每次提取90min，过滤，合并滤液，进大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用无水甲醇洗脱，收集洗脱液并除去甲醇，于冰箱中放置20h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物；粗提物纯度63％(HPLC测定)，收率为1.5％。将粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙；经测定，其纯度为96.5％。

实验例：

1、产品验证

将以上实施例所得晶体产品进行测定，最终确定该化合物分子式为C₂₇H₃₀O₁₄，其结构式如下：

2、山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙自由基清除活性测定

(1)DPPH自由基清除活性测定

测定方法：

将不同摩尔浓度(3.46，6.92，10.38，13.84，17.3)x10^-6mol·ml^-1的样品溶液0.1ml，加到4ml w(DPPH)＝0.004％的乙醇溶液中。水浴28℃恒温，在515nm下测其吸光度，每10min测定一次，直至反应达到平衡(吸光度变化不大)，按以下公式计算清除率SC％值。

结果与讨论：

实验表明，当时间达到30min时，山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的清除活性基本达到平衡，故取t＝30min，SC％对时间作图，得到山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的IC₅₀值。

表2不同摩尔浓度山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的SC％(t＝30min)

根据SC％对时间t的线性图可知，其线性方程为Y＝-0.18+3.19075X(R²＝0.99217)，故当Y＝50时(即清除率SC＝50％)，得到X＝15.72，也即IC₅₀＝15.72x10^-6mol·ml^-1。可见山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙具有良好的DPPH自由基清除活性。

(2)ABTS自由基清除活性测定

测定方法：

将ABTS水溶液(7mM最终浓度)和K₂S₂O₈(2.45mM最终浓度)水溶液等体积混合后，置于暗处反应至少12h，用95％乙醇将上述ABTS溶液稀释至吸光度值为0.8±0.05(λ＝734)。

将0.1ml的不同浓度的山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙和1.9ml ABTS反应后，从第3分钟起在734nm下，测定吸光度值。

结果与讨论：

表3不同摩尔浓度山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的SC％(t＝3min)

根据SC％对时间t的线性图可知，其线性方程为Y＝10.92+5.68208X(R²＝0.99262)，故当Y＝50时(即清除率SC＝50％)，得到X＝6.88，也即IC₅₀＝6.88x10^-6mol·ml^-1。可见山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙具有良好的ABTS自由基清除活性。

总结：本发明测定了山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙的自由基清除活性。其中DPPH自由基清除率的IC₅₀＝15.72x10^-6mol·ml^-1，ABTS自由基清除率的IC₅₀＝6.68x10^-6mol·ml^-1。由此可见山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙具有良好的自由基清除活性。

Claims

1.从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法，其特征在于：取罗汉果叶，加10～30倍重量的水煮沸提取2～3次，每次提取50～100min，过滤，合并滤液，进大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用30％～75％乙醇或无水甲醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇或甲醇，于冰箱中放置20～30h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，即得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物。

2.根据权利要求1所述从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法，其特征在于：将山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比为20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙。

3.根据权利要求1或2所述从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法，其特征在于：取罗汉果叶，加30倍重量的水煮沸提取3次，每次提取50min，过滤，合并滤液，进大孔树脂吸附，水洗树脂至流出液无色，再用30％～75％乙醇或无水甲醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇或甲醇，于冰箱中放置24h，析出沉淀，沉淀用无水乙醇溶解，过滤，滤液蒸干，得山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙粗提物；将粗提物经过硅胶柱层析，用氯仿与甲醇体积比为20∶1～1∶1的溶液进行梯度洗脱，收集5∶1洗脱部位，放置，结晶，所得晶体即为山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙。

4.根据权利要求3所述从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法，其特征在于：所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。

5.根据权利要求3所述从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法，其特征在于：冰箱中的温度为4～10℃。

6.如要求1-5中任一项所述从罗汉果叶中提取黄酮甙成分的方法提取得到的山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙。