CN102653537B

CN102653537B - 从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法

Info

Publication number: CN102653537B
Application number: CN201210153124.4A
Authority: CN
Inventors: 杨阳; 孙连娜; 陈万生; 吴志军
Original assignee: 97 HOSPITAL OF PEOPLE'S LIBERATION ARMY
Current assignee: 97 HOSPITAL OF PEOPLE'S LIBERATION ARMY
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-05-17
Also published as: CN102653537A

Abstract

本发明公开了一种从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，属医药技术领域。具体方法是：头花蓼全草药材先用石油醚加热回流提取，弃去提取液；再用高浓度的乙醇水溶液浸泡，渗漉或加热回流提取后，减压浓缩制得流浸膏；流浸膏加水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩蒸干后进行硅胶柱色谱，先用石油醚∶乙酸乙酯=2∶1的洗脱液洗脱除去杂质，再用石油醚∶乙酸乙酯=1∶1的洗脱液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干后得浅绿色水飞蓟宾粗提物；此粗提物再进行硅胶柱色谱，方法同上，洗脱液减压浓缩过程中即有浅绿色水飞蓟宾粉末析出，经过滤、清洗、重析出，得到白色纯度大于98%水飞蓟宾粉末。本发明首次发现并优化了从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，无毒环保、不污染环境，操作简便、成本低廉，水飞蓟宾的得率和纯度高，方法易于推广。

Description

从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法

技术领域

本发明涉及一种从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，属医药技术领域。

背景技术

水飞蓟（Silybum marianum (L.) Gaertn.），为菊科（Compositae）水飞蓟属（Silybum）植物，又名水飞雉、奶蓟、老鼠筋，一年生或二年生草本，原产分布于欧洲、地中海地区、北非及亚洲中部，我国为引种栽培。瘦果入药，性味苦凉，有清热解毒、保肝利胆作用，主要用来治疗肝胆疾病，已有二千多年的历史[中国科学院中国植物志编辑委员会编，中国植物志，第78卷第1分册．北京：科学出版社，1987：161-162．国家药典委员会编．中华人民共和国药典（一部）．2005年版．北京：化学工业出版社，2005：56-56]。二十世纪六十年代末，德国学者Wagner H等对水飞蓟的保肝活性成分进行了研究，引起了人们的广泛重视。其主要活性成分为从果实中提取分离得到的一类黄酮木脂素化合物，称为水飞蓟素（silymarin），由水飞蓟宾（silibinin）、异水飞蓟宾（isosilybin）、水飞蓟亭（silychristin）和水飞蓟宁（silydianin）等四种同分异构体构成，其中水飞蓟宾含量最高，活性最好[Kvasnička F，Bíba B，Ševčík R．Analysis of the active components of silymarin．Journal of Chromatography A，2003，990(1-2)，239-245]。

水飞蓟宾，分子式C₂₅H₂₂O₁₁，分子量482，为类白色结晶性粉末，无臭、味微苦涩，有吸湿性。易溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇，略溶于氯仿，几乎不溶于水。天然植物提取的水飞蓟宾是一对非对映异构体，分别为水飞蓟宾A（Silibinin A）、水飞蓟宾B（Silibinin B），化学结构式如下。


		水飞蓟宾A（Silibinin A）	水飞蓟宾B（Silibinin B）

现代药理研究表明，水飞蓟宾具有明显的保护和稳定肝细胞的作用，用于治疗急慢性肝炎、肝硬化、肝中毒等病，对肝炎患者症状、肝功能均有明显的改善，具有稳定细胞及细胞内生物膜的作用，还具有一定的抗辐射的作用[Křen V，Walterová D．Silybin and silymarin-new effects and applications．Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký, Olomouc, Czechoslovakia，2005，149(1)：29-41]。由于水飞蓟宾在抗肝病毒及肝保护作用方面被认为是活性好、药效高、无副作用的最好抗肝病毒剂，被广泛应用于医药、保健品、食品和化妆品等产品中，显示出很好的开发潜力。近年来，纵观水飞蓟产品市场，国外水飞蓟的种植面积在减少，对中国水飞蓟素粗品的依赖在加强[徐德峰，张卫明，史劲松，等．国内水飞蓟资源利用现状与展望．食品研究与开发，2007，28（2）：157-161]。

随着国内外水飞蓟相关产品的广泛应用，水飞蓟宾产品供不应求，而获得水飞蓟宾主要有两种方法，一种为化学合成法，另一种为提取制备法。目前，文献报道的水飞蓟宾的提取制备方法均为从水飞蓟中得到：例如，专利[王琳，范淦彬．一种水飞蓟素的制备方法．CN 101759687A，2010.06.30．邸凤阁．在水飞蓟种皮中提取水飞蓟素的方法．CN 102219781A．2011.10.19．张彦龙，赵洪柱，曾伟民，等．一种从水飞蓟秸秆中提取水飞蓟总黄酮的方法．CN 102225085A，2011.10.26]为从水飞蓟果实、种皮或秸杆等不同部位中提取制备水飞蓟素、水飞蓟总黄酮木质素的方法，得到仅为含水飞蓟宾的混合物；专利[刘东锋，张翼，杨成东．一种水飞蓟宾的制备方法．CN101817816A．2010.09.01．戴军，武俊明，徐冰．一种高纯度水飞蓟宾及其制备方法．CN102174041A．2011.09.07]为从水飞蓟种子或种壳中提取纯化水飞蓟宾的方法；专利[朱占元，李斌，王春建．一种水飞蓟宾的提取方法．CN 101260105．2008.09.10]为从水飞蓟素中提取纯化水飞蓟宾的方法。然而，仅从水飞蓟这一种植物中提取制备水飞蓟宾很难满足实际需要，因此，急需扩大和开发水飞蓟宾提取制备的新资源。目前尚无文献报道从其它植物中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法。

头花蓼（Polygonum capitatum Buch.-Ham. ex D. Don），为蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum）植物，又名四季红、石莽草、红酸杆、太阳草、水绣球，多年生草本，主要产自我国江西、湖南、湖北、四川、贵州等地，多生于海拔600~3500米的山坡、山谷、湿地[中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志，第25卷第1分册．北京：科学出版社，1998：57-58]。头花蓼为贵州特有的苗药，全草入药，味苦、辛，性凉，归肾、膀胱经，具有清热利湿、解毒止痛、和血散瘀、利尿通淋的功效；民间常用全草或地上部位治疗泌尿系统感染、血尿、湿疹、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿痛、跌打损伤、痄腮、疮疡、腹泻、痢疾等症[江苏新医学院．中药大辞典，上册．上海：上海科学技术出版社，1986：611-611．贵州省医药监督管理局．贵州省中药材、民族药材质量标准，第1版．贵州：贵州科技出版社，2003：147-147]。

头花蓼主要化学成分为挥发油，酚酸类，黄酮类化合物等。实验表明头花蓼具有抗氧化活性，解热，镇痛，抗炎，抗菌作用。临床可用于治疗肾盂肾炎，促进排石等。以头花蓼为原料制成的中成药制剂“热淋清胶囊”、“热淋清颗粒”，已被遴选为国家中药保护品种，2002年进入国家基本药物目录，2004年进入国家基本医疗保险目录，临床应用广泛。本发明人的硕士学位论文[杨阳．甘西鼠尾草及头花蓼化学成分研究．上海：第二军医大学，2009]首次报道了头花蓼中含有水飞蓟宾等黄酮木素类化合物，但未阐明其具体的提取制备方法。

发明内容

本发明提供一种从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法。

本发明是以如下技术方案实现的：一种从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，具体步骤如下：

（ 1 ）制备头花蓼流浸膏。按常规将头花蓼干燥全草药材粗粉先用5倍体积的石油醚加热回流提取1-3次后，弃去提取液；再用80％-90%体积浓度的乙醇水溶液2倍体积浸泡，20倍体积渗漉或5倍体积加热回流提取1-3次，提取液减压浓缩至无醇味得头花蓼流浸膏，得率为25.0%~30.0%。

（ 2 ）制备水飞蓟宾粗提物。将上述制得的头花蓼流浸膏加3-4倍体积的水混悬，用10倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩蒸干后进行硅胶柱色谱，使用的柱色谱硅胶为100-200目，硅胶用量为上柱样品的7-10倍质量。先用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液洗脱，除去弱极性杂质，再用石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，石油醚:乙酸乙酯的洗脱液其体积均不少于6倍的硅胶量。洗脱液减压浓缩蒸干后得浅绿色水飞蓟宾粗提物，得率为0.4%~0.6%。化学成分研究表明此水飞蓟宾粗提物中主要含有水飞蓟宾，以及异水飞蓟宾、2,3-脱氢水飞蓟宾、水飞蓟亭、2,3-脱氢水飞蓟亭等黄酮木质素类化合物，还含有少量没食子酸乙酯、槲皮素等杂质。

（ 3 ）制备高纯度水飞蓟宾。将上述制得的水飞蓟宾粗提物再进行硅胶柱色谱，使用的柱色谱硅胶为100-200目或200-300目，硅胶用量为上柱样品的3-5倍质量。先用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液进行洗脱，除去其它黄酮木质素、没食子酸乙酯、槲皮素等杂质，再用石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，石油醚:乙酸乙酯的洗脱液其体积均不少于6倍的硅胶量。洗脱液减压浓缩过程中即有浅绿色水飞蓟宾粉末析出，经过滤、清洗、重析出，得到白色高纯度水飞蓟宾粉末，得率为0.8 ‰ ~ 1.0 ‰。

上述的提取液、萃取液或洗脱液减压浓缩时，温度均不超过65℃。

采用高效液相色谱法（HPLC）对该粉末进行纯度检测，测得水飞蓟宾纯度大于98%。进行质谱（MS）、核磁共振谱（¹H-NMR、¹³C-NMR）分析，根据所得的数据进行结构鉴定，确定为水飞蓟宾。

本发明的有益效果是：1、首次发现了从水飞蓟以外的植物，即头花蓼中得到水飞蓟宾的方法，开发了提取制备水飞蓟宾的新资源；2、提取制备过程中仅使用石油醚、乙酸乙酯、乙醇三种有机溶剂，无毒环保，不污染环境；3、色谱填料仅使用硅胶，操作相对简便、成本低廉，水飞蓟宾的得率和纯度高，方法易于推广。

附图说明

图1为本发明提取制备的高纯度水飞蓟宾的高效液相色谱图（HPLC）；

图2为本发明提取制备的高纯度水飞蓟宾的质谱图（MS）；

图3为本发明提取制备的高纯度水飞蓟宾的核磁共振氢谱图（¹H-NMR）；

图4为本发明提取制备的高纯度水飞蓟宾的核磁共振碳谱图（¹³C-NMR）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例 1 ：

头花蓼干燥全草药材2000g，切段，粉碎后过筛，粗粉用5倍体积的石油醚加热回流提取3次，每次1小时，滤去石油醚提取液。余下的粗粉干燥后，用80%体积浓度的乙醇水溶液2倍体积浸泡24小时，20倍体积渗漉提取。将渗漉提取液60℃减压浓缩至无醇味，得头花蓼流浸膏524g，得率为26.2%。

将上述制得的头花蓼流浸膏加3-4倍体积的水混悬后使总体积为1000ml，用10倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液60℃减压浓缩回收溶剂，蒸干后得乙酸乙酯萃取部位21.4g。乙酸乙酯萃取部位进行100-200目硅胶柱色谱，硅胶用量200g，先用1200ml石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液洗脱，再用1200ml石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，洗脱液60℃减压浓缩蒸干后即得浅绿色水飞蓟宾粗提物9.4g，得率为0.47%。

将上述制得的水飞蓟宾粗提物进行100-200目硅胶柱色谱，硅胶用量40g，先用250ml石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液洗脱，再用250ml石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，洗脱液减压浓缩中，析出浅绿色水飞蓟宾粉末，经过滤，滤出物用少量乙酸乙酯溶液清洗，再经重析出，得到白色高纯度水飞蓟宾粉末1.68g，得率为0.84 ‰。

纯度检测：使用Agilent 1100高效液相色谱仪对该水飞蓟宾粉末进行纯度检测（峰面积归一化法），色谱分析条件为：色谱柱，迪马公司diamonsil C18柱（5μ，250mm×4.6mm）；流动相，甲醇-水-冰醋酸=48:52:1；检测波长，287nm；柱温，35℃；流速，1.0ml/min。测得水飞蓟宾纯度为98.83%。高效液相色谱图见图1，图中，峰A、B为水飞蓟宾的一对非对映异构体。

理化鉴别：测得该粉末的熔点为167-168；与盐酸镁粉反应呈玫瑰红色，与氢氧化钠溶液反应呈深黄色。

结构鉴定：使用Varian Mat-212质谱仪和Bruker-speckospin AC-600P核磁共振仪对该粉末进行结构鉴定。

ESI-MS：m/z 483.1[M+H]⁺，505.1[M+Na]⁺，521.1[M+K]⁺，481.1[M-H]^－。质谱图见图2。

¹H-NMR（600MHz，DMSO-d ₆，δ ppm）：11.88（1H，s，5-OH），10.82（1H，br s，7-OH），9.12（1H，br s，4″-OH），7.09（1H，d，J=3.6Hz，H-2′），7.01（1H，d，J=1.8Hz，H-2″），7.00（1H，dd，J=3.6，7.8Hz，H-6′），6.97（1H，d，J=7.8Hz，H-5′），6.87（1H，dd，J=1.8，7.8Hz，H-6″），6.81（1H，d，J=7.8Hz，H-5″），5.91（1H，d，J=1.8Hz，H-8），5.87（1H，d，J=1.8Hz，H-6），5.08（1H，d，J=11.4Hz，H-2），4.91（1H，d，J=7.8Hz，H-7″），4.60（1H，J=11.4Hz，H-3），4.17（1H，ddd，J=3.0，4.2，7.8Hz，H-8″），3.78（3H，s，3″-OCH₃），3.55（1H，dd，J=4.2，12.0Hz，H-9″α），3.35（1H，dd，J=3.0，12.0Hz，H-9″β）。¹³C-NMR（150MHz，DMSO-d ₆，δ ppm）：198.1（C-4），167.3（C-7），163.8（C-9），162.9（C-5），148.1（C-3″），147.5（C-4″），144.1（C-4′），143.7（C-3′），130.5（C-1），128.0（C-1″），121.7（C-6′），121.0（C-6″），117.0（C-2′），116.8（C-5′），115.8（C-5″），112.3（C-2″），100.9（C-10），96.5（C-8），95.5（C-6），83.0（C-2），78.6（C-8″），76.3（C-7″），72.0（C-3），60.7（C-9″），56.2（3″-OCH₃）。核磁共振氢谱图见图3，核磁共振碳谱图见图4。

综合以上MS、¹H-NMR、¹³C-NMR数据与文献[Vladimír K，Anacleto M，Petr S，Vladimír H，Véra P，Nicoletta C．Glucosylation of silybin by plant cell cultures of Papaver somniferum var. setigerum．Phytochemistry，1998，47(2)，217-220]对照一致，确定为水飞蓟宾。

实施例 2 ：

头花蓼干燥全草药材2000g，切段，粉碎后过筛，粗粉用5倍体积的石油醚加热回流提取3次，每次1小时，滤去石油醚提取液。余下的粗粉干燥后，用85%体积浓度的乙醇水溶液2倍体积浸泡24小时，5倍体积加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液60℃减压浓缩至无醇味，得头花蓼流浸膏582g，得率为29.1%。

将上述制得的头花蓼流浸膏加3-4倍体积的水混悬后使总体积为1000ml，用10倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液60℃减压浓缩回收溶剂，蒸干后得乙酸乙酯萃取部位26.0g。乙酸乙酯萃取部位进行100-200目硅胶柱色谱，硅胶用量200g，先用1300ml石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液洗脱，再用1300ml石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，洗脱液60℃减压浓缩蒸干后即得浅绿色水飞蓟宾粗提物10.2g，得率为0.51%。

将上述制得的水飞蓟宾粗提物进行200-300目硅胶柱色谱，硅胶用量40g，先用280ml石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液洗脱，再用280ml石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，洗脱液减压浓缩中，析出浅绿色水飞蓟宾粉末，经过滤，滤出物用少量乙酸乙酯溶液清洗，再经重析出，得到白色高纯度水飞蓟宾粉末1.84g，得率为0.92 ‰。

纯度检测：采用实施例 1中的高效液相色谱法对该粉末进行纯度检测（峰面积归一化法），测得水飞蓟宾纯度为98.56%。

理化鉴别和结构鉴定：方法、步骤及其结果同实施例 1。

Claims

1.一种从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，包括如下步骤：

（1）制备头花蓼流浸膏：按常规将头花蓼干燥全草药材粗粉先用5倍体积的石油醚加热回流提取1-3次后，弃去提取液；再用80％-90%体积浓度的乙醇水溶液2倍体积浸泡，20倍体积渗漉或5倍体积加热回流提取1-3次，提取液减压浓缩至无醇味得头花蓼流浸膏；

（2）制备水飞蓟宾粗提物：将上述制得的头花蓼流浸膏加3-4倍体积的水混悬，用10倍体积的乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩蒸干后进行硅胶柱色谱，先用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液洗脱，除去弱极性杂质，再用石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干后得浅绿色水飞蓟宾粗提物；

（3）制备高纯度水飞蓟宾：将上述制得的水飞蓟宾粗提物再进行硅胶柱色谱，先用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱液进行洗脱，除去其它黄酮木质素、没食子酸乙酯、槲皮素等杂质，再用石油醚:乙酸乙酯=1:1的洗脱液洗脱，洗脱液减压浓缩过程中即有浅绿色水飞蓟宾粉末析出，经过滤、清洗、重析出，得到白色纯度大于98%水飞蓟宾粉末；

上述提取液、萃取液或洗脱液减压浓缩时，温度均不超过65℃。

2.根据权利要求l所述的从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，其特征在于制备水飞蓟宾粗提物时，使用的柱色谱硅胶为100-200目，硅胶用量为上柱样品的7-10倍质量。

3.根据权利要求l所述的从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，其特征在于制备高纯度水飞蓟宾时，使用的柱色谱硅胶为100-200目或200-300目，硅胶用量为上柱样品的3-5倍质量。

4.根据权利要求1所述的从头花蓼全草中提取制备高纯度水飞蓟宾的方法，其特征在于制备水飞蓟宾粗提物、高纯度水飞蓟宾时，使用石油醚:乙酸乙酯的洗脱液体积均不少于6倍的硅胶量。