CN112592337B - 一种牛尾蒿黄酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种牛尾蒿黄酮类化合物及其制备方法和用途，涉及对天然植物中具有药用活性的新成分的制备及应用领域，该黄酮类化合物分子式为C22H22O8，能用于制备美白剂，制备止血产品或药物，也用于制备抗氧化食品、药品、化妆品或保健品；其制备方法包括：将牛尾蒿药材经煎煮过滤、搅拌浓缩、煎煮浓缩和干燥后，制得牛尾蒿干膏；再采用乙醇对牛尾蒿干膏进行超声提取后，用乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂对所得牛尾蒿乙醇提取物萃取，并对所得粗提物进行大孔树脂分离、硅胶柱层析、反相柱层析和凝胶柱层析，即得。本发明提供的黄酮类化合物从牛尾蒿中超声提取得到的，药效作用强、毒副作用小，具有抗氧化作用、美白活性和止血促凝血效果。

Description

一种牛尾蒿黄酮类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于对天然植物中具有药用活性的新成分的制备及应用领域，具体涉及一种牛尾蒿黄酮类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
牛尾蒿（学名：Artemisia dubia Wall. ex Bess.），别名普尔芒那保、其灰称达玛、达玛嘎、普尔芒。牛尾蒿是菊科蒿属牛尾蒿种的一种多年生草本植物。生长于2600-4300m的山坡、荒地、灌丛、林间及草原。分布于全国大部分省区。传统医药以其叶入药，主治慢性气管炎。牛尾蒿可清热解毒、杀虫利湿。主治虫病，疫疽，皮肤病，咽喉病等，具有止咳平喘、祛痰、抗炎、抗菌、抗病毒、杀虫、抗疟疾、抗肿瘤、抗氧化性和保肝等作用。
《蓝琉璃》：“抗菌解毒、治肿块及疮疡。”
《晶珠本草》：“消炎、治虫病。”
《新编藏药配方》：“治脑炎等炎症及寄生虫引起的肠绞痛、疮疡等症。”
目前牛尾蒿的药用方式主要是用煎煮法制备牛尾蒿浸膏，再使用牛尾蒿浸膏与其他药材进行混合制药。例如用牛尾蒿浸膏制备藏药仁青常觉。
然而现有技术中提取的牛尾蒿浸膏储存麻烦，存在不方便运输储存、易滋生微生物、不易精确控制入药量、标准化水平低下、药物的稳定性和有效性有待提高等问题，这些问题将严重制约藏医药现代化建设。因此，如何提高牛尾蒿药物的稳定性与有效性，使其制品便于储存运输，提高藏医药标准化水平，是目前有待解决的技术问题之一。
此外，目前已知的牛尾蒿全草主要有效成分为：挥发油、黄酮、香豆素、单萜类、倍半萜类、三萜类、苯丙素类、酚类、皂苷、鞣质、蛋白质、糖类、油脂等化学成分。其中牛尾蒿挥发油中的含氧化合物D-匙叶枝油烯醇祛痰平喘作用尤为显著和有效。传统的黄酮类化合物包括查尔酮、黄酮、异黄酮和黄烷酮四大结构骨架，因为其结构的特殊性，使得其在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏，以及调节免疫、心血管与内分泌等方面具有良好的生物活性，也因此在医药食品等方面得到了广泛的应用。其中，科研工作者对查尔酮与黄烷酮化合物投入了更大的研究热情，导致对查尔酮与黄烷酮的合成方法报导很多，但是对此类化合物的生物活性的开发依然有待加强。目前从牛尾蒿中分离鉴定的黄酮类化合物，主要有5,8,3′,5′-四羟基黄烷酮、5,8,2′-三羟基-5′-甲氧基黄烷酮和5,7,4′-三羟基-3′,5′-二甲氧基黄烷酮等。而本申请还提供了一种从牛尾蒿中得到的黄酮类化合物和该化合物生理活性方面的研究，能进一步加强牛尾蒿的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，所得产物黄酮类化合物具有抗氧化作用、美白活性和止血促凝血效果。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，包括：
将牛尾蒿药材加水进行煎煮过滤，得到过滤药液；
将上述过滤药液进行搅拌浓缩，得到浸膏；
将上述浸膏进行煎煮浓缩，并根据上述浸膏的密度变化控制煎煮温度，得到干膏半成品；
将上述干膏半成品静置后取出，进行干燥，得到牛尾蒿干膏；
采用乙醇对上述牛尾蒿干膏进行超声提取后，制得牛尾蒿乙醇提取物；
对上述牛尾蒿乙醇提取物用乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂进行萃取，制得粗提物；
对上述粗提物进行HP20大孔树脂分离、硅胶柱层析、C18反相制备柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析，即得上述黄酮类化合物；
上述乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂中乙酸乙酯和聚乙二醇的体积比为2-5:1，上述聚乙二醇的平均分子量为400-2000。通过上述技术方案，利用超声提取技术和萃取、分离纯化的步骤，从牛尾蒿中分离出具有特定结构式的黄酮类化合物，提取方法简单易行，目标产物得率和原料有效利用率高；所得产物具有抗氧化作用、美白活性和止血促凝血效果，提供了牛尾蒿的新的生物利用途径，具有推广价值。
在一些实施方案中，超声提取所用乙醇的体积浓度为70-90%，料液比为1g:150-200mL；上述超声提取的频率为35-60kHz，功率为200-400w，提取次数为2-3次，单次提取时间为30-60min。
在一些实施方案中，HP20大孔树脂分离步骤收集体积百分数为35%、45%、60%乙醇洗脱液；上述硅胶柱层析步骤收集氯仿:甲醇体积比为10:1的洗脱液；上述C18反相制备柱层析步骤收集体积百分数为65%的甲醇洗脱液。
优选地，牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，具体实施步骤如下：
1）如图6所示，向牛尾蒿药材中加入上述牛尾蒿药材的药材量12-14倍量的水中进行第一次煎煮过滤，煎煮温度为180-200℃，煎煮时间110-130min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅰ和药液Ⅰ；向上述药渣Ⅰ中加入上述药材量6-8倍量的水中进行第二次煎煮过滤，煎煮温度为180-200℃，煎煮时间10-30min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅱ和药液Ⅱ；将上述药液Ⅰ和上述药液Ⅱ混合在一起得到上述过滤药液；
2）将上述过滤药液进行搅拌浓缩，检测上述过滤药液的密度，当上述过滤药液的密度达到1.04g/ml以上，则浓缩完成，得到浸膏；优选的，浓缩温度为180-200℃，浓缩时间为70-90min，搅拌间隔时间为10min；
3）如图7所示，将上述浸膏在180-200℃的煎煮温度下进行煎煮浓缩并搅拌，检测上述浸膏的密度；并根据上述浸膏的密度变化下调上述煎煮温度；当上述浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成，得到干膏半成品；
优选地，煎煮浓缩的初始温度为180-200℃；上述根据浸膏的密度变化控制上述煎煮温度，具体步骤为：
当煎煮40-60min、每10min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.10g/ml时，控制煎煮温度下降10-20℃；
当煎煮30-50min、每10min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.18g/ml时，控制煎煮温度下降20-40℃；
当煎煮15-25min、每10min搅拌一次后，浸膏的密度不低于1.21g/ml时，控制煎煮温度下降5-15℃；
继续煎煮5-15min、持续搅拌至浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成；
4）将上述干膏半成品静置5-10h，然后进行干燥，得到牛尾蒿干膏；上述干燥方式为电热鼓风干燥或真空干燥或自然阴干；优选的，上述电热鼓风干燥的干燥温度为60-80℃，干燥时间为4-8d；
5）向牛尾蒿干膏中加入体积浓度为70-90%的乙醇溶液，超声提取，合并每次提取所得滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液，再将浓缩液置于-80℃冰箱过夜后，冷冻干燥，得到牛尾蒿乙醇提取物；
6）取牛尾蒿乙醇提取物用水溶解，然后用乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂萃取3-5次，合并萃取液，于45-60℃下减压回收溶剂，所得粗提物备用；以不同极性的溶剂形成混合的两相体系，然后利用溶解差异性进行精确萃取，能更有效地将目标产物尽可能多的萃取出来，有利于提高目标产物得率和原料有效利用率；
7）将粗提物用去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比为1:6-9，上样后用2倍柱体积的10%、25%、35%、45%、60%、75%、95%乙醇-水溶液（v/v）梯度洗脱，然后收集并合并35%、45%、60%乙醇洗脱液进行减压蒸干，即得总提物；
8）将总提物用去离子水溶解，过滤后进行硅胶柱层析，用体积比分别为20:1、15:1、10:1、5:1、1:1的氯仿:甲醇混合液进行梯度洗脱，分别得到5个部位，然后将其中氯仿:甲醇体积比为10:1的洗脱液合并，再用C18反相制备柱进行层析，用体积百分数为20%、45%、65%、90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，将其中65%甲醇洗脱液再经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用100%乙醇洗脱，去除溶剂，即得到上述黄酮类化合物。
本申请中先将牛尾蒿药材制成牛尾蒿干膏，再从牛尾蒿干膏中提取得到黄酮类化合物，其中间产物牛尾蒿干膏能代替现有技术中的牛尾蒿浸膏使用或与其他药物进行混合制药，例如用本申请提供的牛尾蒿干膏代替牛尾蒿浸膏制备藏药二十五味竺黄散。其主要具备以下几点优势：
储存优势：牛尾蒿干膏能够极大程度方便储存，增加储存时间，提高原药材的利用率。避免了浸膏储存麻烦，容易滋生微生物，易变质等的缺陷；
运输优势：牛尾蒿干膏可方便运输，降低在运输过程中的损耗。同时可在保证药材质量的前提下增加运输距离与运输时长；
用药精确：牛尾蒿干膏能够做到按处方精确用药，精准控制用药量，用药浓度等各种参数，以保证药品质量均一与稳定；以上几点优势均有益于保证藏药药材的稳定性与有效性，提高产品质量，保证药品质量均一稳定。
本发明的再一个目的还在于提供一种从牛尾蒿干膏中超声提取得到的，药效作用强、毒副作用小，具有抗氧化作用、美白活性和止血促凝血效果的牛尾蒿黄酮类化合物。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种牛尾蒿黄酮类化合物，由上述的制备方法制得，上述黄酮类化合物具有如下结构式：
Figure 836876DEST_PATH_IMAGE001
。该化合物的分子式为：C22H22O8，分子量 为414.41。该化合物是从牛尾蒿药材中分离得到的，在常温下为黄色结晶。该化合物中具有 C6-C3-C6的结构，基本骨架为黄烷酮结构。本发明黄酮类化合物还具有有效成分清楚、药效 作用强、毒副作用小、服用剂量小、质量可控的优点。
通过对上述黄酮类化合物的生理活性进行检测，得到如下发现：
1）该黄酮类化合物具有抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成的效果，表现出美白活性；
2）该黄酮类化合物具有止血、促凝血效果；
3）该黄酮类化合物具有清除自由基的能力，表现出良好的抗氧化活性。
基于上述发现的黄酮类化合物的生理活性，本发明的另一个目的还在于提供上述从牛尾蒿中提取得到的牛尾蒿黄酮类化合物的用途，具体如下：
1）该牛尾蒿黄酮类化合物在制备美白剂中的用途；
2）该牛尾蒿黄酮类化合物在制备止血产品或药物中的用途；
3）该牛尾蒿黄酮类化合物在制备抗氧化食品、药品、化妆品或保健品中的用途。
本发明由于采用了利用超声提取技术和萃取、分离纯化的步骤，从牛尾蒿中分离出具有特定结构式的黄酮类化合物，因而具有如下有益效果：1）该制备方法目标产物得率和原料有效利用率高，提供了牛尾蒿的新的生物利用途径，具有推广价值；2）制得的具有黄烷酮骨架的黄酮类化合物能通过抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素生成，具有美白活性；还具有止血、促凝血效果；还表现出清除自由基的能力和抗氧化活性；3）本发明制得的黄酮类化合物具有多种用途，如制备美白剂，制备止血产品或药物，制备抗氧化食品、药品、化妆品或保健品，且具有有效成分清楚、药效作用强、毒副作用小、质量可控的优点，有利于精准控制用药量，提高深加工产品（食品、药品、化妆品或保健品）的稳定性和有效性；4）本发明制备的牛尾蒿干膏可以替代牛尾蒿浸膏使用，具备方便储存、便于运输、容易推广、入药精确、稳定性好、标准化高、容易把控药品安全性有效性等优势，且制备方法简单易推广，能提高药品的稳定性和有效性。
因此，本发明是一种具有抗氧化作用、美白活性和止血促凝血效果的牛尾蒿黄酮类化合物及其制备方法和用途。
附图说明
图1为不同物质的浓度与酪氨酸酶抑制率的关系测定结果，A-实施例2，B-熊果苷；横坐标为浓度（单位：g/L）；纵坐标为抑制率（单位：%）；
图2为不同物质的浓度与黑色素生成抑制率的关系测定结果；A-实施例2，B-熊果苷；横坐标为浓度（单位：mg/L）；纵坐标为抑制率（单位：%）；
图3为不同物质的浓度与DPPH的清除率的关系测定结果；A-实施例2，C-抗坏血酸；横坐标为浓度（单位：μmol/L）；纵坐标为清除率（单位：%）；
图4为不同物质与酪氨酸酶抑制率、黑色素生成抑制率的关系测定结果；a-酪氨酸酶抑制率，b-黑色素生成抑制率；横坐标为组别，纵坐标为抑制率（单位：%）；
图5为不同物质与DPPH的清除率的关系测定结果；横坐标为组别，纵坐标为清除率（单位：%）；
图6为本发明中牛尾蒿浸膏制备的工艺流程图；
图7为本发明中牛尾蒿干膏制备的工艺流程图；
图8为实施例1中浸膏的密度随温度变化曲线图；横坐标为密度（单位：g/mL）；纵坐标为温度（单位：℃）；
其中组别标记为：Z0-空白组，Z1-实验组1，Z2-实验组2，Z3-实验组3，Z4-对照组1，Z5-对照组2。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
在具体实施场景中，具体的，本申请中牛尾蒿药材取菊科蒿属牛尾蒿种植物-牛尾蒿的干燥地上部分；
在具体实施场景中，具体的，如药物或保健品是通过将有效剂量的黄酮类化合物作为有效成分与辅料混合并制成适当剂型的药物。给药途径包括但不局限于：外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘膜、脑室内)。
本发明中适用于黄酮类化合物的辅料包括但不仅限于填充剂、润滑剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂。粘合剂包含糖浆、明胶、纤维素及其衍生物或聚乙烯吡咯烷酮。填充剂包含乳糖、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐或山梨醇。润滑剂包含硬脂酸镁、滑石粉、硼酸、氢化植物油或聚乙二醇。崩解剂包含淀粉及其衍生物或聚乙烯吡咯烷酮。湿润剂包含十二烷基硫酸钠、水或醇。抗氧剂包含亚硫酸钠或二丁基苯酸。抑菌剂包含0.5%苯酚或0.5%三氯叔丁醇。调节剂包含盐酸、枸橼酸(盐)或氢氧化钾(钠)。乳化剂包含聚山梨酯-80、卵磷酯或豆磷脂。增溶剂包含吐温-80或甘油。
作为上述方案的改进，在制备总提物的步骤中，向洗脱用溶剂乙醇-水溶液中添加巯基丁二酸和马来酸，上述巯基丁二酸和马来酸与乙醇的重量比分别为：0.05-0.5:8和0.1-0.5:13。由于粗提物中包括目标产物在内的部分黄酮类化合物含有交叉共轭体系，在洗脱时较活泼的电荷容易发生转移，使得这类化合物稳定性降低而不易富集，巯基丁二酸和马来酸的存在可能是协同钝化电子而未发生转移效应，增强了目标产物在体系中的分散稳定性，从而增加目标产物的富集效果，最终提高了目标产物的得率。
作为本发明技术方案的另一种改进，将本发明中的牛尾蒿黄酮类化合物与一种沙棘提取物联合使用后，能显著增强牛尾蒿黄酮类化合物在美白、抗氧化和止血促凝血方面的效果。优选的，上述沙棘提取物中包括含量不低于95wt%的白雀木醇。更优选地，联合使用时，牛尾蒿黄酮类化合物和白雀木醇的重量比为3-5:1。
本发明及实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。
应当理解，前面的描述应被认为是说明性或示例性的而非限制性的，本领域普通技术人员可以在所附权利要求的范围和精神内进行改变和修改。特别地，本发明覆盖了具有来自上文和下文上述的不同实施方案的特征的任何组合的其他实施方案，而本发明的范围并不限制于在以下具体实例中。
实施例1：
一种牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，包括以下具体步骤：
1）向2.5kg牛尾蒿药材中加入上述32L的水，在500L夹层锅中进行第一次煎煮过滤，煎煮温度为180℃，煎煮时间120min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅰ和药液Ⅰ；向上述药渣Ⅰ中加入18L的水中进行第二次煎煮过滤，煎煮温度为180℃，煎煮时间30min，每20min搅拌一次，经100目筛过滤，得到药渣Ⅱ和药液Ⅱ；将药渣Ⅱ废弃，再将上述药液Ⅰ和上述药液Ⅱ混合在一起得到上述过滤药液；
2）将上述过滤药液进行搅拌浓缩，检测上述过滤药液的密度，当上述过滤药液的密度达到1.04g/ml以上，则浓缩完成，得到浸膏；优选的，浓缩温度为190℃，浓缩时间为80min，搅拌间隔时间为10min；
3）将上述浸膏进行煎煮浓缩并搅拌，检测上述浸膏的密度；并根据上述浸膏的密度变化下调上述煎煮温度；当上述浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成，得到干膏半成品；具体地，煎煮浓缩的初始温度为180℃；上述根据浸膏的密度变化控制上述煎煮温度，具体步骤为：
当浸膏的密度达到1.10g/ml时，调节煎煮温度下降为160℃，期间每10min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.18g/ml时，调节煎煮温度下降为150℃，期间每10min搅拌一次；
当浸膏的密度达到1.21g/ml时，调节煎煮温度下降为140℃，期间每10min搅拌一次；
继续煎煮，持续搅拌至浸膏无蒸汽冒出时，则煎煮浓缩完成；浸膏的密度随温度变化曲线图如图8所示；
4）将上述干膏半成品静置6h后取出，进行电热鼓风干燥，干燥温度为70℃，干燥时间为7d，干燥完成后收膏，得到牛尾蒿干膏；
5）向牛尾蒿干膏中加入体积浓度为85%的乙醇溶液，料液比为1g:150mL，然后在频率为50kHz、功率为300w的条件下超声提取3次，单次提取时间为45min，合并每次提取所得滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液，再将浓缩液置于-80℃冰箱过夜后，冷冻干燥，得到牛尾蒿乙醇提取物；
6）取牛尾蒿乙醇提取物用水溶解，然后用乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂萃取4次，合并萃取液，于50℃下减压回收溶剂，所得粗提物备用；上述乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂中乙酸乙酯和聚乙二醇的体积比为3.5:1，上述聚乙二醇的平均分子量为1000；
7）将粗提物用去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比为1:7，上样后用2倍柱体积的10%、25%、35%、45%、60%、75%、95%乙醇-水溶液（v/v）梯度洗脱，然后收集并合并35%、45%、60%乙醇洗脱液进行减压蒸干，即得总提物；
8）将总提物用去离子水溶解，过滤后进行硅胶柱层析，用体积比分别为20:1、15:1、10:1、5:1、1:1的氯仿:甲醇混合液进行梯度洗脱，分别得到5个部位，然后将其中氯仿:甲醇体积比为10:1的洗脱液合并，再用C18反相制备柱进行层析，用体积百分数为20%、45%、65%、90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，将其中65%甲醇洗脱液再经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用100%乙醇洗脱，去除溶剂，即得到上述黄酮类化合物，其得率为3.12mg/g。
实施例2：
一种牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，包括以下具体步骤：
1）将2.5kg牛尾蒿药材粉碎至过100目筛，然后向牛尾蒿中加入体积浓度为85%的乙醇溶液，料液比为1g:150mL，然后在频率为50kHz、功率为300w的条件下超声提取3次，单次提取时间为45min，合并每次提取所得滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液，再将浓缩液置于-80℃冰箱过夜后，冷冻干燥，得到牛尾蒿药材的乙醇提取物；
2）取牛尾蒿药材的乙醇提取物用水溶解，然后用乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂萃取4次，合并萃取液，于50℃下减压回收溶剂，所得粗提物备用；上述乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂中乙酸乙酯和聚乙二醇的体积比为3.5:1，上述聚乙二醇的平均分子量为1000；
3）将粗提物用去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比为1:7，上样后用2倍柱体积的10%、25%、35%、45%、60%、75%、95%乙醇-水溶液（v/v）梯度洗脱，然后收集并合并35%、45%、60%乙醇洗脱液进行减压蒸干，即得总提物；
4）将总提物用去离子水溶解，过滤后进行硅胶柱层析，用体积比分别为20:1、15:1、10:1、5:1、1:1的氯仿:甲醇混合液进行梯度洗脱，分别得到5个部位，然后将其中氯仿:甲醇体积比为10:1的洗脱液合并，再用C18反相制备柱进行层析，用体积百分数为20%、45%、65%、90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，将其中65%甲醇洗脱液再经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用100%乙醇洗脱，去除溶剂，即得到上述黄酮类化合物，其得率为4.95mg/g。
实施例3：
牛尾蒿黄酮类化合物的结构鉴定：综合使用IR、MS、1H-NMR、13C-NMR等技术对物质结构进行分析。实验样品为实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物。
测定结果：牛尾蒿黄酮类化合物：浅黄色结晶，准分子离子峰415.4125[M+H]+，结合1H-NMR和13C-NMR推断其分子式为C22H22O8。红外图谱(IR)：3423.4cm-1处吸收峰显示有羟基存在，2015.3cm-1处吸收峰显示有-C=C-存在，1703.1cm-1处吸收峰显示有苯环存在，1146.5cm-1处吸收峰显示有C-O存在。
利用1H-NMR和13C-NMR谱归属了氢和碳的信号，信号归属如下：
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ7.03(1H,s,J=1.5Hz,CH),6.81(1H,s,J=7.5Hz,CH),6.81(1H,s,J=7.5,1.5Hz,CH),6.14(1H,s,J=1.0Hz,H),6.07(2H,s,CH2),5.59-5.61(2H,d,J=7.0Hz,CH),5.35(1H,s,OH),3.83(3H,s,-OCH3),2.80(1H,s,OH),2.16(3H,s,CH3),1.82(6H,s,J=1.0Hz,CH3)；
13C-NMR(DMSO-d6,125MHz,ppm):δ196.98(C-3),149.02(C-3’),147.72(C-4’),147.63(C-8),145.47(C-5),142.81(C-9),136.33(C-6),134.59(-OC=C-),128.38(C-1’),126.85(C-7),119.35(C-6’),117.56(-C=C-),109.59(C-2’),108.93(C-4),108.51(C-5’),101.25(-OCO-),87.71(C-1),71.96(C-2),60.32(-OCH3),19.91(-CH3),13.96(-CH3),10.23(-CH3)。
结构鉴定过程如下：根据化合物的1H-NMR图谱，首先判断氘代试剂种类：1H-NMR在2.55、3.43出现信号，13C-NMR在39ppm处出现信号，为DMSO-d6的氢谱溶剂峰、水峰以及碳谱溶剂峰。结合其13C-NMR信号：在21个碳信号中，15个归属为黄烷酮类化合物骨架，初步推断化合物为黄烷酮类化合物。其中，甲氧基的端基氢δ3.83与黄烷酮C-8（δ147.63）有远程相关，证明C-8位连接有甲氧基；甲基的端基氢δ2.16与黄烷酮C-7（δ126.85）有远程相关，证明C-7位连接有甲基；基团-OC=C-的端基氢δ6.14与黄烷酮C-6（δ136.33）有远程相关，证明C-6位连接有基团-OC=C-；羟基的端基氢δ5.35与黄烷酮C-5（δ145.47）有远程相关，证明C-5位连接有羟基；羟基的端基氢δ2.81与黄烷酮C-2（δ71.96）有远程相关，证明C-2位连接有羟基；基团-OCO-的端基氢δ6.07与黄烷酮C-3’和C-4’有远程相关，证明C-3’和C-4’位连接有基团-OCO-。
通过结构鉴定，得到牛尾蒿黄酮类化合物的结构式如下：
Figure 161153DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例4：
本实施例工作时，对牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法进行了改进，具体措施如下：在制备总提物的步骤3）中，将粗提物用去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比为1:7，上样后用2倍柱体积的10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%乙醇-水溶液（v/v）梯度洗脱，然后收集并合并30%、40%、50%乙醇洗脱液进行减压蒸干，即得总提物；上述洗脱用溶剂乙醇-水溶液中添加有巯基丁二酸和马来酸，上述巯基丁二酸和马来酸与乙醇的重量比分别为0.08:8和0.15:13；其他步骤和参数与实施例2中一致，制得牛尾蒿黄酮类化合物，其得率为7.67mg/g。本实施例中目标产物的得率得到了显著提升。
实施例5：
本实施例工作时，牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法如下：在制备总提物的步骤3）中，将粗提物用去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比为1:7，上样后用2倍柱体积的10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%乙醇-水溶液（v/v）梯度洗脱，然后收集并合并30%、40%、50%乙醇洗脱液进行减压蒸干，即得总提物；上述洗脱用溶剂乙醇-水溶液中添加有巯基丁二酸，上述巯基丁二酸与乙醇的重量比为0.08:8，未添加马来酸；其他步骤和参数与实施例2中一致，制得牛尾蒿黄酮类化合物，其得率为5.24mg/g。
实施例6：
本实施例工作时，牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法如下：在制备总提物的步骤3）中，将粗提物用去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比为1:7，上样后用2倍柱体积的10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%乙醇-水溶液（v/v）梯度洗脱，然后收集并合并30%、40%、50%乙醇洗脱液进行减压蒸干，即得总提物；上述洗脱用溶剂乙醇-水溶液中添加有马来酸，上述马来酸与乙醇的重量比为0.15:13，未添加巯基丁二酸；其他步骤和参数与实施例2中一致，制得牛尾蒿黄酮类化合物，其得率为4.26mg/g。
实施例7：
对牛尾蒿黄酮类化合物的美白活性研究
试验方法：取实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物为实验样品，以熊果苷为对照组样品。
1）酪氨酸酶活性抑制试验：在样品管和样品对照管中各加入1mL不同质量浓度的样品溶液，阳性和阴性对照管以磷酸缓冲液代替，每一质量浓度设3个重复。在样品管和阳性对照管中加入0.5mL酪氨酸酶溶液(酶活单位125U/mL)，样品对照和阴性对照管以0.5mL磷酸缓冲液(pH＝6.8)代替，振摇所有试管，使样品和酪氨酸酶充分混匀，37℃水槽孵育10分钟，加入2mL的0.03wt%酪氨酸溶液，反应10分钟，即刻在475nm处测定吸光度。抑制率I(%)＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100%，式中：T0-样品溶剂对照；T-样品对照；C-阳性对照；C0-阳性对照溶剂对照。计算半数抑制率(IC50)。IC50值定义为抑制率为50%时所需酪氨酸酶抑制剂的浓度。计算方法为以样品的浓度对酪氨酸酶的抑制率作图并进行拟合，读取计算IC50值。抑制率与抑制剂浓度的关系测定结果如图1所示。
图1为不同物质的浓度与酪氨酸酶抑制率的关系测定结果，A-实施例2，B-熊果苷。结果显示，实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物和熊果苷均表现出抑制酪氨酸酶活性的作用，且抑制率随抑制剂的质量浓度的提高而上升。经计算可得，牛尾蒿黄酮类化合物的IC50为45.7mg/L，熊果苷的IC50为4.62g/L，实施例2所得的牛尾蒿黄酮类化合物具有优异的抑制酪氨酸酶活性的效果。
2）B16黑色素生成抑制试验：B16黑色素细胞以1×105密度培养在96孔板中，经24h后换液，添加不同浓度的药物，每一质量浓度设3个重复。37℃、5%CO2条件下孵育72h后，弃去上清液。每孔加入2.5g/L胰蛋白酶消化液1mL于室温下消化5min。加入4mL RPMI-1640完全培养基中止消化，并吹打成单细胞悬液。取0.5mL做细胞计数，其余细胞悬液与1500r/min离心10min，弃去上清液，加入1mL 1mol/L的NAOH溶液，并在90℃水浴中孵育2h后，在酶联免疫检测仪490nm处读取吸光度值。黑色素含量抑制率＝[1-(药物孔吸光度值/药物孔细胞密度)/(对照孔吸光度值/对照孔细胞密度)]×100%。计算半数抑制率(IC50)。IC50值定义为抑制率为50%时所需黑色素抑制剂的浓度。计算方法为以样品的浓度对黑色素的抑制率作图并进行拟合，读取计算IC50值。抑制率与抑制剂浓度的关系测定结果如图2所示。
图2为不同物质的浓度与黑色素生成抑制率的关系测定结果。结果显示，实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物和熊果苷均表现出抑制黑色素生成的作用，且抑制率随抑制剂的质量浓度的提高而上升。经计算可得，牛尾蒿黄酮类化合物的IC50为115.5mg/L，熊果苷的IC50为349.6mg/L，实施例2所得的牛尾蒿黄酮类化合物具有优异的抑制黑色素生成的效果。
综上图1、2结果，发现本发明中所制的牛尾蒿黄酮类化合物能抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素生成，且抑制效果显著优于熊果苷，具有美白的生理活性。
实施例8：
对牛尾蒿黄酮类化合物的止血作用研究
1）大鼠断尾法评价牛尾蒿黄酮类化合物对出血时间、出血量的影响：取Wistar大鼠，雌雄各半，体重180g±10g。受试样品：实施例2的牛尾蒿黄酮类化合物，以生理盐水溶解。实验方法及结果：Wistar大鼠21只，随机分为3组，每组7只，在距尾根3cm处断尾后，腹腔注射给药，观察出血停止时间和出血量；或者腹腔注射给药30min后，距尾根3cm处断尾，观察出血停止时间和出血量。结果见表1。
表1牛尾蒿黄酮类化合物对大鼠出血时间、出血量的影响
Figure 406231DEST_PATH_IMAGE003
2）小鼠毛细玻管法评价牛尾蒿黄酮类化合物对凝血时间的影响
实验动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重18-20g。受试样品：实施例2的牛尾蒿黄酮类化合物，阳性药止血环酸，以生理盐水溶解。实验方法及结果：小鼠随机分组，每组10只，连续灌胃给药3天，每天2次，时间间隔8h。于第3天第二次灌胃给药后1h，采用毛细管眼眶静脉丛取血，每间隔2-3s折断毛细管，观察有无血丝出现，记录毛细管中有血丝出现的时间，即为凝血时间；或者一次腹腔注射给药30min后，采用毛细管眼眶静脉丛取血，每间隔2-3s折断毛细管，观察有无血丝出现，记录毛细管中有血丝出现的时间，即为凝血时间。缩短率＝(空白组凝血时间-给药组凝血时间)/空白组凝血时间×100%。结果见表2。
表2牛尾蒿黄酮类化合物对小鼠凝血时间的影响
Figure 79658DEST_PATH_IMAGE004
综上表1、2结果，发现本发明中所制的牛尾蒿黄酮类化合物能显著缩短出血、凝血时间，表现出优异的止血、促凝血效果，且腹腔给药的促凝血效果更优于灌胃给药。
实施例9：
牛尾蒿黄酮类化合物的抗氧化活性研究
实验样品：实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物，以抗坏血酸为对照组，其他试剂为分析纯，水为蒸馏水。方法如下：精密称取DPPH粉末7.30mg，加入无水乙醇定容至50mL容量瓶中，得DPPH储备液，将储备液再稀释5倍，得浓度为74μmol/L、吸光度约为0.7的DPPH工作液。精密称取样品粉末适量，加H2O配制成320μmol/L储备液，测定时用H2O稀释成240μmol/L、160μmol/L、80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L。吸取样品溶液0.4mL不同浓度样品溶液和2.6mLDPPH工作液于比色管中，避光反应1h后，于517nm处测定吸光度值。以H2O代替样品溶液作为空白，以无水乙醇代替样品和DPPH溶液作为空白对照，以相同浓度的Vc为阳性对照，清除率按下式计算。清除率=(As-Ai)/(As-A0)×100%，式中As为空白，即70%乙醇加DPPH溶液的吸光度；Ai为不同浓度样品溶液和DPPH溶液的吸光度；A0为空白对照的吸光度。结果如图3所示。
图3为不同物质的浓度与DPPH的清除率的关系测定结果。结果显示，实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物和抗坏血酸均表现出对DPPH的清除作用，且清除率随质量浓度的提高而上升。经计算可得，牛尾蒿黄酮类化合物的IC50为75.51μmol/L，抗坏血酸的IC50为176.77μmol/L，实施例2所得的牛尾蒿黄酮类化合物具有清除自由基的能力，表现出比抗坏血酸更优的抗氧化活性和效果。
实施例10：
牛尾蒿黄酮类化合物与沙棘提取物联合使用实验
实验方法：取实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物为实验组1，以白雀木醇含量为90wt%的沙棘提取物为实验组2，以牛尾蒿黄酮类化合物和白雀木醇含量为95wt%的沙棘提取物联合使用的组别为实验组3（牛尾蒿黄酮类化合物与沙棘提取物的重量比为4:1），以牛尾蒿黄酮类化合物和白雀木醇含量为95wt%的沙棘提取物联合使用的组别为对照组1（牛尾蒿黄酮类化合物与沙棘提取物的重量比为2.5:1），以牛尾蒿黄酮类化合物和白雀木醇含量为95wt%的沙棘提取物联合使用的组别为对照组2（牛尾蒿黄酮类化合物与沙棘提取物的重量比为5.5:1），以生理盐水为空白组。美白活性研究：按照实施例7中的方法，实验样品的浓度统一限定为150mg/L，其结果如图4。止血作用研究：按照实施例8中的方法，实验样品的浓度统一限定为150mg/kg，其结果如表3、4。抗氧化活性研究：按照实施例9中的方法，实验样品的浓度统一限定为100μmol/L，其结果如图5。
图4为不同物质与酪氨酸酶抑制率、黑色素生成抑制率的关系测定结果；a-酪氨酸酶抑制率，b-黑色素生成抑制率。结果显示，在相同的浓度下，实验组2对酪氨酸酶和黑色素生成基本无抑制作用，实验组1、3和对照组1-2皆表现出抑制作用，其中实验组3的抑制率最高，且显著优于实验组1，而对照组1-2相较实验组1则表现出抑制作用减弱或无显著差异。综上说明，当牛尾蒿黄酮类化合物与含有白雀木醇的沙棘提取物联合使用时，能表现出更优的抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的效果，联合使用时，促使牛尾蒿黄酮类化合物表现出更高的美白的生理活性。
表3不同物质对大鼠出血时间、出血量的影响（剂量:150mg/kg）
Figure 964437DEST_PATH_IMAGE005
表4不同物质对小鼠凝血时间的影响（剂量:150mg/kg）
Figure 28208DEST_PATH_IMAGE006
综上表3、4结果，发现在相同的浓度下，实验组2对出血凝血基本无显著作用，实验组1、3和对照组1-2皆表现出止血、促凝血效果，其中实验组3的止血促凝血效果最好、效率最高，且显著优于实验组1，而对照组1-2相较实验组1则表现出止血促凝血效果减弱或无显著差异。综上说明，当牛尾蒿黄酮类化合物与含有白雀木醇的沙棘提取物联合使用时，能表现出更优的止血、促凝血效果。
图5为不同物质与DPPH的清除率的关系测定结果。结果显示，在相同的浓度下，实验组2也表现出一定的DPPH清除作用，但其清除率不如实验组1；而实验组3的清除率最高，且显著优于实验组1，而对照组1-2相较实验组1皆表现出效果增强的作用。综上说明，当牛尾蒿黄酮类化合物与含有白雀木醇的沙棘提取物联合使用时，能表现出更优的清除自由基的能力，表现出更优的抗氧化活性和效果。
实施例11：
牛尾蒿黄酮类化合物的急性毒性试验
实验方法：取实施例2所制的牛尾蒿黄酮类化合物，用体积浓度为0.5%的羧甲基纤维素钠溶液配制成不同浓度的悬浮液。取雌雄各半，体重为20-22g、鼠龄6-7周的健康ICR小鼠为实验动物。随机分为5组，每组12只，正常喂养1周后，待动物熟悉饲养环境后，禁食12h，然后灌胃给予不同浓度的牛尾蒿黄酮类化合物的悬浮液，并在12h内给药2次，中间间隔6h，给药体积为0.2mL/10g，给药后观察1周，记录各组动物死亡数。实验结果如表5。
表5牛尾蒿黄酮类化合物对小鼠的LD50测定结果
Figure 259732DEST_PATH_IMAGE007
试验发现，未死亡的小鼠的饮水量、耗食量、体重、表观体征无明显异常。用改进寇氏法计算LD50及95%可信限，经计算，LD50＝12.833g/kg，LD50的95%可信限为：10.908-16.549g/kg。实验结论：牛尾蒿黄酮类化合物对小鼠的LD50为12.833g/kg，按照世界卫生组织规定的化学物质急性毒性分级标准，属于实际无毒物质。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (6)

1.一种牛尾蒿黄酮类化合物，其特征是：所述黄酮类化合物具有如下结构式：
Figure 907421DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种权利要求1所述的牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，其特征是，所述方法包括：
将牛尾蒿药材加水进行煎煮过滤，得到过滤药液；
将所述过滤药液进行搅拌浓缩，得到浸膏；
将所述浸膏进行煎煮浓缩，并根据所述浸膏的密度变化控制煎煮温度，得到干膏半成品；
将所述干膏半成品静置后取出，进行干燥，得到牛尾蒿干膏；
采用乙醇对所述牛尾蒿干膏进行超声提取后，制得牛尾蒿乙醇提取物；
对所述牛尾蒿乙醇提取物用乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂进行萃取，制得粗提物；
对所述粗提物进行HP20大孔树脂分离、硅胶柱层析、C18反相制备柱层析和SephadexLH-20凝胶柱层析，即得所述黄酮类化合物；
所述乙酸乙酯和聚乙二醇混合溶剂中乙酸乙酯和聚乙二醇的体积比为2-5:1，所述聚乙二醇的平均分子量为400-2000；
所述HP20大孔树脂分离步骤收集体积百分数为35%、45%、60%乙醇洗脱液；所述硅胶柱层析步骤收集氯仿:甲醇体积比为10:1的洗脱液；所述C18反相制备柱层析步骤收集体积百分数为65%的甲醇洗脱液；所述Sephadex LH-20凝胶柱层析采用100%乙醇洗脱。
3.根据权利要求2所述的牛尾蒿黄酮类化合物的制备方法，其特征是：所述超声提取所用乙醇的体积浓度为70-90%，料液比为1g:150-200mL；所述超声提取的频率为35-60kHz，功率为200-400w，提取次数为2-3次，单次提取时间为30-60min。
4.一种权利要求1所述的牛尾蒿黄酮类化合物在制备美白剂中的用途。
5.一种权利要求1所述的牛尾蒿黄酮类化合物在制备止血产品中的用途。
6.一种权利要求1所述的牛尾蒿黄酮类化合物在制备抗氧化食品、抗氧化药品、抗氧化化妆品或抗氧化保健品中的用途。
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