CN101899028B

CN101899028B - 一种呋喃二萜类化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101899028B
Application number: CN2010102497398A
Authority: CN
Inventors: 彭冰; 肖培根; 彭勇; 肖伟; 何春年; 许利嘉
Original assignee: 肖培根
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-08-05
Also published as: CN101899028A

Abstract

本发明涉及从三白草科药用植物中分离呋喃二萜(1)、(2)结构的化合物及其制备方法和在防治心脑血管疾病中的应用；实验研究结果表明，所述化合物对H₂O₂所致血管内皮细胞损伤具有保护作用，可以用于预防和治疗心脑血管疾病。

Description

一种呋喃二萜类化合物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及植物化学新化合物的分离提取及其在临床中的应用，具体来讲，涉及从三白草科药用植物中分离新化合物呋喃二萜及其制备方法和在防治心脑血管疾病中的应用。

背景技术：

血管内皮细胞产生和表达各种调节分子，从而在生理和病理状态下对血管功能的调节起关键作用。血管内皮细胞损伤不仅是动脉粥样硬化的始动因素，而且对冠心病、高血压等疾病的发生和发展起着重要的作用。因此，研究对血管内皮细胞损伤的保护，是防治心脑血管疾病的一种新途径。

过氧化氢作为活性氧家族中的一员，可直接作用于膜脂质，形成脂质过氧化物，从而使MDA(丙二醛)生成增加，质膜通透性增加，外钙内流增多，LDH(乳酸脱氢酶)漏出也增多，同时SOD(超氧化物歧化酶)活性下降；过氧化氢可直接损伤内质网，并可加剧线粒体功能障碍，使氧化磷酸化紊乱，导致内皮细胞损伤甚至激活凋亡调控基因，促发凋亡。

通过H₂O₂造成血管内皮细胞损伤，采用MTT法测定细胞线粒体活性，根据光密度值的变化，可以观察样品对H₂O₂所致血管内皮细胞损伤的保护作用，从而筛选出具有防治心脑血管疾病的药物。

三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill为三白草科Saururaceae三白草属Saururus植物，别名塘边藕，产于河北、山东、河南和长江流域及其以南各省区。据《中华人民共和国药典》2010版一部记载，三白草有利尿消肿，清热解毒的功效，用于水肿，小便不利，淋沥涩痛，带下；外治疮疡肿毒，湿疹。Ryu S Y等研究发现，三白草的乙醇提取液对大鼠动脉具血管扩张作用，EC₅₀值为9.1μg/ml(Ryu S Y，Oh K S，Kim Y S，et al.Antihypertensive，vasorelaxant and inotropic effects of an ethanolic extract of the roots of Saururus chinensis[J].Journal of Ethnopharmacology，2008，118(2)：284-289.)。在离体大鼠心脏可减轻左心房压以及心律，长期口服给药可降低高血压大鼠的血压(约20mmHg)。其降压作用源自直接的血管舒张及减弱心脏收缩力。Oh K S等从三白草中分得的木脂素三白草醇(saucerneol)、三白草醇D(saucerneol D)、三白草醇E(saucerneol E)、马纳萨亭A及B、三白草酮(sauchinone)三白脂素(saururenin)及红楠素D(machilin D)(Oh K S，Yeon H C，Shi Y R，et al.Cardiovascular effects of lignans isolated from Saururus chinensis[J].Planta Med，2008，74(3)：233-238.)，这些化合物对大鼠离体主动脉环产生浓度相关的松弛作用，其中三白草醇、三白草醇D及红楠素D的作用尤为明显。进一步研究结果表明：上述八个化合物都具有心血管松弛活性和负性肌力的作用。

本实验室在深入研究三白草化学成分的过程中，分离纯化得到并鉴定了两个全新结构化合物呋喃二萜(1)、呋喃二萜(2)，体外活性实验表明，它们对H₂O₂所致血管内皮细胞损伤具有保护作用，呈现了防治心脑血管疾病的功效。本发明所涉及的源自三白草新化合物呋喃二萜及其在防治心脑血管疾病中的应用，迄今为止，尚未见有任何相关的报道。

发明内容：

本发明提供一种以药用植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草为原料，提取分离具有治疗和/或预防心血管疾病的呋喃二萜类化合物，其结构如下所示：

本发明还提供了所述呋喃二萜化合物(1)和呋喃二萜化合物(2)的制备方法，其技术方案包括如下步骤：

以药用植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草为原料，经95％乙醇回流提取，用蒸馏水混悬提取物，依次用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，之后，将乙酸乙酯萃取部分用硅胶柱层析、MCI HP20树脂柱层析、硅胶柱层析和反相C-18半制备HPLC分离手段得到化合物(1)和(2)，详细流程见图1。

结构鉴定：

主要利用核磁共振波谱法(¹HNMR，¹³CNMR，2D-NMR)，紫外光谱法，质谱法(ESI-MS)鉴定其结构。

化合物(1)为无色胶状，UV(图2)λ_max(MeOH)(nm)(logε)：271(4.18)，218.5(4.11)；ESI-MS(见图3)：(negative ion)m/z：363.1667[M-H]^-。提示该化合物的分子量为364，分子式为C₂₀H₂₈O₆。

由UV最大吸收波长271nm同¹HNMR(见图4，图5)，¹³CNMR(图6)，HMQC(图7)和HMBC(图8)得知核磁数据：[δ_H 6.08(1H，s，H-2)，5.55(1H，s，H-5)，和2.21(3H，s，H-20)；δ_C 171.12(C-1)，118.07(C-2)，157.58(C-3)，153.14(C-4)，117.5(C-5)，和11.91(C-13)]构成γ-亚烷基-α-甲基-α，β-不饱和γ-内酯基团。

甲基信号：δ_H 1.59(3H，s，H-17)→δ_C 17.97，δ_H 1.67(3H，s，H-16)→δ_C 26.15；亚甲基信号：δ_H 1.65(1H，m，H-8α)→δ_C 38.49，δ_H 1.52(1H，m，H-8β)→δ_C 38.49，δ_H 2.32(4H，m，H-9and H-12)→δ_C 24.10and 27.98，δ_H 2.10(2H，m，H-13)→δ_C28.93；烯键信号：δ_H 5.13(1H，t，J＝7.2，H-14)→δ_C 125.10，δ6.73(1H，t，J＝7.2，H-10)→δ_C 144.25；季碳：δ_C 133.21(C-11)，δ_C 133.77(C-15)构成链状烯烃片段。

由HMBC，δ_H 6.73(H-10)，δ_H 2.32(H-12)均与δ_C 172.00(C-18)相关，得知在 ¹³CNMR中未出现的羰基季碳信号δ_C 172.00(C-18)与δ_C 133.21(C-11)相连。δ_H6.73(H-10)与δ_C 172.00(C-18)同侧。最后通过质谱给出的分子量364证实δ_C172.00(C-18)为一个羧基碳。

由HMBC，δ_H 1.65(H-8α)分别与δ_C 75.62(C-7)，73.36(C-6)相关，δ_H 1.52(H-8β)与δ_C 75.62(C-7)相关，δ_H 5.55(H-5)分别与δ_C 75.62(C-7)，73.36(C-6)相关，δ_H 4.50(H-6)与δ_C 75.62(C-7)相关，得知碳骨架相连的顺序为δ_C 38.49→75.62→73.36→112.37。δ_C 75.62和δ_C 73.36均连有羟基。并由H-H COSY(图9)和NOESY(图10)进一步证实。

通过2D-NMR技术，尤其是HMQC和HMBC谱，解决了取代基的位置，结合质谱，对化合物(1)的全部核磁数据进行了准确的归属。

化合物(2)为无色胶状，UV(见图11)λ_max(MeOH)(nm)(logε)：270.5(4.20)，220(4.02)；HRESI-MS(见图12)：m/z：387.1802[M+Na]⁺。提示该化合物的分子量为364，分子式为C₂₀H₂₈O₆。因此，该化合物是化合物(1)的同分异构体。¹HNMR(图13，图14)中除δ_H 5.84(1H，t，J＝7.2，H-10)，δ_H 1.65(2H，m，H-8)和δ_H 1.12(3H，s，H-19)外，其他数据均与化合物(1)的数据非常相近。¹³CNMR(图15)数据也显示，除δ_C36.26(C-9)，δ_C 141.82(C-10)外，其他数据也与化合物(1)的数据非常相近。化合物(2)的HMQC(图16)，HMBC(图17)，H-H COSY(图18)图谱上的相关点也与化合物(1)相似。由上可知，化合物(2)的结构中，δ_H 5.84(1H，t，J＝7.2，H-10)与δ_C 172.00(C-18)异侧。其他平面结构与化合物(1)相同。由NOESY(图19)谱的δ_H 5.84(1H，t，J＝7.2，H-10)与δ_H 2.54(1H，m，H-12α)，δ_H 2.48(1H，m，H-12β)相关进一步得到证实。

表1 化合物(1)及化合物(2)的¹HNMR(600MHz)和¹³CNMR(150MHz)数据归属(溶剂CD3OD)

本发明还提供了含有化合物(1)和/或化合物(2)作为活性成分的药物组合物，所述组合物，含有生理有效量的化合物(1)和/或化合物(2)以及药学上可接受的载体。所述的化合物(1)和/或化合物(2)的重量比为0.1-99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。本发明的药物组合物以适合药用的制剂形式存在，这些制剂形式是：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。

本发明进一步提供了所述化合物(1)和/或化合物(2)在制备防治心血管疾病药物中的应用。

附图说明：

图1：化合物的制备流程

图2：化合物1的紫外光谱

图3：化合物1的质谱

图4：化合物1的氢谱

图5：化合物1的氢谱放大

图6：化合物1的碳谱

图7：化合物1的HMQC谱

图8：化合物1的HMBC谱

图9：化合物1的H-H COSY谱

图10：化合物1的NOESY谱

图11：化合物2的紫外光谱

图12：化合物2的质谱

图13：化合物2的氢谱

图14：化合物2的氢谱放大

图15：化合物2的碳谱

图16：化合物2的HMQC谱

图17：化合物2的HMBC谱

图18：化合物2的H-H COSY谱

图19：化合物2的NOESY谱

实施方案：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》呋喃二萜化合物(1)的制备

以三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的干燥全草9.8kg为原料，用95％乙醇回流提取三次，每次2小时，提取物浓缩至浸膏状，以适量蒸馏水混悬，依次用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，之后，将乙酸乙酯萃取部分(300g)经硅胶(100-200目)柱层析，依次用氯仿-甲醇不同比例的溶剂梯度洗脱得到15个馏分，馏分5经MCI HP20树脂柱层析，以甲醇-水不同比例的溶剂梯度洗脱得到3个馏分，馏分2再经硅胶(200-300目)柱层析，依次用石油醚-丙酮不同比例的溶剂梯度洗脱得到6个馏分，馏分2用反相硅胶(RP-18)半制备HPLC柱分离，流动相以55％甲醇/水等度洗脱，在第35分钟至38分钟接到馏分，回收溶剂，得到化合物(1)55mg。

《实施例2》呋喃二萜化合物(2)的制备

按照实施例1相同的方法、步骤，最后用反相RP-18半制备HPLC柱分离，流动相以55％甲醇/水等度洗脱，在第60分钟至65分钟接到馏分，回收溶剂，得到化合物(2)35mg。

《实施例3》呋喃二萜化合物(1)、(2)对H₂O₂所致血管内皮细胞损伤的保护

试验

材料与方法：

细胞株：CRL-1730人脐静脉内皮细胞株，购自ATCC Global Bioresource Center；H₂O₂：北京北化康泰临床试剂有限公司产品；

试剂：噻唑蓝(MTT)，购自Sigma公司；

仪器：微板光学测定仪。

CRL-1730人脐静脉内皮细胞计数，培养于96孔平底培养板。24小时后，细胞先用样品处理4h，然后用H₂O₂处理20h造成细胞氧化损伤模型，用MTT法测定血管内皮细胞线粒体活性，以观察样品对H₂O₂所致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。

实验结果：

样品	浓度(μg/ml)	保护率(％)
			化合物(1)	5	34.94
化合物(2)	5	33.72

实验结果表明：化合物(1)和化合物(2)对H₂O₂所致血管内皮细胞损伤具有保护作用，可以用于预防和治疗心脑血管疾病。

Claims

1.一种呋喃二萜化合物(1)，其结构如下式所示：

化合物(1)。

2.制备权利要求1所述呋喃二萜化合物(1)的方法，其基本步骤是：以药用植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草为原料，经95％乙醇回流提取，用蒸馏水混悬提取物，依次用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，之后，将乙酸乙酯萃取部分用硅胶柱层析、MCI HP20树脂柱层析、硅胶柱层析，最后用反相RP-18半制备HPLC柱分离，流动相以55％甲醇/水等度洗脱，在第35分钟至38分钟接到馏分，回收溶剂得到化合物(1)。

3.一种药物组合物，其特征是，所述组合物是由活性成分权利要求1所述呋喃二萜化合物(1)及药学上可接受的载体组成。

4.权利要求3所述的药物组合物，其特征是，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。

5.权利要求3或4所述的药物组合物，其特征是，所述组合物以适合药用的制剂形式存在，它们是：糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、合剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。

6.权利要求1所述呋喃二萜化合物(1)在制备治疗和/或预防心血管疾病药物中的应用。

7.一种呋喃二萜化合物(2)，其结构如下式所示：

化合物(2)。

8.制备权利要求7所述呋喃二萜化合物(2)的方法，其基本步骤是：以药用植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草为原料，经95％乙醇回流提取，用蒸馏水混悬提取物，依次用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，之后，将乙酸乙酯萃取部分用硅胶柱层析、MCI HP20树脂柱层析、硅胶柱层析，最后用反相RP-18半制备HPLC柱分离，流动相以55％甲醇/水等度洗脱，在第60分钟至65分钟接到馏分，回收溶剂得到化合物(2)。

9.一种药物组合物，其特征是，所述组合物是由活性成分权利要求7所述呋喃二萜化合物(2)及药学上可接受的载体组成。

10.权利要求9所述的药物组合物，其特征是，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。

11.权利要求9或10所述的药物组合物，其特征是，所述组合物以适合药用的制剂形式存在，它们是：糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、合剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。

12.权利要求7所述呋喃二萜化合物(2)在制备治疗和/或预防心血管疾病药物中的应用。