CN104478894A - 一种龙胆内酯化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龙胆内酯化合物及其制备方法与应用。所述的龙胆内酯化合物是以龙胆苦苷为原料制备得到，为龙胆内酯a和龙胆内酯b，其分子式分别为C₁₉H₂₀O₇和C₁₉H₁₈O₆，分别具有下述结构式Ⅰ和结构式Ⅱ： （Ⅰ）（Ⅱ）。制备方法是以龙胆苦苷为原料，在酸性条件下进行热转化反应，后通过柱层析对反应液进行分离纯化得到龙胆内酯a和龙胆内酯b。本发明通过对龙胆苦苷酯化反应的产物进行分离得到一种新的龙胆内酯化合物，并通过药理实验研究表明本发明所述的龙胆内酯化合物具有显著的抗乙肝病毒作用。本发明所述的龙胆内酯化合物的制备方法具有原料易得，工艺简便的特点，可操作性强。

Description

一种龙胆内酯化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种龙胆内酯化合物及其制备方法与应用。

背景技术

龙胆苦苷(Gentiopicroside) 是龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana L)植物龙胆的有效成分之一，在秦艽中的含量可高达18%，属于裂环环烯醚萜苷的糖苷配基。但由于化合物中的烯醚键不稳定，容易在多种条件下发生分解转化，因此含有此类物质的药材容易在放置及其炮制的过程中发生颜色变化及含量的变化。龙胆苦苷自身是前体药物，它在生物机体内不易被吸收利用，药效不明显，容易产生耐药性，且具有一定的毒副作用，所以改善龙胆苦苷的构型、提高其在肠道中的吸收率是提高其生物利用度的重要途径，因此，其热转化产物的研究具有重要意义。

近年来，环烯醚萜成分的化学和药理研究取得长足进展，特别是环烯醚萜成分在加热等条件下发生转化，生成结构多样，且在抗乙肝病毒活性和保肝作用方面受到高度重视。但该类化合物为手性碳多、高氧化、高稠和的复杂结构天然产物，很难进行合成，而其在植物体含量非常低微，不具备产业化生产和商业化应用价值。因此，通过对龙胆苦苷热转化产物的研究，有助于富含龙胆苦苷中药（药材、中成药、饮片）的生产及质量控制、临床应用指导；同时，对揭示裂环烯醚萜类成分转化产物化学结构的多样性和新颖性、寻找和发现抗肝炎新药及其前体物质（先导化合物），全面认识裂环环烯醚萜类化合物性质、作用途径及药物开发研究具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种龙胆内酯化合物；第二目的在于提供所述的龙胆内酯化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的龙胆内酯化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的龙胆内酯化合物是以龙胆苦苷为原料制备得到，为龙胆内酯a和龙胆内酯b，其分子式分别为C₁₉H₂₀O₇和C₁₉H₁₈O₆，分别具有下述结构式Ⅰ和结构式Ⅱ：

                                                 （Ⅰ）

（Ⅱ）

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、取原料龙胆苦苷，加入重量比3~10倍的水，调节pH为1~3，于90~100℃回流进行酯化反应8~12h，将反应液冷却、过滤得到滤液和滤渣；

B、将滤液进行减压浓缩，经大孔吸附树脂吸附、先后用水和甲醇进行洗脱，通过TLC监测分别收集糖类和内酯类部分；

C、取内酯类部分上MCI-GEL CHP柱，用1:10~1:0的甲醇-水溶液进行洗脱，通过TLC监测进行收集，合并相同部分；

D、C步骤洗脱液的1:5部分进一步分离纯化即得所述的龙胆内酯a；

E、C步骤洗脱液的1:3部分上硅胶柱，用50:1~1:3的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，通过TLC监测收集洗脱液、浓缩、干燥得到龙胆内酯b。

以上述方法制备的龙胆内酯化合物的结构是通过以下方法测定出来的。

本发明的龙胆内酯a，无色块晶（甲醇），易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮。正离子HRESIMS谱在m/z383.1095处显示准分子离子峰[M+Na]⁺，计算值为383.1106，表明该化合物的分子式为C₁₉H₂₀O₇，不饱和度为10。红外光谱(KBr)中提示有羟基(3410 cm^-1)，羰基(1690 cm^-1)和双键(1620 cm^-1)等官能团。¹³C-NMR(DEPT)谱给出19个碳信号，包括7个季碳，6个次甲基，5个 亚甲基和一个甲基。根据HSQC谱可以把化合物中所有的碳和与其相连的氢关联起来。

通过分析¹H和¹³C-NMR(DEPT)谱，在低场区有两个共轭内酯羰基[δ_C166.0 (s, C-1), δ_C 164.6 (s, C-13)]，三组双键[δ_C153.6（s, C-9）, δ_C147.8（s, C-5）, δ_C136.2（s, C-20）, δ_C129.1（d, C-21）, δ_C128.7（s, C-14）, δ_C124.0（s, C-6）]，一个二氧取代的次甲基[δ_C88.7 (d, C-15), δ_H 6.17 (1H, s, H-15)]。¹H-NMR谱中有一个次甲基信号[δ_H5.83(1H, d, J=7.2 Hz, H-21)]和一个甲基信号[δ_H1.64(3H, d, J=7.2 Hz, H-22)]，推断该次甲基与甲基相连。

由¹H-¹H COSY谱中H-3与H-4的相关信号和HMBC谱中H-3与C-1、C-4、C-5及H-4与C-5、C-6的相关，可构建出分子中一个δ-内酯片段1a。同理，由¹H-¹H COSY谱中H-10与H-11的相关信号和HMBC谱中H-10与C-9、C-11、C-14及H-11与C-9、C-10、C-13的相关，可构建出分子中另一个δ-内酯片段1b。根据¹H-¹H COSY谱中H-7/H-8、H-8/H-17/H-18、H-18/H-19的相关及HMBC谱中H-7与C-5、C-6、C-8、C-17和H-19与C-5、C-18、C-20的相关信号可以构建出分子中的八元环结构片段1c。由HMBC谱中H-8与C-9、C-14的相关信号，推测片段1c中的C-8与片段1b中的C-9相连接，由H-15与C-17的相关并结合化合物的分子式，可确定C₁₅-O-C₁₇的连接方式，同理，由H-7与C-19和H-19与C-7的相关可确定片段C₇-O-C₁₉。进一步分析¹H-¹H COSY谱，H-21与H-22相关，再结合HMBC谱中H-21与C-20、C-22的相关信号，由此确定了片段C₂₀-C₂₁-C₂₂。至此，可以确定该化合物的平面结构。

在ROESY谱中，观测到H-7/H-10，H-15/H-17，H-19/H-22的相关信号。然而根据以上ROESY数据来很难确定该化合物的立体构型。最后，对其进行X-ray晶体衍射分析，最终确定了该化合物的结构。根据IUPA命名规则，该化合物的各个手性中心分别为7R*, 8S*, 17S*, 19S*。

本发明的龙胆内酯b，白色粉末（甲醇），易溶于氯仿。正离子HRESIMS谱在m/z343.1191处显示准分子离子峰[M+H]⁺，计算值为343.1181，表明该化合物的分子式为C₁₉H₁₈O₆，不饱和度为11。红外光谱(KBr)中提示有羰基(1690 cm^-1)和双键(1627, 1600cm^-1)等官能团。¹³C-NMR(DEPT)谱给出19个碳信号，包括7个季碳，7个次甲基，4个 亚甲基和1个甲基。根据HSQC谱可以把化合物中所有的碳和与其相连的氢关联起来。

通过分析¹H和¹³C-NMR(DEPT)谱，在低场区有两个共轭内酯羰基[δ_C163.9 (s, C-1), δ_C 163.2 (s, C-13)]，四组双键[δ_C152.0（d, C-15）, δ_C144.4（s, C-5）, δ_C134.3（s, C-20）, δ_C127.8（d, C-21）, δ_C123.3（s, C-9）, δ_C122.1（s, C-6）, δ_C116.3（d, C-10）, δ_C103.5（s, C-14）]。¹H-NMR谱中有一个次甲基信号[δ_H6.05(1H, d, J=7.2 Hz, H-21)]和一个甲基信号[δ_H1.89(3H, d, J=7.2 Hz, H-22)]，推断该次甲基与甲基相连，一个次甲基信号[δ_H7.40(1H, s, H-15)]，推断分子中一组双键与氧相连。

由¹H-¹H COSY谱中H-3与H-4的相关信号和HMBC谱中H-3与C-1、C-5及H-4与C-5、C-6的相关，可构建出分子中一个δ-内酯片段2a。同理，由¹H-¹H COSY谱中H-10与H-11的相关信号和HMBC谱中H-10与C-14及H-11与C-9、C-10、C-13的相关，可构建出分子中另一个δ-内酯片段2b。根据¹H-¹H COSY谱中H-7/H-8、H-8/H-17/H-18、H-18/H-19的相关及HMBC谱中H-7与C-6、C-8、C-17和H-19与C-5、C-18、C-20的相关信号可以构建出分子中的八元环结构片段2c。由¹H-¹H COSY谱中H-21与H-22的相关信号和HMBC谱中H-21与C-5、C-19、C-22及H-22与C-20、C-21的相关，可以确定C₂₀-C₂₁-C₂₂的连接方式。根据HMBC谱中H-8与C-9的相关，可以确定C₈-C₉的连接方式，同理，通过H-15与C-9、C-14的相关，可以确定C₁₄-C₁₅的连接方式。此外，由HMBC谱中H-19与C-7以及H-15与C-17的相关信号，结合分子式，可以推知C-7与C-19，C-15与C-17分别通过一个氧原子相互连接。至此，可以确定该化合物的平面结构。

在ROESY谱中，观测到H-4/H-20，H-8/H-10，H-19/H-22的相关信号。而龙胆内酯b与龙胆内酯a结构非常相识，只是由龙胆内酯b在C15位的羟基经14、15位加一分子水，再经过双键重排得到了龙胆内酯a。因此，可推测龙胆内酯b与龙胆内酯a具有相同的立体结构，手性中心分别为7R*, 8R*, 17S*, 19R*。

表1  龙胆内酯a-b的¹H和¹³C核磁数据

本发明的第三目的是这样实现的，所述的龙胆内酯化合物在制备预防/治疗乙肝病毒有关的疫病药物中的应用。

本发明通过对龙胆苦苷酯化反应的产物进行分离得到一种新的龙胆内酯化合物，并通过药理实验研究表明本发明所述的龙胆内酯化合物具有显著的抗乙肝病毒作用。本发明所述的龙胆内酯化合物的制备方法具有原料易得，工艺简便的特点，可操作性强。

附图说明

图1为本发明龙胆内酯a的主要二维相关；

图2为本发明龙胆内酯a的晶体结构示意图；

图3为本发明龙胆内酯b的主要二维相关。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的龙胆内酯化合物是以龙胆苦苷为原料制备得到，为龙胆内酯a和龙胆内酯b，其分子式分别为C₁₉H₂₀O₇和C₁₉H₁₈O₆，分别具有下述结构式Ⅰ和结构式Ⅱ：

  （Ⅰ）

（Ⅱ）

本发明所述的龙胆内酯化合物的制备方法包括以下步骤：

A、取原料龙胆苦苷，加入重量比3~10倍的水，调节pH为1~3，于90~100℃回流进行酯化反应8~12h，将反应液冷却、过滤得到滤液和滤渣；

B、将滤液进行减压浓缩，经大孔吸附树脂吸附、先后用水和甲醇进行洗脱，通过TLC监测分别收集糖类和内酯类部分；

C、取内酯类部分上MCI-GEL CHP柱，用1:10~1:0的甲醇-水溶液进行洗脱，通过TLC监测进行收集，合并相同部分；

D、C步骤洗脱液的1:5部分进一步分离纯化即得所述的龙胆内酯a；

E、C步骤洗脱液的1:3部分上硅胶柱，用50:1~1:3的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，通过TLC监测收集洗脱液、浓缩、干燥得到龙胆内酯b。

B步骤中水的用量为1~3BV。

B步骤中甲醇的体积浓度为95~100%，用量为3~7BV。

BV，即bed  volume，柱床体积。

C步骤所述的甲醇水溶液体积配比为1:10、1:9、1:7、2:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:0。

D步骤中所述的分离纯化是经Sephadex LH-20柱洗脱、正相硅胶柱洗脱。

所述的Sephadex LH-20柱洗脱是采用体积配比3:7~1:0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱。

所述的正向硅胶柱吸附洗脱是采用体积配比4:1的石油醚-丙酮溶液进行洗脱。

本发明的应用为所述的龙胆内酯化合物在制备预防/治疗乙肝病毒有关的疫病药物中的应用。

实施例1

取龙胆苦苷200g，加水1公斤，用盐酸调节pH=1，加热回流12小时，TLC跟踪反应进度，直至龙胆苦苷完全消失，放置冷却，过滤，滤液浓缩得122g浸膏。浸膏用2公斤大孔吸附树脂吸附，先用3BV水洗脱，再用甲醇洗脱至无色，回收乙醇溶液得总内酯23.5 g。总内酯分别经MCI-gel以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂得不同组分段；其中一组分段经sephadex LH-20层析以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂及硅胶以石油醚-丙酮（4:1）为洗脱剂多次分离纯化，得1.3g龙胆内酯a。另一组分段经硅胶以石油醚-丙酮（40:1～1:3）为洗脱剂多次分离纯化，得2.1g龙胆内酯b。

实施例2

取龙胆苦苷1000g，加水6公斤，用盐酸调节pH=2，加热回流10小时，TLC跟踪反应进度，直至龙胆苦苷完全消失，放置冷却，过滤，滤液浓缩得625g浸膏。浸膏用11公斤大孔吸附树脂吸附，先用2.5BV水洗脱，再用乙醇洗脱至无色，回收乙醇溶液得总内酯122.2 g。总内酯分别经MCI-gel以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂得不同组分段；其中一组分段经sephadex LH-20层析以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂及硅胶以石油醚-丙酮（4:1）为洗脱剂多次分离纯化，得6.76g龙胆内酯a。另一组分段经硅胶以石油醚-丙酮（40:1～1:3）为洗脱剂多次分离纯化，得11.07g龙胆内酯b。

实施例3

取龙胆苦苷5 kg，加水15公斤，用盐酸调节pH=1，加热回流8小时，TLC跟踪反应进度，直至龙胆苦苷完全消失，放置冷却，过滤，滤液浓缩得625g浸膏。浸膏用45公斤大孔吸附树脂吸附，先用1BV水洗脱，再用乙醇洗脱至无色，回收乙醇溶液得总内酯619.63g。总内酯分别经MCI-gel以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂得不同组分段；其中一组分段经sephadex LH-20层析以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂及硅胶以石油醚-丙酮（4:1）为洗脱剂多次分离纯化，得33.95g龙胆内酯a。另一组分段经硅胶以石油醚-丙酮（40:1～1:3）为洗脱剂多次分离纯化，得56.45g龙胆内酯b。

实施例4

取龙胆苦苷8kg，加水80公斤，用盐酸调节pH=3，加热回流12小时，TLC跟踪反应进度，直至龙胆苦苷完全消失，放置冷却，过滤，滤液浓缩得1.01kg浸膏。浸膏用70公斤大孔吸附树脂吸附，先用3BV水洗脱，再用乙醇洗脱至无色，回收乙醇溶液得总内酯996.4g。总内酯分别经MCI-gel以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂得不同组分段；其中一组分段经sephadex LH-20层析以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂及硅胶以石油醚-丙酮（4:1）为洗脱剂多次分离纯化，得54.9g龙胆内酯a。另一组分段经硅胶以石油醚-丙酮（40:1～1:3）为洗脱剂多次分离纯化，得88.7g龙胆内酯b。

实施例5

取龙胆苦苷10kg，加水30公斤，用盐酸调节pH=3，加热回流10小时，TLC跟踪反应进度，直至龙胆苦苷完全消失，放置冷却，过滤，滤液浓缩得1.28 kg浸膏。浸膏用85公斤大孔吸附树脂吸附，先用3BV水洗脱，再用乙醇洗脱至无色，回收乙醇溶液得总内酯1.258kg。总内酯分别经MCI-gel以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂得不同组分段；其中一组分段经sephadex LH-20层析以甲醇-水（1:10～10:1）为洗脱剂及硅胶以石油醚-丙酮（4:1）为洗脱剂多次分离纯化，得69.1g龙胆内酯a。另一组分段经硅胶以石油醚-丙酮（40:1～1:3）为洗脱剂多次分离纯化，得112.2 g龙胆内酯b。

实施例6

以实施例1制备的化合物进行测定：

龙胆内酯a，无色块晶（甲醇），易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮。正离子HRESIMS谱在m/z383.1095处显示准分子离子峰[M+Na]⁺，计算值为383.1106，表明该化合物的分子式为C₁₉H₂₀O₇，不饱和度为10。红外光谱(KBr)中提示有羟基(3410 cm^-1)，羰基(1690 cm^-1)和双键(1620 cm^-1)等官能团。¹³C-NMR(DEPT)谱给出19个碳信号，包括7个季碳，6个次甲基，5个 亚甲基和一个甲基。根据HSQC谱可以把化合物中所有的碳和与其相连的氢关联起来。

通过分析¹H和¹³C-NMR(DEPT)谱，在低场区有两个共轭内酯羰基[δ_C166.0 (s, C-1), δ_C 164.6 (s, C-13)]，三组双键[δ_C153.6（s, C-9）, δ_C147.8（s, C-5）, δ_C136.2（s, C-20）, δ_C129.1（d, C-21）, δ_C128.7（s, C-14）, δ_C124.0（s, C-6）]，一个二氧取代的次甲基[δ_C88.7 (d, C-15), δ_H 6.17 (1H, s, H-15)]。¹H-NMR谱中有一个次甲基信号[δ_H5.83(1H, d, J=7.2 Hz, H-21)]和一个甲基信号[δ_H1.64(3H, d, J=7.2 Hz, H-22)]，推断该次甲基与甲基相连。

由¹H-¹H COSY谱中H-3与H-4的相关信号和HMBC谱中H-3与C-1、C-4、C-5及H-4与C-5、C-6的相关，可构建出分子中一个δ-内酯片段1a。同理，由¹H-¹H COSY谱中H-10与H-11的相关信号和HMBC谱中H-10与C-9、C-11、C-14及H-11与C-9、C-10、C-13的相关，可构建出分子中另一个δ-内酯片段1b。根据¹H-¹H COSY谱中H-7/H-8、H-8/H-17/H-18、H-18/H-19的相关及HMBC谱中H-7与C-5、C-6、C-8、C-17和H-19与C-5、C-18、C-20的相关信号可以构建出分子中的八元环结构片段1c。由HMBC谱中H-8与C-9、C-14的相关信号，推测片段1c中的C-8与片段1b中的C-9相连接，由H-15与C-17的相关并结合化合物的分子式，可确定C₁₅-O-C₁₇的连接方式，同理，由H-7与C-19和H-19与C-7的相关可确定片段C₇-O-C₁₉。进一步分析¹H-¹H COSY谱，H-21与H-22相关，再结合HMBC谱中H-21与C-20、C-22的相关信号，由此确定了片段C₂₀-C₂₁-C₂₂。至此，可以确定该化合物的平面结构。

在ROESY谱中，观测到H-7/H-10，H-15/H-17，H-19/H-22的相关信号。然而根据以上ROESY数据来很难确定该化合物的立体构型。最后，对其进行X-ray晶体衍射分析，最终确定了该化合物的结构。根据IUPA命名规则，该化合物的各个手性中心分别为7R*, 8S*, 17S*, 19S*。

龙胆内酯b，白色粉末（甲醇），易溶于氯仿。正离子HRESIMS谱在m/z343.1191处显示准分子离子峰[M+H]⁺，计算值为343.1181，表明该化合物的分子式为C₁₉H₁₈O₆，不饱和度为11。红外光谱(KBr)中提示有羰基(1690 cm^-1)和双键(1627, 1600cm^-1)等官能团。¹³C-NMR(DEPT)谱给出19个碳信号，包括7个季碳，7个次甲基，4个 亚甲基和1个甲基。根据HSQC谱可以把化合物中所有的碳和与其相连的氢关联起来。

通过分析¹H和¹³C-NMR(DEPT)谱，在低场区有两个共轭内酯羰基[δ_C163.9 (s, C-1), δ_C 163.2 (s, C-13)]，四组双键[δ_C152.0（d, C-15）, δ_C144.4（s, C-5）, δ_C134.3（s, C-20）, δ_C127.8（d, C-21）, δ_C123.3（s, C-9）, δ_C122.1（s, C-6）, δ_C116.3（d, C-10）, δ_C103.5（s, C-14）]。¹H-NMR谱中有一个次甲基信号[δ_H6.05(1H, d, J=7.2 Hz, H-21)]和一个甲基信号[δ_H1.89(3H, d, J=7.2 Hz, H-22)]，推断该次甲基与甲基相连，一个次甲基信号[δ_H7.40(1H, s, H-15)]，推断分子中一组双键与氧相连。

由¹H-¹H COSY谱中H-3与H-4的相关信号和HMBC谱中H-3与C-1、C-5及H-4与C-5、C-6的相关，可构建出分子中一个δ-内酯片段2a。同理，由¹H-¹H COSY谱中H-10与H-11的相关信号和HMBC谱中H-10与C-14及H-11与C-9、C-10、C-13的相关，可构建出分子中另一个δ-内酯片段2b。根据¹H-¹H COSY谱中H-7/H-8、H-8/H-17/H-18、H-18/H-19的相关及HMBC谱中H-7与C-6、C-8、C-17和H-19与C-5、C-18、C-20的相关信号可以构建出分子中的八元环结构片段2c。由¹H-¹H COSY谱中H-21与H-22的相关信号和HMBC谱中H-21与C-5、C-19、C-22及H-22与C-20、C-21的相关，可以确定C₂₀-C₂₁-C₂₂的连接方式。根据HMBC谱中H-8与C-9的相关，可以确定C₈-C₉的连接方式，同理，通过H-15与C-9、C-14的相关，可以确定C₁₄-C₁₅的连接方式。此外，由HMBC谱中H-19与C-7以及H-15与C-17的相关信号，结合分子式，可以推知C-7与C-19，C-15与C-17分别通过一个氧原子相互连接。至此，可以确定该化合物的平面结构。

在ROESY谱中，观测到H-4/H-20，H-8/H-10，H-19/H-22的相关信号。而龙胆内酯b与龙胆内酯a结构非常相识，只是由龙胆内酯b在C15位的羟基经14、15位加一分子水，再经过双键重排得到了龙胆内酯a。因此，可推测龙胆内酯b与龙胆内酯a具有相同的立体结构，手性中心分别为7R*, 8R*, 17S*, 19R*。

实施例7

分别取实施例2、3、4、5制备的化合物进行测定，测定方法与实施例6相同，确认实施例2、3、4、5制备的化合物为所述的龙胆内酯化合物。

实施例8

以实施例2制备的龙胆内酯化合物进行试验，其结果如下：

抗乙型肝炎病毒活性测试：

测试原理：以HepG2.2.15细胞为乙型肝炎病毒载体，测定实施例2制备的龙胆内酯a、b对样品中HBV病毒产生HbsAg、HBeAg的活性的影响。

测试方法：

取HepG 2.2.15细胞株复苏，并重悬于完全培养基中，在37 ℃、5% CO₂条件下培养，每隔2d传代1次，保证实验所用细胞处于对数生长期。用胰蛋白酶将贴壁细胞HepG 2.2.15消化，并用培养基将细胞重悬和稀释为3×10⁴/ mL的细胞悬液，按每孔100μL接种于96孔板中进行培养，24 h后细胞长成单层，加入不同浓度的药液开始进行实验。每种药物以2.5%二甲基亚砜溶解，以培养基配成母液；每种药物设4个浓度梯度，每个浓度梯度设3个复孔，以拉米夫定为阳性对照药；每板设不加药物的正常细胞作空白对照。放置于37 ℃、5% CO₂条件下培养，48h后收集上清液。取上清液，采用酶联免疫法，用乙肝表面抗原及e抗原检测试剂盒，在酶标仪上以630 nm为参考波长，450 nm为检测波长进行检测，读取吸光度（A）值，检测药物对细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用，药物对抗原的抑制率 ＝（A细胞组－A实验组）/（A细胞组－A空白组），IC50值为药物对HBsAg或HBeAg的抑制率为50%时的药物浓度。吸去上清的细胞孔中加入100μL/孔含0.4 g/L MTT的无血清培养液，在37℃，5% CO₂条件下继续培养4 h，去上清液，用100μL/孔二甲基亚砜溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定其A值，检测药物对细胞的毒性作用，药物对细胞的破坏率＝（A细胞组－A实验组）/（A细胞组－A空白组），药物半数毒性浓度（CC50）为试验孔存活细胞为对照孔细胞50%时的药物浓度。治疗指数（SI）＝CC50/IC50。当SI＞2 时为低毒有效，1＜SI＜2 时为低效高毒，SI＜1 时为无毒无效。

表2   实施例2制备的龙胆内酯a、龙胆内酯b抗乙型肝炎病毒活性

由表2结果可知，实施例2制备的龙胆内酯a对HbsAg的IC₅₀小于0.04 mg·mL^-1、实施例2制备的龙胆内酯b的IC₅₀小于0.06 mg·mL^-1，表明实施例2制备的龙胆内酯a和龙胆内酯b对HbsAg均具有较强的抑制活性，同理，实施例2制备的龙胆内酯a和龙胆内酯b对HBeAg均具有较强的抑制活性。且实施例2制备的龙胆内酯a和龙胆内酯b对于HbsAg、HBeAg均有较为理想的治疗指数。结果表明实施例2制备的龙胆内酯a和龙胆内酯b可用于制备预防或治疗乙型肝炎的药物。

        实施例9

        分别以实施例1、3、4、5制备的龙胆内酯化合物进行试验，试验方法与实施例8相同，结果均表明本发明制备的龙胆内酯化合物可用于制备预防或治疗乙型肝炎的药物。

Claims (9)

1.一种龙胆内酯化合物，其特征在于所述的龙胆内酯化合物是以龙胆苦苷为原料制备得到，为龙胆内酯a和龙胆内酯b，其分子式分别为C₁₉H₂₀O₇和C₁₉H₁₈O₆，分别具有下述结构式Ⅰ和结构式Ⅱ：

                                                 （Ⅰ）

（Ⅱ）

。

2.一种权利要求1所述的龙胆内酯化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、取原料龙胆苦苷，加入重量比3~10倍的水，调节pH为1~3，于90~100℃回流进行酯化反应8~12h，将反应液冷却、过滤得到滤液和滤渣；

B、将滤液进行减压浓缩，经大孔吸附树脂吸附、先后用水和甲醇进行洗脱，通过TLC监测分别收集糖类和内酯类部分；

C、取内酯类部分上MCI-GEL CHP柱，用1:10~1:0的甲醇-水溶液进行洗脱，通过TLC监测进行收集，合并相同部分；

D、C步骤洗脱液的1:5部分进一步分离纯化即得所述的龙胆内酯a；

E、C步骤洗脱液的1:3部分上硅胶柱，用50:1~1:3的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，通过TLC监测收集洗脱液、浓缩、干燥得到龙胆内酯b。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中水的用量为1~3BV。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中甲醇的体积浓度为95~100%，用量为3~7BV。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于C步骤所述的甲醇水溶液体积配比为1:10、1:9、1:7、2:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:0。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的分离纯化是经Sephadex LH-20柱洗脱、正相硅胶柱洗脱。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的Sephadex LH-20柱洗脱是采用体积配比3:7~1:0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的正向硅胶柱吸附洗脱是采用体积配比4:1的石油醚-丙酮溶液进行洗脱。

9.一种权利要求1所述的龙胆内酯化合物的应用，其特征在于所述的龙胆内酯化合物在制备预防/治疗乙肝病毒有关的疫病药物中的应用。