CN103113218A

CN103113218A - 一种对映贝壳杉型二萜化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN103113218A
Application number: CN201310049613XA
Authority: CN
Inventors: 张永红; 谢捷明; 王菲
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2033-02-07
Also published as: CN103113218B

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为一种对映贝壳杉型二萜化合物及其制备方法和应用。本发明对映贝壳杉型二萜化合物的化学名为15-羰基-对映-贝壳杉-16-烯-19-酸。其制备方法为从红树林伴生植物卤地菊中提取、分离出一种对映贝壳杉型二萜化合物对映-贝壳杉-16-烯-19-酸，并以此为基础合成出15-羰基-对映-贝壳杉-16-烯-19-酸。经实验研究表明，该化合物对多种人体肿瘤细胞具有良好的抑制活性，因此，可以用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种对映贝壳杉型二萜化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种对映贝壳杉型二萜化合物及其制备方法和应用。

背景技术

卤地菊Wedeliaprostrata(Hook.et Arn.)Hemsl.为菊科蟛蜞菊属植物，产于福建沿海各地，多生于海边干燥沙地上，属于海洋红树林伴生植物，分布于广东、广西、台湾、浙江等省。全草药用，具有清热凉血，祛痰止咳的作用，可用于治疗流感，咽喉炎，急性扁桃腺炎，肺炎，支气管炎，高血压，哮喘，疔疮疖肿等症（江苏新医学院编.中药大辞典.上海：上海科学技术出版社，2002：1116-1117）。国外曾经对卤地菊中的化学成分进行了研究，主要成分是对映贝壳杉二萜类，倍半萜内酯类，甾醇类等化合物（Ragasa CY,et al.Journal of natural products,1993,56(3):386-393）。在最初的活性筛选中我们发现卤地菊全草粗提物显示了很好的肿瘤细胞毒活性，为寻找卤地菊的活性成分，我们对卤地菊全草甲醇提取物进行了系统的提取分离和结构鉴定，得到了对映贝壳杉型二萜化合物Ⅱ：对映-贝壳杉-16-烯-19-酸(ent-kaur-16-en-19-oic acid)（Hasan CM,et al.Phytochemistry，1982,21(6):1365-1368）。

对映贝壳杉烷型二萜化合物具有广泛的生理活性。其中，许多对映贝壳杉烷型二萜化合物的抗肿瘤活性与其分子中具有α-环外亚甲基环戊酮结构有关，该结构可以与受体氨基酸的亲核基团，如氨基、羧基等发生不可逆Micheal亲核加成反应，从而体现出较好的抗肿瘤活性（Lee C N,et al.Planta Medical,2001,67:796-799）。α-亚甲基酮是这类化合物主要的药效基团。经研究显示，无论是天然来源的还是人工合成的对映贝壳杉烷型二萜化合物，不具备α-亚甲基酮结构的化合物，均不具备抗癌活性；反之，具备α-亚甲基酮结构的化合物都有抗癌活性（RosselliS，et al.Journal of natural products,2007,70（3）:347-352）。因此，对映贝壳杉烷型二萜化合物，具有α-亚甲基酮结构是很有开发价值的一类抗癌活性化合物。

本发明人对卤地菊中提取分离得到的一种对映贝壳杉型二萜化合物Ⅱ，进行结构改造，着重合成其公认的必需的药效基团α-亚甲基酮，以得到一种对映贝壳杉烷型二萜化合物的衍生物。

发明内容

本发明目的在于提供一种对映贝壳杉型二萜化合物及其制备方法和应用。

所述对映贝壳杉烷型二萜化合物，其化学名为15-羰基-对映-贝壳杉-16-烯-19-酸（15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oic acid），分子式为C₂₀H₂₈O₃，结构式为：

所述对映贝壳杉烷二萜化合物的制备方法包括以下步骤：

1）卤地菊全草的提取：卤地菊全草粉碎后加甲醇室温浸泡提取，减压浓缩得醇提浸膏；

2）萃取：步骤1所得醇提浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3个萃取物；

3）硅胶柱层析：将步骤2）所得的石油醚萃取物上硅胶柱，以石油醚—乙酸乙酯梯度洗脱，收集对映贝壳杉化合物的馏份，减压回收溶剂，得富集物；

4）Sephadex LH-20柱层析：将步骤3所得的富集物上葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，以氯仿-甲醇洗脱，收集对映贝壳杉化合物的馏份，得对映贝壳杉化合物粗品；

5）对映贝壳杉化合物粗品的精制：将步骤4)所得对映贝壳杉化合物粗品上硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱，收集主要馏份，回收溶剂，得到一种对映贝壳杉型二萜化合物，其化学名为对映-贝壳杉-16-烯-19-酸，结构式为：

6）对映贝壳杉化合物的羟基化反应:将步骤5)所得的对映贝壳杉化合物Ⅱ溶于有机溶剂中，在催化剂的催化下，经氧化剂氧化，在化合物Ⅱ特定位置引入羟基，得到羟基化的化合物Ⅱ，结构如式Ⅲ；

7）对映贝壳杉化合物的羰基化反应:将步骤6)中所得的对映贝壳杉化合物Ⅲ溶于有机溶剂中，并在温和氧化剂作用下将羟基氧化成羰基，得到对映贝壳杉型二萜化合物Ⅰ。

在步骤6）中，有机溶剂是THF，催化剂是t-BuOOH，氧化剂是SeO₂。

在步骤7）中，有机溶剂是DMF，温和的氧化剂是PDC。

本发明从卤地菊中提取分离出了一个对映贝壳杉烷型二萜化合物，并以此为基础合成出了一种对映贝壳杉烷型二萜化合物衍生物，该对映贝壳杉烷型二萜化合物衍生物结构中具有α-亚甲基酮活性官能团，经体外抗肿瘤活性筛选表明，该化合物有较强的细胞毒活性，可以用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1为15-羰基-对映-贝壳杉-16-烯-19-酸的结构式；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1对映贝壳杉烷化合物的制备

1）卤地菊全草粗提取

卤地菊全草5㎏，粉碎后加甲醇室温浸泡3次，每次7天。减压浓缩去醇后得浸膏350g。

2）萃取

将醇提浸膏用水悬浮后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚提取物80g，乙酸乙酯提取物60g，正丁醇提取物100g。

3)硅胶柱层析

将步骤2）所得的石油醚提取物80g上硅胶柱（1㎏），以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱：100：1→80:1→60:1→40:1→10:1→1:1各洗脱3个柱体积，收集对映贝壳杉烷化合物的流份，减压回收溶剂，得富集物。

4)Sephadex LH-20柱层析

将步骤3）所得富集物6g，上葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，50％氯仿甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有对映贝壳杉烷化合物的流份，减压回收溶剂，干燥得到贝壳杉烷化合物粗品3.41g。

5)对映贝壳杉烷化合物粗品的精制：

将步骤4）所得对映贝壳杉烷化合物1.0g粗品上硅胶柱层析（80g），以石油醚-丙酮梯度洗脱，100：1→80:1→60:1→40:1→10:1→1:1各洗脱3个柱体积，收集对映贝壳杉烷化合物的流份，减压回收溶剂，得对映贝壳杉烷型二萜化合物Ⅱ0.68g。

对映贝壳杉烷型二萜化合物Ⅱ的理化测定数据如下：无色块状结晶；mp167-169℃； EI-MS m/z302(M⁺,C₂₀H₃₀O₂),287(M⁺-CH₃),259(M⁺-COOH),241,213,131,105;UV(CH₃OH)λ_max209；IR(KBr)υ_max1690（C=O）,1462,1260,873cm^-1。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ:4.79(1H,brs,H-17A)，4.74(1H,br s,H-17B)，2.63(1H,br s,H-13)，1.24(3H,s,H-18)，0.95(3H,s,H-20)。

¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ:184.4(C-19)，155.8(C-16)，102.9(C-17)，57.0(C-5)，55.0(C-8)，55.0(C-9)，48.9(C-15)，44.2(C-4)，43.8(C-13)，43.7(C-10)，41.2(C-1)，40.6(C-7)，39.6(C-14)，37.7(C-3)，33.0(C-12)，28.9(C-18)，21.8(C-6)，19.0(C-2)，18.4(C-11)，15.5(C-20)。以上光谱数据与文献报道数据一致，因此鉴定化合物Ⅱ为对映-贝壳杉-16-烯-19-酸(ent-kaur-16-en-19-oic acid),结构如式Ⅱ（Hasan CM,et al.Phytochemistry,1982,21(6):1365-1368)。

实施例2对映贝壳杉型二萜化合物的结构修饰

1）对映贝壳杉型二萜化合物的羟基化反应

结构如式Ⅱ的对映贝壳杉型二萜化合物进行羟基化反应，反应方程式如下：

将SeO₂0.12g，t-BuOOH0.46ml,溶于THF12.00ml中，置于存放有磁子的干燥50ml圆底烧瓶中，搅拌加入溶于THF12.50ml的式Ⅱ化合物0.50g中，室温下反应20个小时。

反应20个小时后，向反应体系中加入溶有少量亚硫酸氢钠的饱和食盐水，乙酸乙酯提取两次，合并提取液，饱和食盐水洗涤，干燥。浓缩提取物后得中间体化合物Ⅲ，粗品柱色谱纯化［石油醚：丙酮（4:1），并加入体积为石油醚、丙酮总体积的0.3％的醋酸］。得粉末状固体0.42g，产率79.9％。

对映贝壳杉型化合物Ⅲ理化测定数据如下：白色粉末状；mp147-148℃。EI-MSm/z 318（M⁺）。

2）对映贝壳杉烷型二萜化合物的羰基化反应：

将步骤1）所得的对映贝壳杉型化合物Ⅲ进行羰基化反应，反应方程式如下：

将步骤1）所得的对映贝壳杉烷型二萜化合物Ⅲ0.25g和PDC0.41g溶于DMF2.50ml中。室温下反应12小时。向反应体系加入饱和食盐水，乙酸乙酯提取两次，合并提取液，饱和食盐水洗涤，干燥。浓缩提取液后，粗品柱色谱纯化［石油醚：丙酮（4:1），并加入体积为石油醚、丙酮总体积的0.3％的醋酸］，得粉末状固体0.11g，为对映贝壳杉烷型二萜化合物Ⅰ，产率44.8％.

对映贝壳杉烷型二萜化合物Ⅰ理化测定数据如下：白色粉末状固体；mp179.8-180.9℃。EI-MS m/z316（M⁺）。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ:5.96(1H,brs,H-17A)，5.27(1H,br s,H-17B)，3.07(1H,brs,H-13)，1.29(3H,s,H-18)，1.04(3H,s,H-20)。UV(CH₃OH)λ_max233；IR(KBr)υ_max1731(C=O),1682(C=O),1441,1260,936cm^-1。

¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ:184.0(C-19)，149.5(C-16)，114.4(C-17)，56.0(C-5)，56.0(C-15)，52.4(C-8)，51.6(C-9)，43.7(C-4)，40.3(C-1)，39.8(C-10)，38.1(C-13)，37.6(C-3)，36.5(C-14)，33.6(C-7)，32.2(C-12)，28.8(C-18)，20.0(C-6)，18.8(C-2)，18.3(C-11)，15.5(C-20)。

表明所得化合物结构正确。

实施例3：

本发明所述的贝壳杉型二萜化合物Ⅰ的抗肿瘤活性实验

1）贝壳杉型二萜化合物Ⅰ对人实体肿瘤细胞系的增殖抑制作用

方法：采用SRB法。分别取对数生长期的人实体肿瘤细胞系（结肠癌细胞系Colon26、胰腺癌细胞系PANC-1、鼻咽癌细胞系CNE-2和胃癌细胞系SGC-7901）细胞接种于96孔培养板上，每孔接种量分别为5000/150μL、3000/150μL、3500/150μL和6000/150μL。实验设药物实验组、阴性对照组和空白对照孔。药物实验组每孔加不同浓度的本发明所述的贝壳杉型二萜化合物Ⅰ溶液50μL（化合物母液用营养液稀释），每个浓度做3个复孔；阴性对照组每孔加营养液50μL，共设6个复孔；空白对照孔只加营养液200μL，用于仪器调零。

在常规培养条件下，作用72h后取出，弃上清液控干水分，每孔加100μl4℃预冷的10%三氯醋酸溶液，静置5min后于4℃处避光保存1h以上；取出培养板用双蒸水洗涤4遍，控干水分；每孔加入0.4%的SRB溶液50μl，静置染色15min；用1%醋酸溶液洗涤4遍，控干水分；每孔加入100μl10mmol﹒L^-1Tris溶液，于振荡器上振荡5min使之完全溶解。用酶标仪在492nm波长处测定吸光度值（A）。按以下公式测得存在不同药物浓度时细胞的增殖抑制率：抑制率（%）=（1-药物干预组A₄₉₂空白对照组A₄₉₂）×100%，取各复孔平均值，计算各组的增殖抑制率。用SPSS12.0进行统计学分析，并计算IC₅₀。实验重复两次。

结果见表1和表2。

2）贝壳杉型二萜化合物Ⅰ对人白血病细胞系的增殖抑制作用

方法：采用MTT法。分别取对数生长期的人白血病细胞系（急性髓系白血病细胞系HL-60、慢性髓系白血病细胞系K562和淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4）细胞接种于96孔培养板上，每孔接种量分别为6000/150μL、7000/150μL和13000/150μL。实验设药物实验组、阴性对照组和空白对照孔。药物实验组每孔加不同浓度的本发明所述的贝壳杉型二萜化合物Ⅰ溶液50μL（化合物母液用营养液稀释），每个浓度做3个复孔；阴性对照组每孔加营养液50μL，共设6个复孔；空白对照孔只加营养液200μL，用于仪器调零。在常规培养条件下，作用72h后，每孔加入20μL MTT溶液（浓度为5mg/mL，用PBS配制，pH=7.4），继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150μL，震荡5min，待结晶完全溶解后，用酶标仪（BIO-RAD产品）在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值（A₅₇₀），各组取平均值，计算抑制率：IR＝（1－实验组A₅₇₀/对照组A₅₇₀）×100%。用SPSS12.0进行统计学分析，并计算IC₅₀。实验重复两次。

结果见表1和表2。

表1贝壳杉型二萜化合物Ⅰ对肿瘤细胞系的增殖抑制作用（x±SD,n=3）

表2贝壳杉型二萜化合物Ⅰ对肿瘤细胞系的半数抑制浓度

上述实验结果表明，本发明所述的贝壳杉型二萜化合物Ⅰ多种人实体肿瘤和白血病细胞系（Colon26、PANC-1、CNE-2、SGC-7901、K562、HL-60和MOLT-4）均具有显著的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性；作用72h的IC₅₀分别为0.33、1.77、2.33、2.49、2.39、2.51和3.22mg/L，说明贝壳杉型二萜化合物Ⅰ具有抗肿瘤活性。因此，本发明所述的贝壳杉型二萜化合物Ⅰ可用于制备抗肿瘤药物。

Claims

1.一种对映贝壳杉型二萜化合物，化学名为15-羰基-对映-贝壳杉-16-烯-19-酸，分子式为C₂₀H₂₈O₃，其结构式为：

。

2.如权利要求1所述的一种对映贝壳杉型二萜化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）卤地菊全草粗提取：卤地菊全草粉碎后加甲醇室温浸泡提取，减压浓缩得醇提浸膏；

2）萃取：步骤1）所得醇提浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3个萃取物；

4）Sephadex LH-20柱层析：将步骤3）所得的富集物上葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，以氯仿-甲醇洗脱，收集对映贝壳杉化合物的馏份，得对映贝壳杉化合物粗品；

5）对映贝壳杉化合物粗品的精制：将步骤4）所得对映贝壳杉化合物粗品上硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱，收集主要馏份，回收溶剂，得到一种对映贝壳杉型二萜化合物，其化学名为对映-贝壳杉-16-烯-19-酸，结构式为：

6）对映贝壳杉化合物的羟基化反应:将步骤5）所得的对映贝壳杉化合物Ⅱ溶于有机溶剂中，在催化剂的催化下，经氧化剂氧化，在化合物Ⅱ特定位置引入羟基，得到羟基化的化合物Ⅱ，结构如式Ⅲ；

7）对映贝壳杉化合物羰基化反应:将步骤6）中所得的对映贝壳杉化合物Ⅲ溶于有机溶剂中，并在温和氧化剂作用下将羟基氧化成羰基，得到对映贝壳杉型二萜化合物Ⅰ。

3.如权利要求2所述的一种对映贝壳杉化合物的制备方法，其特征在于在步骤6）中，有机溶剂是THF，催化剂是t-BuOOH，氧化剂是SeO₂，且化合物Ⅱ引入羟基的特定位置是15位。

4.如权利要求2所述的一种对映贝壳杉化合物的制备方法，其特征在于在步骤7）中，有机溶剂是DMF，温和的氧化剂是PDC。

5.如权利要求1所述的一种对映贝壳杉型二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。