CN101412726B

CN101412726B - 杂环类化合物

Info

Publication number: CN101412726B
Application number: CN2007101332485A
Authority: CN
Inventors: 彭国平; 郑云枫; 李红阳; 黄险峰
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2007-10-15
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2027-10-15
Also published as: CN101412726A

Abstract

本发明涉及天然药物化学领域，公开了如式(1)所示的三个杂环类新化合物的化学结构，以及该化合物的制备方法及在医药领域中的用途。尤其在制备预防与治疗与抗细胞缺氧有关疾病及抗肿瘤有关的药物中的用途。

Description

杂环类化合物

[技术领域]

本发明属于天然药物化学领域，涉及三个杂环类新化合物，以及该新化合物的制备方法及在医药领域中的用途，尤其是在制备预防与治疗细胞缺氧有关疾病及抗肿瘤有关的药物方面的应用。

[背景技术]

心脑血管疾病及肿瘤是危害人类生命和健康的两大疾病，据最新统计资料，2000年全世界有1700万人死于心血管疾病，占全球各种原因总死亡人数的1/3，预计到2020年这个数字将增至2500万。此外，由于环境污染、臭氧层的破坏，水源、食品的污染等使得肿瘤的发病率急剧上升。世界卫生组织预测：21世纪肿瘤将成为人类的“第一杀手”。

根据1997年我国人口死因分析，城市人口死亡原因中肿瘤占第一位，脑血管病占第二位，两者的数值近于相等；农村人口死亡原因中呼吸系统疾病占第一位，脑血管病占第二位。缺血性脑血管病在全部脑血管病中约占70％，心脑血管疾病有着相当高的发病率及致残率，不容忽视。

[发明内容]

本发明的目的是要提供具有抗细胞缺氧及抗肿瘤作用的杂环类新化合物，为研制能预防或治疗与细胞缺氧有关的疾病或具有抗肿瘤作用的新药提供新的天然活性物质。

本发明是通过如下技术方案完成的，具体内容包括：三个杂环类新化合物的提取分离，结构鉴定，抗细胞缺氧研究、抗肿瘤细胞研究及可能的医药用途的探讨。

(1)提取分离

水蛭药材，用乙醇回流提取，提取液经减压浓缩得乙醇提取物。此提取物再溶于水制成混悬液，之后再经大孔吸附树脂吸附，乙醇溶液洗脱，乙醇洗脱液减压浓缩，再利用ODS柱层析进行反复分离，通过重结晶纯化，最终获得三个杂环类化合物。

(2)结构鉴定

化合物1

化合物1为红棕色粉末，HR-TOF-MS m/z：308.9747[M-H]^-(calc.308.9752)，ESI-MS给出了准分子离子峰m/z：309.1[M-H]^-，结合¹H NMR及¹³C NMR，确定其分子式为C₁₀H₆O₄N₄S₂。

IR(KBr)显示有3500～3200cm^-1活泼氢的特征吸收宽峰和1723cm^-1羰基的特征吸收峰。¹H NMR(DMSO)显示，1含有一个甲基δ2.85(3H，s)，三个活泼氢：δ7.40(1H，brs)、δ11.72(1H，brs)、δ12.03(1H，brs)；¹³C NMR结合HMQC显示，化合物1含有1个甲基碳δ16.520，以及9个不饱和季碳原子。

由于1含有较多季碳及杂原子，基本没有二维谱信息。为了获得化合物1的结构，我们通过成盐反应，在5％氨水溶液中重结晶得到了化合物1的铵盐晶体。单晶X射线衍射分析表明，化合物1的铵盐晶体属单斜晶系，空间点群P2(1)/n；晶胞参数：a＝7.2571(9)A，b＝8.5170(11)A，c＝21.510(3)A；晶胞体积V＝1576.7(3)；晶胞内分子数为4，见图7-11。

根据以上分析，我们确定了化合物1的分子结构，经检索，该化合物为新化合物，命名为水蛭胺A，结构式如下：

Figure DEST_PATH_G200710133248520080125D000011

化合物1

化合物2

化合物2为黄色粉末，HR-TOF-MS m/z：349.0045[M+Na]⁺(req.349.0041)，参考化合物1并检索，确定其分子式为C₁₁H₁₀O₄N₄S₂。ESI-MS正离子质谱给出了M/S 327.0的[M+H]⁺准分子离子峰，负离子质谱给出了M/S 325.1的[M-H]^-准分子离子峰，与上述分子式相符合。IR(KBr)的特征吸收峰与(1)相似，有3500～3200cm^-1活泼氢的特征吸收宽峰和1696cm^-1羰基的特征吸收峰。¹H NMR(DMSO)显示，化合物2含有一个单峰甲基δ2.57(3H，s)，两组相互偶合的氢δ3.60(2H，d，J＝5.7)、δ5.32(1H，t，J＝5.7)，δ11.77(1H，d，J＝1.7)、δ12.04(1H，d，J＝1.7)以及δ5.12(1H，brs)，δ6.30(1H，brs)；滴加D₂O后测定，氢谱显示原δ5.12、δ6.30、δ11.77、δ12.04的峰均消失，说明上述四个氢原子均为活泼氢；其乙酰化产物的 ¹H NMR(DMSO)进一步确定，δ5.12、δ6.30的两个活泼氢均为羟基上的氢。(2)的¹³C NMR表明该化合物有11个碳，结合DEPT谱进一步显示，其中低场的8个碳原子均为季碳，此外还含有1个CH(δ69.626)，1个CH₂(δ66.057)，1个CH₃(δ17.34)及8个季碳。

根据化合物2和1的氢谱、碳谱及分子式比较，我们推测两者具有十分相似的母核。化合物2与1的碳谱相比，少了低场δ163.71的峰，而多了CH(δ69.85)和CH₂(δ66.28)的峰，根据其化学位移值推测，化合物1可能就是2中支链-CH(OH)CH₂OH氧化成-COOH后的产物，氢谱亦支持了以上的推测。

二维相关谱进一步确证了以上推测。¹H-¹H COSY主要显示了二组氢氢自旋体系：H-14(δ5.32)与14-OH(δ6.30)、H-15(δ5.12)相关，H-15(δ3.60)与15-OH(δ5.12)相关；而H-1(δ12.04)与H-3(δ11.77)相关。COLOC谱中主要有以下重要的相关信息：1-NH(δ12.04)与C-5(δ126.01)相关；3-NH(δ11.77)与C-4、C-5(δ161.25、126.01)相关；14-OH(δ6.30)与C-12、C-15(δ153.47、66.28)相关；H-15(δ3.60)与C-12(δ153.47)；H-14、H-17(δ5.12、2.55)均与C-13(δ121.66)相关；H-17(δ2.55)与C-12(δ153.47)相关。

根据以上分析，我们确定了化合物2的分子结构，经检索，该化合物为新化合物，命名为水蛭胺B，结构式如下：

化合物2

化合物3

化合物3为淡黄色粉末，HR-TOF-MS m/z：304.9780[M+Na]⁺(req.304.9779)的离子峰，检索并确定其分子式为C₉H₆O₃N₄S₂。

¹H NMR(DMSO)显示化合物3在低场有两个活泼氢δ12.13(1H，s)和δ11.81(1H，s)，高场有一个单峰甲基δ3.06(3H，s)以及一个不饱和碳原子上的氢δ8.51(1H，s)，¹³C NMR表明该化合物有9个碳，DEPET谱进一步显示，其中含有1个CH(δ131.0)和CH3(δ40.7)，以及7个季碳。根据碳氢的化学位移及分子式，可以推测化合物3的母核与化合物1、(2)基本一致。

此外，化合物3的HMBC谱显示1-NH(δ12.13)与C-5(δ126.33)相关；3-NH(δ11.81)与C-4、C-5(δ160.46、126.01)相关；12-H(δ8.41)与C-7(δ140.11)、C-8(δ158.45)相关；H-15(δ3.06)与C-12(δ131.03)、C-13(δ137.78)有相关。

根据以上信息，我们可以推测出化合物3的主要分子结构如下：

与高分辨质谱给出的分子式相比，以上结构少了一个O原子，与化合物1的碳谱、氢谱比较后发现，化合物3中C-12由于羧基的缺失而导致化学位移值向高场移动，而C-13、C-15以及H-15的化学位移值均向低场出现了较大移动，此变化应该是由于O原子的存在而产生的，据此推测，存在O原子与S-14相连的亚砜结构。

此外，化合物3的红外光谱图中不仅有羰基在1701cm^-1及活泼氢原子在3500～3200cm^-1的特征吸收峰，还出现了1046cm^-1的亚砜特征吸收峰，进一步说明了该结构片断的存在。

综合以上分析，推断出了化合物3的分子结构，经检索，该化合物为新化合物，命名为：水蛭胺C，结构式如下：

化合物3

化合物1～3的¹H NMR and ¹³C NMR数据(500MHz、DMSO-d₆)

(3)抗细胞缺氧实验

1、实验材料

1.1药品与试剂

化合物1，化合物2、化合物3；尼莫地平，购于山东新华制药有限公司；连二亚硫酸钠、氯化钾、过氧化氢，购自南京化学试剂一厂；高糖DMEM培养基，购自Gibco公司；小牛血清(NCS)，购自杭州四季青生物工程公司；MTT，购自Sigma公司。

1.2细胞

细胞PC12细胞株(大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞株)，中国科学院上海生物化学与细胞研究所提供。以高糖DMEM培养液，内含10％小牛血清，0.0583mg/L青霉素，100mg/L链霉素，pH7.2培养。

2、实验方法

参照文献方法[中国实验方剂学杂志，2005，11(5)55-58页]，进行连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)诱导的PC12细胞损伤的影响实验：各试验药物用PBS(磷酸盐缓冲溶液pH7.0)配制成各溶液。取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，D-Hank’s液洗涤2次，加入无血清DMEM，将细胞分为(1)正常组、(2)模型组、(3)尼莫地平组(4)-(6)化合物1组，(7)-(9)化合物2组，(10)-(12)化合物3组，(2)～(12)组每孔加入终浓度8mmol/L的Na₂S₂O₄造模，37℃，5％CO2培养箱作用4h，弃去培养液用D-Hank’s液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24h。MTT法观察细胞活力。

3、实验结果

实验数据

4、实验结论

化合物(1)、化合物(2)均具有较强的抗细胞缺氧作用，其EC₅₀分别为26.6μg/ml，18.2μg/ml。化合物(3)抗细胞缺氧作用很弱。

(4)抗肿瘤细胞实验

1、实验材料

1.1药品与试剂

化合物1，化合物2、化合物3；阳性对照品：5-Fu(上海旭东海普制药厂，25mg/ml，041015)；RPMI-1640(Gibco，1252996)，小牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司，20050517)，Trypsin(Amresco，2430B18)，MTT(Sigma，03H5079)，DMSO(Sigma)，

1.2细胞

A549(人肺癌细胞)，南京中医药大学中医药研究院药理室提供。

2、实验方法

接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的肿瘤细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔0.4×10⁴个(2×10⁴个/ml，0.2ml)细胞接种于96孔板中，将培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时后加药。

加药：0.2、2、20μg·ml-1(终浓度)每个浓度平行6孔，用培养基稀释后加入(空白对照孔：不加细胞，只加培养液；阴性对照孔：除不加药物外，其余操作相同)，细胞继续培养24小时。

呈色：弃上清，每孔加200μl新鲜配制的含0.4mg·ml-1 MTT的无血清培养基，继续培养4h，然后弃上清加200μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀。

比色：酶标仪测定490/570nm处光密度值(以空白对照孔调零)，按下式计算肿瘤细胞抑制率，

细胞抑制率(％)＝(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100％，并计算半数抑制浓度IC50。

3、实验结果

实验数据

4、实验结论

化合物1、化合物2、化合物3均具有较强的抗细胞缺氧作用，其IC₅₀分别为22.16μg/ml，16.76μg/ml，11.90μg/ml。

具体实施方式

[说明书附图]

图1.化合物1的HR-TOF-MS谱

图2.化合物1的ESI-MS(负离子)谱

图3.化合物化合物1的红外光谱图(KBr)

图4.化合物1的¹H NMR谱(500MHz，DMSO-d₆)

图5.化合物1的¹C NMR谱(500MHz，DMSO-d₆)

图6.化合物1的UV光谱(MEOH)

图7.化合物1的铵盐X-Ray实验数据

图8.化合物1结构中碳、氢、氮、氧及硫原子之间键的键长

图9.化合物1结构中碳、氢、氮、氧及硫原子之间键的夹角

图10.化合物1结构中碳、氮、氧及硫原子之间的扭曲夹角

图11.化合物1的铵盐分子结构

图12.化合物2的HR-TOF-MS谱

图13.化合物2的ESI-MS(正离子)谱

图14.化合物2的ESI-MS(负离子)谱

图15.化合物2的红外光谱图(KBr)

图16.化合物2的¹H NMR谱(300MHz，DMSO-d₆)

图17.化合物2的¹H NMR谱(300MHz，DMSO-d₆+D₂O)

图18.化合物2乙酰化产物的¹H NMR谱(300MHz，CDCl₃)

图19.化合物2的¹³C NMR谱(300MHz，DMSO-d₆)

图20.化合物2的DEPT谱(300MHz，DMSO-d₆)

图21.化合物2的H-H COSY谱(300MHz，DMSO-d₆)

图22.化合物2的C-H COSY谱(300MHz，DMSO-d₆)

图23.化合物2的COLOC谱(300MHz，DMSO-d₆)

图24.化合物3的红外光谱图(KBr)

图25.化合物3的HR-TOF-MS谱

图26.化合物3的UV光谱(MEOH)

图27.化合物3的¹H NMR谱(500MHz，DMSO-d₆)

图28.化合物3的¹³C NMR谱(500MHz，DMSO-d₆)

图29.化合物3的¹³C-DEPT谱(500MHz，DMSO-d₆)

图30.化合物3的HMBC谱(500MHz，DMSO-d₆)

实施例一

水蛭药材10Kg，切断，加水提取两次，水用量分别为药材重的7、5倍，合并提取液并浓缩至20L，通过大孔树脂(AB-8，10kg)，用水冲冼后，30％乙醇洗脱，洗脱液回收浓缩至1L，放置48小时，有沉淀析出。取沉淀物经ODS中压柱层析，以甲醇-水(30∶70)洗脱分离，得化合物1，重结晶即得；浓缩液经ODS中压柱层析，以甲醇-水(15∶85)洗脱分离，分得化合物2、(3)，重结晶即得。

实施例二

水蛭药材10Kg，切断，加70％乙醇提取两次，用量分别为药材重的7、5倍，合并提取液并回收溶剂，加水至20L，通过大孔树脂(HP-20，10kg)，用水冲冼后，50％乙醇洗脱，洗脱液回收浓缩至1L，放置48小时，有沉淀析出。取沉淀物经ODS中压柱层析，以乙醇-水(30∶70)洗脱分离，得化合物1，重结晶即得；浓缩液经ODS中压柱层析，以乙醇-水(15∶85)洗脱分离，分得化合物2、(3)，重结晶即得。

Claims

1.杂环类化合物，其特征在于该化合物具有(1)式所示的化学结构：

其中 R₁＝-SCH₃ R₂＝-COOH

或 R₁＝-SCH₃ R₂＝-CHOHCH₂OH

或 R₁＝-SOCH₃ R₂＝-H。

2.根据权利要求1的杂环类化合物的制备方法，其特征在于以水蛭为原料，经水或70％乙醇提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，70％乙醇提取液回收醇后加水溶解，之后再经大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂吸附物经反复柱层析分离而得，其中大孔吸附树脂为AB-8或D4020或D101或HP-20，柱层析用担体为硅胶或氧化铝或ODS。

3.根据权利要求1所述的杂环类化合物在制备预防与治疗与抗细胞缺氧有关疾病的药物中的用途。