CN104774232A

CN104774232A - 雪胆葫芦烷型四环三萜化合物,含有该化合物的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN104774232A
Application number: CN201510192476.4A
Authority: CN
Inventors: 姚庆强; 周玲; 邓志鹏; 李莹; 郑重飞; 孙敬勇; 牟艳玲; 刘拥军
Original assignee: INSTITUTE OF MATERIA MEDICA SHANDONG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MATERIA MEDICA SHANDONG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-21
Also published as: CN104774232B

Abstract

本发明涉及新颖的结构式(Ⅰ)或结构式(II)表示的雪胆葫芦烷型四环三萜化合物。本发明还涉及以该化合物为活性成份的药物组合物，以及本发明化合物和药用组合物在治疗肺腺癌、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。

Description

雪胆葫芦烷型四环三萜化合物,含有该化合物的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一类新化合物，具体地说是一种雪胆葫芦烷型四环三萜化合物，含有该化合物的药物组合物及其应用。

背景技术

雪胆，别名金龟莲、金盆，为葫芦科植物雪胆(Hemsleya amabilis Diels)及其同属数种植物的干燥块根。本品性苦、寒，入胃、大肠二经，具有清热解毒，抗菌消炎的功效。雪胆属植物全世界有31种，除2种产于印度、越南外，主要分布于我国云、贵、川三省，该属中多种植物为常用中药。雪胆属植物的主要成份为齐墩果烷型五环三萜及其皂苷和葫芦烷型四环三萜及其皂苷。药理研究表明雪胆具有抑菌作用、抗肿瘤作用、体外抗HIV活性等，国内对该植物化学成份研究较多，抗癌活性方面研究较少。

申请人在公开号为CN103665082A、CN103626824A的专利文献中公开过若干雪胆葫芦烷型四环三萜化合物，并公开了其在制备抗癌药物方面的应用，但其抗癌效果仍有较大提升空间。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种雪胆葫芦烷型四环三萜化合物。

本发明进一步的技术任务是提供含有该化合物的药物组合物。

本发明再进一步的技术任务是提供上述化合物的应用。

本发明提供了由下述结构式(Ⅰ)或结构式(II)表示的雪胆葫芦烷型四环三萜化合物，

R₁＝CHO，R₂＝CH₃，R₃＝OH

或者R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝OH

或者R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝＝O；

R＝H或R＝Glu。

以雪胆块茎为原料，用溶剂提取后，经层析纯化或ODS纯化即可提取得到式(I)表示的化合物。

提取方法主要包括以下步骤：

(1)取干燥的雪胆块茎粉碎后用溶剂加热回流提取3次，每次2h，减压浓缩得到浸膏。所述溶剂为水、丙酮、醇类或水醇混合物，其中醇为C₁-C₄的短链醇。

(2)粗提取用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为洗脱剂分别用石油醚、氯仿：丙酮、氯仿：甲醇、氯仿：甲醇：水、纯甲醇。

步骤(2)中粗提取还可以用ODS开口柱层析纯化，薄层监控合并相同流分，洗脱剂为40％-70％水醇溶液，所述醇为甲醇、乙醇、异丙醇。

从雪胆根茎提取本发明化合物的另一种方法步骤如下：

(2)浸膏以水混悬后，用有机溶剂萃取；萃取后的母液经D101大孔树脂洗脱，洗脱剂为水或水醇溶液，所述醇为甲醇、乙醇、异丙醇，所述有机溶剂为乙醚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的任何一种、任何两种或两种以上的组合配合使用。

申请人发现上述结构式(Ⅰ)和结构式(II)表示的化合物在抗癌方面均具有显著效果。

本发明的药物组合物，其中含有结构式(Ⅰ)和/或结构式(II)表示的雪胆葫芦烷型四环三萜化合物为有效成份，并含有常规药用载体。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇等。另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。

结构式(Ⅰ)或结构式(II)所示化合物在制备治疗肺腺癌、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。

含有结构式(Ⅰ)和/或结构式(II)所示化合物的组合物在制备治疗肺腺癌、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。

本发明的化合物、组合物可以经口服或注射等形式给药，给药量因给药途径不同而各有不同，对成人来说，每天2mg－10mg比较合适。

用于口服给药时，可将其制成常规的固体制剂，如颗粒剂、胶囊、片剂等；制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂，如糖浆等。用于非口服给药时，可将其制成注射液、输液剂或栓剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如将活性成份与一种或多种载体混合，然后将其制成所需剂型。

实施方式

下面的实施例、制剂实施例以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

〔实施例1〕：

1、提取与分离

取干燥雪胆块茎4kg，粉碎后用乙醇回流提取3次，每次2h。提取液浓缩后得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取。乙酸乙酯部分进行反复硅胶柱层析、凝胶柱层析、ODS柱层析，洗脱剂分别用氯仿：丙酮、氯仿：甲醇、氯仿：甲醇：水、纯甲醇。正丁醇部位先经D101大孔树脂柱层析，依次用20％、40％、60％、80％乙醇溶液洗脱。从粗提物中共得到11个化合物，其中有5个为新葫芦素类化合物。

下面是之前申请中的提取与分离方法：

雪胆(Hemsleya amabilis Diels)干燥根茎9kg,95％乙醇加热回流提取3次,每次2h,合并提取液后减压浓缩,得乙醇提取物2018g,用等体积的水混悬,依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取,得乙酸乙酯提取物700g。乙酸乙酯部位200g经硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(98:2,95:5,93:7,90:10,85:15,80:20,100:0)得到5个流分(Fr.I-Fr.V)。Fr.I(21g)经硅胶柱色谱,氯仿-甲醇梯度洗脱(98:2,95:5,93:7,90:10,85:15,80:20,100:0)及HPLC得到化合物4(30mg)；Fr.II经硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(98:2,96:4,94:6,92:8,90:10,80:20,100:0)得到9个流分(Fr.II 1-9)。Fr.II-6(1.5g)和Fr.II-7(900mg)分别经ODS柱色谱(甲醇-水,60:40)及制备HPLC得到化合物1(28mg),化合物2(15mg)，化合物3(32.5mg)。Fr.III(19g)经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(97:3,96:4,95:5,93:7,90:10,85:15,80:20,100:0),ODS柱色谱(甲醇-水,60:40)及制备HPLC得到化合物5(18mg)。

2、化合物的结构鉴定：

Compound 1【化合物1，结构式(Ⅰ)表示的化合物(R₁＝CHO，R₂＝CH₃，R₃＝OH)】：

白色无定形粉末。HR-ESI-MS m/z:636.4474[M+NH₄]⁺(计算值为C₃₆H₅₆O₈NH₄636.4475),给出该化合物的分子式为C₃₆H₅₈O₈。红外光谱分别在3423,1684,1637处有吸收峰,提示该化合物结构中有羟基和共轭的羰基。¹H NMR和¹³C NMR给出7个角甲基信号δ_C 9.7,17.4,19.2,19.6,26.4,26.4,28.1；9个亚甲基,14个次甲基和6个季碳(包括两个双键碳信号在δ_C 144.5,156.6)，推测该化合物可能为葫芦烷型三萜。此外,碳氢谱结合HMQC谱推断结构中还存在α,β-不饱和醛δ6.60(1H,t,J＝7.2),156.6；139.2；9.37(1H,s)，196.2。NMR谱图分析表明化合物1的苷元与已知化合物Jinfushanoside G基本一致,差别在于化合物Jinfushanoside G中C-26位含羟基基团的次甲基被醛基取代形成α,β-共轭双键。¹H NMR在δ4.12(1H,d,J＝7.8)处给出一个端基质子信号,结合端基碳信号δ106.3,推断结构中存在一个β构型的糖单元。化合物1(4mg)与纤维素酶(20mg)溶于4ml纯净水中，并于40℃下水解反应120h，水解液经TLC检测到葡萄糖，其绝对构型通过将葡萄糖转化为1-[(S)-N-acetyl-a-methylbenzylamino]-1-deoxyglucitol acetate衍生物后进行HPLC分析，并与D型和L型标准糖的衍生物进行比较，确定化合物1的糖单元为β-D-葡萄糖。根据以上解析，经文献检索确定该化合物为一新化合物，命名为3β-hydroxycucurbita-5,24-diene-11-hydroxy-26-al-3-O-β-D-glucopyranoside。¹H NMR和¹³C NMR数据归属见表1和表2。

Compound 2【化合物2，结构式(Ⅰ)表示的化合物(R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝OH)】：

白色无定形粉末。HR-ESI-MS m/z:638.4630[M+NH₄]⁺(计算值为C₃₆H₅₆O₈NH₄638.4632),给出该化合物的分子式为C₃₆H₆₀O₈。¹H NMR和¹³C NMR给出7个角甲基信号δ_C 17.36,19.34,19.58,22.13,26.43,26.43，28.07；10个亚甲基,13个次甲基和6个季碳(包括两个双键碳信号在δ_C 144.51,136.04)。NMR谱图分析表明化合物2的苷元与已知化合物Jinfushanoside G基本一致,差别在于化合物Jinfushanoside G中C-26位含羟基基团的次甲基的化学位移δ_C向高场移至22.1，而C-27的化学位移向低场移至62.1。而NOESY谱中H-24/C-26的相关进一步证明了这一点。¹H NMR在δ4.14(1H,d,J＝7.8)处给出一个端基质子信号,结合端基碳信号δ106.27,推断结构中存在一个β构型的糖单元。糖绝对构型的确定参考化合物1中的方法。根据以上解析，经文献检索确定该化合物为一新化合物，命名为3β-hydroxycucurbita-5,24-diene-11-hydroxy-26-al-3-O-β-D-glucopyranoside。¹H NMR和¹³C NMR数据归属见表1和表2。

Compound 3【化合物3，结构式(Ⅰ)表示的化合物(R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝＝O)】：

白色无定形粉末。HR-ESI-MS m/z:636.4474[M+NH₄]⁺(计算值为C₃₆H₅₆O₈NH₄636.4475),给出该化合物的分子式为C₃₆H₅₈O₈。红外光谱分别在3405,1691处有吸收峰,提示该化合物结构中有羟基和共轭的羰基。NMR谱图分析表明化合物3的苷元与已知化合物delvanosides D基本一致,差别在于化合物delvanosides D中C-26含羟基基团的次甲基与C-27位的甲基发生了交换，从而变成一个双键顺式结构，这一点从NOESY谱上H-24/C-26甲基的相关得到证明，而delvanosides D的NOESY谱中发现H-24/C-26羟甲基相关，进一步说明这是一个新的顺式结构。¹H NMR在δ4.12(1H,d,J＝7.8)处给出一个端基质子信号,结合端基碳信号δ106.19,推断结构中存在一个β构型的糖单元。糖绝对构型的确定参考化合物1中的方法。根据以上解析，经文献检索确定该化合物为一新化合物，命名为3β-hydroxycucurbita-5,24-diene-11-hydroxy-26-al-3-O-β-D-glucopyranoside。¹H NMR和¹³C NMR数据归属见表1和表2。

Compound 4【化合物4，结构式(II)表示的化合物(R＝H)】：

白色无定形粉末。HRESIMS(positive)m/z:620.3796[M+NH₄]⁺(计算值为C₃₄H₅₀O₉NH₄620.3799),给出化合物的分子式为C₃₄H₅₀O₉。¹H NMR，¹³C NMR和DEPT谱给出10个角甲基信号(δ_C:18.97,20.34,20.45,21.48,22.35,22.42,23.99,25.56,26.99),4个亚甲基，9个次甲基，11个季碳信号，一个双键信号δ5.64(1H,m),119.2；142.4和一个羰基碳信号δ213.1。此外,¹HNMR给出一对双键烯碳上的氢信号δ6.94(1H,d,J＝16.0)；6.74(1H,d,J＝16.0),¹³C NMR数据给出一对烯碳信号δ151.11,121.53及一个羰基信号204.01,推断该化合物中存在α,β-不饱和羰基。根据C-2,3位氢偶合常数δ3.27(1H,m),2.83(1H,d,J＝9.2)推断化合物C-2,3位羟基为2α,3β-构型。检索文献发现化合物4与得到的葫芦素F结构非常相似,仅在C-16,C-25有区别。化合物4中δ70.67(C-16)向低场移动3.47ppm，δ74.65(C-25)向低场移动5.57ppm推断可能被乙酰基取代，通过HMBC谱中δ5.25(H-16)与δ170.63(乙酰基上羰基)相关可确定。根据以上解析，经文献检索确定该化合物为一新化合物，命名为cucurbitacinF-16,25-diacetate。¹H NMR和¹³C NMR数据归属见表1和表2。

Compound 5【化合物4，结构式(II)表示的化合物(R＝Glu)】

白色无定形粉末。HRESIMS(positive)m/z:782.4329([M+NH₄]⁺)(计算值为C₄₀H₆₀O₁₄NH₄782.4327),给出化合物的分子式为C₄₀H₆₀O₁₄。¹H NMR中糖的端基质子信号δ4.32(1H,d,J＝7.8)结合端基碳信号δ106.4推断结构中存在一个β构型的糖单元。比较化合物5和化合物4的¹H NMR和¹³C NMR数据发现,化合物4多一个葡萄糖单元。¹³C NMR数据中化合物5的δ81(C-3)向低场移动12.1ppm,表明多余的糖连接在苷元的C-3位。HMBC谱中δ4.31(H-glc-1)与δ93.1(C-3)相关可进一步证明。糖绝对构型的确定参考化合物1中的方法。根据以上解析，经文献检索确定该化合物为一新化合物，命名为2α,3β,20β-trihydroxycucurbita-5,23-diene-11,22-dione-16,25-acetyl-3-O-β-D-glucopyranoside。¹H NMR和¹³C NMR数据归属见表1和表2。

表1.400MHz ¹H data for compounds 1-5 in d₆-DMSO

表2.100MHz ¹³C data for compounds 1-5 in d₆-DMSO

本发明涉及一种雪胆葫芦烷型四环三萜化合物在制备治疗肺腺癌、结肠癌、前列腺癌的药物方面的应用。通过下面试验说明本发明化合物的细胞毒活性。

〔试验实施例1〕对3种人癌细胞的体外细胞毒作用观察

1.1样品

实施例1中所得的5个雪胆葫芦烷型四环三萜类化合物，分别用二甲基亚砜(DMSO，终浓度0.8％)溶解，用含15％小牛血清RPMI1640培养基配成1mg/ml备用，用时稀释成所需浓度。选择注射用顺铂(CDDP CISPLATIN FOR INJECTION)作为阳性对照。

1.2细胞株

本实验采用3种人癌细胞株，其中包括：

H460(人肺腺癌)、SW-620(人结肠癌)和DU145(人前列腺癌)细胞系，以上细胞系均在含15％小牛血清的RPMI1640培养基、置CO₂培养箱内培养。

上述细胞株均购于中国科学院细胞库，由山东省医学科学院药物研究所药理室传代保存。

1.3实验方法

细胞培养及药物作用：分别取H460(人肺癌)、DU145(人前列腺癌)和SW620(人结肠癌)指数生长期的细胞经洗涤后，用0.25％胰酶消化后计数，调整细胞数为1×105/ml接种于96孔板内，每孔0.1ml，置CO2孵箱内培养。培养24小时后分别加入12个样品。作用于H460、DU145和SW620细胞样品高剂量组药物浓度均为100μg/ml，按5倍依次稀释至0.01μg/ml，共5个剂量组。每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔及DMSO(0.8％)对照孔。在37℃二氧化碳培养箱内培养48小时后，用MTT方法测定OD值，计算细胞抑制率。

细胞终止培养后，每孔加入10μl0.5％MTT置CO2孵箱内，4小时后取出倾去孔内液体加入DMSO(0.2ml/孔)，充分振荡，使蓝紫色甲臜溶解，于多功能标记分析仪570nm波长处记录OD值，采用不同浓度受试药物3复孔OD值的均值计算细胞的抑制率及IC50。

以不同药物浓度对细胞的抑制率作图可得剂量反应曲线，从中得出药物的半数抑制浓度(IC₅₀)。

1.4实验结果

雪胆葫芦烷型四环三萜化合物在体外对人肿瘤细胞生长的影响实验结果见表3。

5个雪胆葫芦烷型四环三萜样品对H460(人肺腺癌)作用48h除样品1以外均有细胞毒作用。5种样品对SW-620(人结肠癌)作用48h均有细胞毒作用。5种样品对DU145(人前列腺癌)作用48h除样品3以外均有细胞毒作用。样品1对H460(人肺腺癌)作用48h无细胞毒作用。样品3对DU145(人前列腺癌)作用48h无细胞毒作用。

表3.雪胆葫芦烷型四环三萜在体外对人肿瘤细胞生长的影响

1.5结论

根据本发明人的研究，雪胆葫芦烷型四环三萜化合物抗癌效果良好，尤其化合物4的抗癌效果最为显著，可用于制备抗肺癌或抗结肠癌药物。

〔制剂实施例1〕片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成份：

化合物1【结构式(I)表示化合物(R₁＝CHO，R₂＝CH₃，R₃＝OH)】2mg、

乳糖80mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮18mg。

〔制剂实施例2〕片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成份：

化合物4【结构式(II)表示化合物(R＝H)】2mg、

乳糖80mg、硬脂酸镁10mg、聚乙烯吡咯烷酮18mg。

〔制剂实施例3〕胶囊

按照本领域已知的方法制备胶囊，每个胶囊中含有下述成份：

化合物1【结构式(I)表示化合物(R₁＝CHO，R₂＝CH₃，R₃＝OH)】1mg、

化合物4【结构式(II)表示化合物(R＝H)】1mg、

乳糖85mg、玉米淀粉30mg、硬脂酸镁3mg、

聚乙烯吡咯烷酮10mg。

〔制剂实施例4〕胶囊

化合物2【结构式(I)表示化合物(R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝OH)】1mg、

化合物4【结构式(II)表示化合物(R＝H)】1mg、

乳糖85mg、玉米淀粉30mg、

硬脂酸镁3mg、聚乙烯吡咯烷酮10mg。

Claims

1.由下述结构式(Ⅰ)或结构式(II)表示的雪胆葫芦烷型四环三萜化合物，

R₁＝CHO，R₂＝CH₃，R₃＝OH

或者R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝OH

或者R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝＝O；

R＝H或R＝Glu。

2.药物组合物，其中含有结构式(Ⅰ)和/或结构式(II)表示的雪胆葫芦烷型四环三萜化合物为有效成份，并含有常规药用载体，

R₁＝CHO，R₂＝CH₃，R₃＝OH

或者R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝OH

或者R₁＝CH₃，R₂＝CH₂OH，R₃＝＝O；

R＝H或R＝Glu。

3.权利要求1化合物在制备治疗肺腺癌、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。

4.权利要求2组合物在制备治疗肺腺癌、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。