CN103610762B - 一种塞北紫堇总生物碱提取物及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种塞北紫堇总生物碱的提取物，由如下步骤提取包括，将塞北紫堇药材粉碎，并利用饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇回流提取，再浓缩、干燥得到塞北紫堇提取物；然后利用酸溶液溶解过滤，其滤液加碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取，得到塞北紫堇总生物碱粗提物，然后再进行纯化得到塞北紫堇总生物碱提取物。采用本发明所述方法得到的所述的塞北紫堇总生物碱提取物中总生物碱的含量不低于50wt%，包括10-12wt%的原阿片碱，8-10wt%的α-比枯枯灵和10-15wt%的黄紫堇明碱，研究表明该生物碱提取物具用抗乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肺癌的作用。

Description

一种塞北紫堇总生物碱提取物及其提取方法

技术领域

本发明涉及一种中草药的提取物及其提取方法，具体地说，涉及一种藏药材塞北紫堇的总生物碱提取物及其提取方法。

背景技术

藏药塞北紫堇为罂科紫堇属植物塞北紫堇（别名赛北紫堇）的干燥全草，分布在青海、西藏、甘肃、四川等地，为藏成药中的常用药，数据显示有25%的藏成药中含有该药材，其药材中所含成分主要是各种生物碱。藏医中多用紫堇属植物的全草入药，有些也用该植物的根、茎、叶等不同部位单独入药，主要用于治疗各种出血症状，发烧、流感、胃肠及肝胆的炎症性疾病，也可用于治疗跌打损伤或其它外伤等。目前，从该植物中分离得到的各类生物碱成分已经有许多，这些生物碱具有广泛的生物学活性，如抗氧化、消炎、抗心律失常和保护肝伤等等。此外，该植物中的生物碱能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，可以改善记忆，所以还用来治疗老年痴呆症。李吉昌、王俊等发表的《云南紫堇属植物的研究进展》中对紫堇属植物目前的功效进行了概括，其中明确表明赛北紫堇全草入药，具有治疗疥癣疮毒、胃炎、胃溃疡、跌打损伤的功效。宋晓楠、吴训等发表的《赛北紫堇总生物碱抗炎作用研究》（湖北农业科学，2013，52（6））对赛北紫堇总生物碱的抗炎性能进行了系统研究。

生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质，又称为赝碱，大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。具有光学活性，有些不含碱性而来源于植物的含氮有机化合物，有明显的生物活性，也包括在生物碱的范围内。目前，已知的生物碱种类很多，约在一万种左右，有一些结构式还没有完全确定，它们的结构比较复杂，可分为59种类型。随着新的生物碱的发现，分类也将随之而更新，由于生物碱的种类很多，各具有不同的结构式，因此，彼此间的性质会有所差异。

现有技术中，提取植物中总生物碱的方法为有机溶剂萃取法和色谱法两种，色谱法中常用的为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱和离子交换树脂三种，上述方法虽然都可以制备总生物碱，但存在产物得率低，杂质含量高的问题，并且通过该方法直接得到的总生物碱的药用性能稍差，不能满足临床的研究及应用。

发明内容

本申请解决的技术问题是，现有技术中对于藏药塞北紫堇的研究仅集中于抗氧化、消炎、抗心律失常和保护肝伤，进而扩大其应用领域，提供一种具有抗癌作用的塞北紫堇总生物碱，并进一步提供了所述塞北紫堇总生物碱的提取方法。

为此，本发明采服的技术方案为：

一种塞北紫堇总生物碱的提取物，由如下步骤提取，

（1）将塞北紫堇药材粉碎，并利用50-95%体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

（2）将所述塞北紫堇提取液浓缩、干燥得到塞北紫堇提取物；

（3）向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4%的酸溶液溶解，其中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为（1-6）：1，过滤得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15%的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

（4）向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量。

（5）取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物，其提取步骤如下，

（1）将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用50-95%体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取3-8次，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

（2）将所述塞北紫堇提取液浓缩至清膏、干燥得到塞北紫堇提取物；

（3）向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4%的酸溶液溶解过滤若干次，每次的溶解过滤步骤中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为（1-6）：1，收集过滤得到所有滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15%的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

（4）向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量。

（5）取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物，其提取步骤中，所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸的水溶液；所述碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的水溶液；所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物，其提取步骤如下，

（1）将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用80%体积浓度的饱和的碱性乙醇在40-80℃下回流提取4次，每次提到3小时，得到塞北紫堇提取液，其中饱和的碱性乙醇的加入量为塞北紫堇药材质量的10倍；

（2）将所述塞北紫堇提取液在60℃减压回收乙醇，再浓缩至清膏状、喷雾干燥得到塞北紫堇提取物；

（3）向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5%的盐酸溶液溶解过滤3次，其中，每次酸溶液的加入量与固体的质量比为5：1，合并3次过滤的滤液得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为10%的氢氧化钠水溶液，调节溶液pH值至10，得到酸碱处理液；

（4）向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为酸碱处理液体积的3倍体积量。

（5）取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物中，所述塞北紫堇总生物碱提取物中总生物碱的含量不低于50wt%，包括β-比枯枯灵、β-hydrystine、10-12wt%的原阿片碱，8-10wt%的α-比枯枯灵和10-15wt%的黄紫堇明碱。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱中总生物碱包括β-比枯枯灵、β-hydrystine、11wt%原阿片碱，9wt%α-比枯枯灵和13wt%黄紫堇明碱。

本发明还提供了一种塞北紫堇总生物碱的提取物的提取方法，包括，

（1）将塞北紫堇药材粉碎，并利用50-95%体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

（2）将所述塞北紫堇提取液浓缩、干燥得到塞北紫堇提取物；

（3）向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4%的酸溶液溶解，其中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为（1-6）：1，过滤得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15%的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

（4）向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量。

（5）取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物的提取方法为，

（1）将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用50-95%体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取3-8次，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

（2）将所述塞北紫堇提取液浓缩至清膏、干燥得到塞北紫堇提取物；

（3）向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4%的酸溶液溶解过滤若干次，每次的溶解过滤步骤中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为（1-6）：1，收集过滤得到所有滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15%的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

（4）向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量。

（5）取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物的提取方法中，

所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸的水溶液；

所述碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的水溶液；

所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

优选地，上述塞北紫堇总生物碱提取物的提取方法中，

（1）将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用80%体积浓度的饱和的碱性乙醇在40-80℃下回流提取4次，每次提到3小时，得到塞北紫堇提取液，其中饱和的碱性乙醇的加入量为塞北紫堇药材质量的10倍；

（2）将所述塞北紫堇提取液在60℃减压回收乙醇，再浓缩至清膏状、喷雾干燥得到塞北紫堇提取物；

（3）向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5%的盐酸溶液溶解过滤3次，其中，每次酸溶液的加入量与固体的质量比为5：1，合并3次过滤的滤液得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为10%的氢氧化钠水溶液，调节溶液pH值至10，得到酸碱处理液；

（4）向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为酸碱处理液体积的3倍体积量。

（5）取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

本发明中采用的50-95%体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇的制备方法为，先制备50-95%体积浓度的乙醇或甲醇水溶液，然后向该水溶液中加入氢氧化钠或氢氧化钾至饱和，得到所需的50-95%体积浓度的饱和的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇。

与现有技术相比，本发明具有如下优点，

（1）本发明提供的提取塞北紫堇总生物碱的方法中，采用50-95%的饱和的碱性乙醇和饱和的碱性甲醇，药材中的生物碱，尤其是原阿片碱，α-比枯枯灵和黄紫堇明碱在碱性条件下由生物碱盐转变为游离生物碱继而溶于乙醇或甲醇中被提取出来，再加酸水，使得游离生物碱成盐溶于酸水中，从而与脂溶性成分分离，进一步控制酸碱处理液的pH为9-10，使得生物碱盐再游离出来，以有机溶剂萃取，从而得到本发明的总生物碱提取物，采用本发明所述方法得到的所述的塞北紫堇总生物碱提取物中总生物碱的含量不低于50wt%，包括10-12wt%的原阿片碱，8-10wt%的α-比枯枯灵和10-15wt%的黄紫堇明碱，研究表明该生物碱提取物具用抗乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肺癌的作用。

（2）本发明提供的提取塞北紫堇总生物碱的方法中，总生物碱粗提物最后以硅胶柱层析技术进行纯化，所用洗脱剂仅有乙酸乙酯，在得到目标产物的同时，溶剂可回收重复利用，操作简便，节约资源。

（3）本发明提供的提取塞北紫堇总生物碱的方法中，有机溶剂的萃取次数为3-6次，不仅能够有效提取残留于母液中的总生物碱，还能尽量减少萃取次数增多带来的能源浪费。

（4）本发明提供的提取塞北紫堇总生物碱的方法，总生物碱的产率高，总生物碱含量高，杂质少，可直接药用。同时操作简单，有机溶剂可以重复使用，有利于在生产上推广。

实验例

下述实验例用于证明本发明的技术效果。

以本发明实施例1中得到的塞北紫堇总生物碱提取物为例，详述如下，

塞北紫堇总生物碱提取物收率及含量的测定

取实施例1中的塞北紫堇总生物碱细粉约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入体积份数比100:1的氯仿-氨水混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比100:1的氯仿-氨水混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1的氯仿-氨水混合溶液洗涤3次，每次15m，滤过；合并上述滤液及洗液，低温减压（40℃以下）蒸干，残渣加入饱和的碱性乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇脱色10min，滤过，精密量取续滤液5ml至250ml锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴定至黄色。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于7.07mg的原阿片碱（C20H19NO5）

V1—加入的硫酸总体积,单位:ml

V2—中和氢氧化钠溶液消耗的硫酸体积,单位:ml

C—滴定用硫酸的浓度,单位:mol/L

7.07/0.01—1ml0.01mol/L的硫酸溶液相当于7.07mg的原阿片碱

实施例1塞北紫堇总生物碱提取物中单体成分含量的测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以含体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的水溶液（PH值为6.0）为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为285nm；理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000；

时间（分钟）	流动性A（%）	流动相B（%）
			0～60	20→40	80→60
60～90	40	60

对照品溶液的制备取原阿片碱、Ochotensimine（黄紫堇明碱）、α-Bicuculline（α-比枯枯灵）对照品适量，加甲醇制成每1ml含原阿片碱20μg、Ochotensimine30μg、α-Bicuculline10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取塞北紫堇总生物碱细粉约20mg，精密称定，加甲醇25ml回流提取2小时，滤过，取续滤液25ml，减压回收至干，残渣使用15ml硫酸（1→10）溶液溶解，滤液用石油醚洗涤2次，每次20ml，弃去石油醚部分，水层使用氨水调节PH值至9-10，氯仿萃取3次，每次20ml，减压回收至干，用甲醇溶液溶解并定容至10ml。

测定法  分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，根据相应生物碱的出峰面积和浓度比，计算生物碱含量，即可。

在本步骤中供试品溶液的高效液相色谱图如图1所示，其谱图中还包括有β-比枯枯灵和β-hydrystine的峰，表明总生物碱提取物中还含有一定量的β-比枯枯灵、β-hydrystine，在附图1中，单体1为α-比枯枯灵，单体2为原阿片碱，单体3为黄紫堇明碱，单体4为β-hydrystine，单体5为β-比枯枯灵。

塞北紫堇总生物碱提取物药理实验数据

1实验动物  健康昆明种小鼠90只，SPF级，雄性，体重30±2g。由山东鲁抗医药股份有限公司提供，动物合格证号：SCXK鲁20130001。

2实验细胞  细胞系人的前列腺癌（pc3）细胞，乳腺癌（MCF-7）细胞，胃癌细胞，肺腺癌（A549）细胞，卵巢癌（skov3）细胞均由山东省立医院提供。

3实验药物

实验药物：采用实施例1和对比例1-3中所述方法制备得到的塞北紫堇总生物碱提取物；

阳性对照药物：顺铂，批号：1010041DC；

试剂：1640细胞培养基（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胰酶细胞消化液（碧云天）,青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂（齐鲁制药有限公司）。

4实验方法

4.1细胞培养

从超低温冰箱中取冻存的人前列腺癌（pc3）细胞，乳腺癌（MCF-7）细胞，胃癌细胞，肺腺癌（A549）细胞，卵巢癌（skov3）细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心三分钟，收集细胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

4.2含药血清的制备

昆明种小90只，分为6组，空白对照组、顺铂组（10μg/ml）、实验组（实施例1中提取得到的总生物碱）、对照组1-3（分别为对比例1-3中提取得到的提取物），每组15只。15只小鼠分为5组，对应5个肿瘤细胞株，每组三只。总生物碱及对照组均灌胃给予小鼠3mg/ml混悬液。空白对照组灌胃给予等量生理盐水。小鼠连续灌胃3天，每天0.5ml。最后一天灌胃后1小时，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3000转/min离心，取上层血清，-80℃保存。同组血清混合，0.22μm微孔滤膜过滤除菌于备用。

4.3MTT法测定含药血清对不同肿瘤细胞活性的影响

将CO₂培养箱中培养的不同肿瘤细胞，以0.25%的胰酶细胞消化液（含0.02%EDTA）进行消化，以1×10⁴个细胞每孔接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含胎牛血清的1640培养基，不加细胞。待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100μL空白血清，顺铂组加入含顺铂血清100μl，试验组每孔分别加入相应含药血清100μl，每种癌细胞加入含药血清12孔。然后细胞在37℃、5%CO₂培养箱中继续培养24h。加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4h。然后加入100μL DMSO用酶标仪于492nm测定OD值，计算抑制率：细胞生长抑制率=（对照组吸光度平均值—实验组吸光度平均值）/对照组吸光度平均值×100％。

4.4统计方法

所有数据均以（X±SD）显示，采用GraphPad Prism5软件分析处理数据，利用t检验观察各组与空白组之间是否存在显著性差异，P<0.05为差异显著。

5、MTT法测定细胞抑制率结果（n=12）

实验结果见表1。

表1实施例1中制备得到的总生物碱与空白组之间是否存在显著性差异数据表

表1结果表明实施例1的总生物碱提取物能显著降低体外培养的乳腺癌、胃癌、肺癌及卵巢癌细胞活性。而对比例组并不能抑制上述肿瘤细胞的活性。

采用本发明的方法提取得到的塞北紫堇总生物碱作为抗癌药物的最低起效剂量测定

实验细胞  细胞系：胃癌、乳腺癌（MCF-7）、肺癌细胞（A549）、及卵巢癌细胞（SKOV3）细胞株，均由山东省立医院提供。

实验药物：本申请实施例1提取得到的塞北紫堇总生物碱。

阳性对照药物：顺铂，批号：1010041DC

试剂：1640细胞培养基（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胰酶细胞消化液（碧云天）,青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂（齐鲁制药有限公司）。

实验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50FBS,上海申安）；双人单面净化工作台（SW-CJ-1C，苏州净化）；二氧化碳培养箱（BB16UV/BB5060UV，HERAEUS）；台式离心机（H3，Sigma）；酶标仪(Multiskan MK3,ThermoScientific)；电热恒温鼓风干燥箱（101，上海鹏顺科学仪器有限公司）；倒置显微镜（XDS-1B，重庆光学仪器厂）；水浴恒温振荡器（SHZ-82，金坛市医疗仪器厂）；移液器（Gilson，Eppendorf）；培养瓶（Corning）；96孔板（Costar,USA）

实验方法

1、细胞复苏：

从超低温冰箱中取冻存的癌细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心三分钟，收集细胞。，然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养。

2、接种：

待细胞生长至80%融合时，以0.25%的胰酶细胞消化液（含0.02%EDTA）进行消化，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含胎牛血清的1640培养基，不加细胞。

3、加药

待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100μL不含胎牛血清的1640培养基，阳性对照组加浓度为10μg/ml顺铂溶液100μl，其他试验组每孔分别加入含不同浓度筛选药物的1640培养基100μl，每个浓度药物加6孔。然后细胞在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h。

4、测定：

MTT法测定细胞存活率：在每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4h。然后加入100μL DMSO用酶标仪于492nm测定OD值，计算细胞存活率：计算公式：细胞存活率（％）＝（用药组或模型组A490／对照组A490）×100％。

5.统计方法

采用GraphPad Prism5软件分析处理数据，利用t检验观察各组与空白组之间是否存在显著性差异，所有数据以X±SD表示，t检验比较组间差异的显著性，P<0.05为差异显著。

6MTT法测定胃癌细胞抑制率结果

表2  总生物碱对胃癌细胞的抑制率（n=6，）

药物	浓度（μg/ml）	抑制率（%）
			顺铂	10	61.86±1.99*

总生物碱提取物	25	9.26±4.76
			总生物碱提取物	50	21.73±7.97
总生物碱提取物	100	35.65±6.27*
			总生物碱提取物	200	44.55±11.23*

*与空白对照组比较，P<0.05

表2结果显示，顺铂组及总生物碱100与200μg/ml与空白组有显著性差异，其他各组与空白组差异不明显，说明总生物碱在100μg/ml以上能显著降低胃癌细胞活性。

表3总生物碱对乳腺癌细胞的抑制率（n=6，）

药物	浓度（μg/ml）	抑制率（%）
			顺铂	10	55.88±3.79*
总生物碱提取物	25	6.30±4.12
			总生物碱提取物	50	5.74±7.96
总生物碱提取物	100	28.76±9.68*
			总生物碱提取物	200	37.48±11.96*

*与空白对照组比较，P<0.05

表3结果显示，顺铂组及总生物碱100与200μg/ml与空白组有显著性差异，其他各组与空白组差异不明显，说明总生物碱在100μg/ml以上能显著降低乳腺癌癌细胞活性。

表4  总生物碱对肺癌细胞的抑制率（n=6，）

药物	浓度（μg/ml）	抑制率（%）
			顺铂	10	37.33±3.79*
总生物碱提取物	31.25	7.78±9.68
			总生物碱提取物	62.5	2.22±5.84
总生物碱提取物	125	22.22±7.19*
			总生物碱提取物	250	27.59±8.41*

*与空白对照组比较，P<0.05

表4结果显示，顺铂组及总生物碱125与250μg/ml与空白组有显著性差异，其他各组与空白组差异不明显，说明总生物碱在125μg/ml以上能显著降低肺癌细胞活性。

表5总生物碱对卵巢癌细胞的抑制率（n=6，）

药物	浓度（μg/ml）	抑制率（%）
			顺铂	10	25.55±4.09*
总生物碱提取物	31.25	15.33±5.96
			总生物碱提取物	62.5	11.68±8.04
总生物碱提取物	125	17.52±4.28*
			总生物碱提取物	250	19.42±5.89*

*与空白对照组比较，P<0.05

表5结果显示，顺铂组及总生物碱125与250μg/ml与空白组有显著性差异，其他各组与空白组差异不明显，说明总生物碱在125μg/ml以上能显著降低卵巢癌细胞活性。

具体实施方式

本发明所用塞北紫堇取自青海省内，经青海省藏医院名誉院长、青海省藏医首席专家尼玛鉴定为罂科紫堇属植物塞北紫堇（Corydalis impatiens(Pall.)Fisch）药材，本发明所有实施例采用的部位为塞北紫堇除去根的地上部位。

实施例1

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过10目筛，加入体积浓度为50%饱和的碱性乙醇，在50℃下回流提取3次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的10倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为0.5%的盐酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的6倍量的酸水液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度4%氢氧化钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取5次，其中每次二氯加烷的加入量是3倍体积总碱液量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50倍。经测定总生物碱收率为0.33wt%，提取物种总生物碱含量为52wt%，其中原阿片碱10wt%，α-比枯枯灵8wt%，黄紫堇明碱10wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰。以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例2

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过50目筛，加入体积浓度为95%饱和的碱性乙醇，在70℃下回流提取3次，每次提取2小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的8倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.05（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为4%的盐酸溶解过滤并重复4次，其中每次溶解过程中加入固体质量的1倍量的酸水液，合并过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%氢氧化钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取4次，其中每次二氯甲烷的加入量是5倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液，回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物，取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的100倍。经测定总生物碱收率为0.3wt%，总生物碱含量为55wt%，其中原阿片碱11wt%，α-比枯枯灵9wt%，黄紫堇明碱13wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰，以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例3

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过50目筛，加入体积浓度为90%饱和的碱性乙醇，在80℃下回流提取3次，每次提取2.5小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的7倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为1%的硫酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的3倍量的硫酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%碳酸钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取6次，其中每次二氯加烷的加入量是3倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的7倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍。经测定总生物碱收率为0.31wt%，总生物碱含量为60wt%，，其中原阿片碱12wt%，α-比枯枯灵10wt%，黄紫堇明碱15wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰，以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计,其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例4

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过50目筛，加入体积浓度为80%饱和的碱性乙醇，在70℃下回流提取3次，每次提取2.5小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的7倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为2%的磷酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的3倍量的磷酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度15%碳酸氢钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入乙酸乙酯进行萃取4次，其中每次二氯加烷的加入量是5倍总碱液体积量，合并乙酸乙酯液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的8倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50倍。经测定总生物碱收率为0.33wt%，总生物碱含量为53wt%，其中原阿片碱10wt%，α-比枯枯灵9wt%，黄紫堇明碱12wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰，以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例5

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过50目筛，加入体积浓度为60%饱和的碱性乙醇，在80℃下回流提取3次，每次提取2.5小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的7倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为3%的醋酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的3倍量的醋酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%碳酸钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取6次，其中每次二氯加烷的加入体积量是4倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的8倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50倍。经测定总生物碱收率为0.34%，总生物碱含量为55wt%，其中原阿片碱11wt%，α-比枯枯灵8wt%，黄紫堇明碱14wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰。以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例6

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过30目筛，加入体积浓度为80%饱和的碱性乙醇，在80℃下回流提取4次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的10倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为0.5%的盐酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的5倍量的盐酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%氢氧化钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取3次，其中每次二氯加烷的加入体积量是3倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍。经测定总生物碱收率为0.34wt%，总生物碱含量为55wt%，其中原阿片碱11wt%，α-比枯枯灵9wt%，黄紫堇明碱13%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰。以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例7

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过5-30目筛，加入体积浓度为70%饱和的碱性乙醇，在40℃下回流提取5次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的7倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.04（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为2%的醋酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的2倍量的醋酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度12%碳酸钠水溶液调节pH值至9，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取3次，其中每次二氯加烷的加入体积量是2倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入1倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，洗脱流速为每小时1个体积柱，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的60倍，洗脱过程完成后，将洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60℃下减压干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物。经测定总生物碱收率为0.32%，总生物碱含量为52wt%，其中原阿片碱11wt%，α-比枯枯灵10wt%，黄紫堇明碱14wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰。以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例8

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过20-50目筛，加入体积浓度为75%饱和的碱性乙醇，在65℃下回流提取3次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的7倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.06（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为0.5%的磷酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的2倍量的磷酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%碳酸钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取6次，其中每次二氯加烷的加入体积量是4倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，洗脱流速为每小时2个体积柱，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50倍，洗脱过程完成后，将洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60℃下减压干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物。经测定总生物碱收率为0.31wt%，总生物碱含量为54wt%，其中原阿片碱11wt%，α-比枯枯灵9wt%，黄紫堇明碱12wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰，以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

实施例9

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过30目筛，加入体积浓度为50%饱和的碱性乙醇，在60℃下回流提取3次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的5倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为3%的醋酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的3倍量的醋酸溶液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%碳酸钠水溶液调节pH值至9，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取3次，其中每次二氯加烷的加入体积量是4倍总碱液的体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入1倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，洗脱流速为每小时1个体积柱，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍，洗脱过程完成后，将洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60℃下减压干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱提取物。经测定总生物碱收率为0.34%，总生物碱含量为54wt%，其中原阿片碱10wt%，α-比枯枯灵9wt%，黄紫堇明碱12wt%，并且其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰。以测定体外培养的肿瘤细胞活性抑制百分率计，其抗癌起效剂量为100μg/ml。

对比例1

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过10目筛，加入10倍紫堇药材质量的50%乙醇，在50℃下回流提取3次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收乙醇，再浓缩至相对密度为1.10（50℃测）清膏即塞北紫堇乙醇提取物，向塞北紫堇乙醇提取物中加入体积浓度为0.5%的盐酸溶解并调节pH为3，静置过夜后过滤得到滤液，向所述滤液中加入体积浓度10%碳酸钠水溶液调节pH值至10，得到酸碱处理液；将所述酸碱处理液静置过夜后加入二氯甲烷进行萃取5次，其中每次二氯加烷的加入量是3倍总碱液体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50倍。经测定总生物碱收率为0.24wt%，总生物碱含量为42wt%，其中原阿片碱8wt%，α-比枯枯灵2wt%，黄紫堇明碱5wt%，其高效液相色谱图中不含有β-比枯枯灵和β-hydrystine的峰。

对比例2

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过50目筛，加入7倍紫堇药材质量的稀盐酸，在80℃下回流提取2次，每次提取2小时，得到塞北紫堇提取液，将上述塞北紫堇提取液在70℃下减压浓缩，至相对密度为1.12（50℃测）清膏，向所述清膏中加入体积浓度10%氢氧化钠水溶液调节pH值至10，得到碱处理液；向所述碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取6次，其中每次二氯加烷的加入量是4倍总碱液体积量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50倍。经测定总生物碱收率为0.38wt%，总生物碱含量为50wt%，其中原阿片碱8wt%，α-比枯枯灵6wt%，黄紫堇明碱10wt%，其高效液相色谱图中不含有β-hydrystine的峰。

对比例3

取塞北紫堇药材粉碎成粗粉过10目筛，加入体积浓度为30%饱和的碱性乙醇，在30℃下回流提取6次，每次提取3小时，得到塞北紫堇提取液，其中本步骤中饱和的碱性乙醇的用量为塞北紫堇药材质量的10倍；将上述塞北紫堇提取液在60℃下减压回收碱性乙醇，再浓缩至相对密度为1.1（50℃测）清膏，喷雾干燥，得塞北紫堇碱性乙醇提取物；向塞北紫堇碱性乙醇提取物中加入体积浓度为0.1%的盐酸溶解过滤并重复3次，其中每次溶解过程中加入固体量质量的5倍量的酸水液，合并3次过滤后的滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度10%氢氧化钠水溶液调节pH值至8，得到酸碱处理液；向所述酸碱处理液中加入二氯甲烷进行萃取5次，其中每次二氯加烷的加入量是3倍体积总碱液量，合并二氯甲烷液回收，并干燥得到塞北紫堇总生物碱粗提物。取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，塞北紫堇总生物碱粗提物中加入2倍于其质量的乙酸乙酯溶解后上样，采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍。经测定总生物碱收率为0.28wt%，提取物种总生物碱含量为44wt%，其中原阿片碱12wt%，α-比枯枯灵6wt%，黄紫堇明碱8wt%，其高效液相色谱图中含有β-比枯枯灵、β-hydrystine的峰。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种塞北紫堇总生物碱的提取物，其特征在于，由如下步骤提取，

(1)将塞北紫堇药材粉碎，并利用50-95％体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量为所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

(2)将所述塞北紫堇提取液浓缩、干燥得到塞北紫堇提取物；

(3)向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4％的酸溶液溶解，其中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为(1-6)：1，过滤得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15％的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

(4)向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量；

(5)取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍。

2.根据权利要求1所述的塞北紫堇总生物碱提取物，其特征在于，其提取步骤如下，

(1)将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用50-95％体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取3-8次，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量为所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

(2)将所述塞北紫堇提取液浓缩至清膏、干燥得到塞北紫堇提取物；

(3)向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4％的酸溶液溶解过滤若干次，每次的溶解过滤步骤中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为(1-6)：1，收集过滤得到所有滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15％的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

(4)向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量；

(5)取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

3.根据权利要求1或2所述的塞北紫堇总生物碱提取物，其特征在于，

所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸的水溶液；

所述碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的水溶液；

所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

4.根据权利要求2所述的塞北紫堇总生物碱提取物，其特征在于，

(1)将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用80％体积浓度的饱和的碱性乙醇在40-80℃下回流提取4次，每次提到3小时，得到塞北紫堇提取液，其中饱和的碱性乙醇的加入量为塞北紫堇药材质量的10倍；

(2)将所述塞北紫堇提取液在60℃减压回收乙醇，再浓缩至清膏状、喷雾干燥得到塞北紫堇提取物；

(3)向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5％的盐酸溶液溶解过滤3次，其中，每次酸溶液的加入量与固体的质量比为5：1，合并3次过滤的滤液得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为10％的氢氧化钠水溶液，调节溶液pH值至10，得到酸碱处理液；

(4)向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为酸碱处理液体积的3倍体积量；

(5)取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

5.根据权利要求1、2或4所述的塞北紫堇总生物碱提取物，其特征在于，所述塞北紫堇总生物碱提取物中总生物碱的含量不低于50wt％，包括β-比枯枯灵、β-hydrystine、10-12wt％的原阿片碱、8-10wt％的α-比枯枯灵和10-15wt％的黄紫堇明碱。

6.一种塞北紫堇总生物碱的提取物的提取方法，其特征在于，包括，

(1)将塞北紫堇药材粉碎，并利用50-95％体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量为所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

(2)将所述塞北紫堇提取液浓缩、干燥得到塞北紫堇提取物；

(3)向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4％的酸溶液溶解，其中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为(1-6)：1，过滤得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15％的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

(4)向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量；

(5)取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍。

7.根据权利要求6所述的塞北紫堇总生物碱提取物的提取方法，其特征在于，

(1)将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用50-95％体积浓度的饱和的碱性乙醇或饱和的碱性甲醇，在40-80℃下回流提取3-8次，得到塞北紫堇提取液，其中所述饱和的碱性乙醇或所述饱和的碱性甲醇的用量为所述塞北紫堇药材质量的7-10倍；

(2)将所述塞北紫堇提取液浓缩至清膏、干燥得到塞北紫堇提取物；

(3)向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5-4％的酸溶液溶解过滤若干次，每次的溶解过滤步骤中，酸溶液的加入量与所述塞北紫堇提取物的质量比为(1-6)：1，收集过滤得到所有滤液形成酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为4-15％的碱溶液，调节溶液pH值至9-10，得到酸碱处理液；

(4)向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为所述酸碱处理液体积的2-4倍体积量；

(5)取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的5-10倍，用于洗脱的乙酸乙酯的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的50-100倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。

8.根据权利要求6或7所述的塞北紫堇总生物碱提取物的提取方法，其特征在于，

所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸的水溶液；

所述碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的水溶液；

所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

9.根据权利要求6所述的塞北紫堇总生物碱提取物的提取方法，其特征在于，

(1)将塞北紫堇药材粉碎至5-50目，并利用80％体积浓度的饱和的碱性乙醇在40-80℃下回流提取4次，每次提到3小时，得到塞北紫堇提取液，其中饱和的碱性乙醇的加入量为塞北紫堇药材质量的10倍；

(2)将所述塞北紫堇提取液在60℃减压回收乙醇，再浓缩至清膏状、喷雾干燥得到塞北紫堇提取物；

(3)向所述塞北紫堇提取物中加入体积浓度为0.5％的盐酸溶液溶解过滤3次，其中，每次酸溶液的加入量与固体的质量比为5：1，合并3次过滤的滤液得到酸水液，向所述酸水液中加入体积浓度为10％的氢氧化钠水溶液，调节溶液pH值至10，得到酸碱处理液；

(4)向所述酸碱处理液中加入有机溶剂萃取3-6次，回收所述有机溶剂并得到塞北紫堇总生物碱粗提物，其中有机溶剂每次的加入量为酸碱处理液体积的3倍体积量；

(5)取硅胶乙酸乙酯湿法装柱，并将得到的所述塞北紫堇总生物碱粗提物加乙酸乙酯溶解后上样，并采用乙酸乙脂以每小时1-2个柱体积的洗脱流速进行洗脱，干燥，得到所需的塞北紫堇总生物碱，其中用于溶解总生物碱粗提物的乙酸乙酯的用量为其质量的1-3倍量，硅胶用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的10倍，乙酸乙酯洗脱剂的用量为所述塞北紫堇总生物碱粗提物质量的80倍，所述干燥步骤为洗脱液先减压回收乙酸乙酯，然后在60-70℃减压干燥。