CN115944670A - 一种黑顶黄堇总生物碱的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑顶黄堇总生物碱的提取方法，该方法包括将黑顶黄堇粉碎，氨水浸润，用70％～95％乙醇渗漉提取，提取液浓缩成浸膏，盐酸化至pH＝5～7，加氯仿洗萃取，分离氯仿，再碱化至pH＝7.5～8.5，加氯仿萃取，分离氯仿，再用碱调节pH至9‑10，加氯仿萃取，合并氯仿，加热浓缩、干燥即得黑顶黄堇总生物碱。
Description
技术领域
本发明属于中医药领域，具体涉及一种黑顶黄堇总生物碱的提取方法。
背景技术
紫堇属(Corydalis DC.)广泛分布于北温带，全球大约有428种，主要产于亚洲，北非、印度沙漠区及边缘地区有少量分布。我国约有298种，主要分布在西南地区，青藏高原约有120余种，从现代药理研究发现该属药用植物具有镇痛、保肝、杀虫、抗炎、抗肿瘤、抗焦虑等活性。黑顶黄堇(Corydalis nigroapiculata)为罂粟科紫堇属植物，多年生草本，产于高寒流石滩及冰川周边，是生长在海拔4700m以上，是青藏高原特色药用植物。藏药中称为“桑盖斯哇”，全草在藏药中用于治疗赤巴病(热证)、瘟疫病、烧伤等，通常用于斑花黄堇的替代药材，其主要方剂有热性病方剂、皮肤病方剂、疯狗病方剂、传染病方剂、脑炎方剂等20多类。黑顶黄堇是藏药中与斑花黄堇药性类同的寒性药材，但鲜见对其化学成分和活性的研究报道。
为了研究黑顶黄堇活性成分的活性，本发明人研究提取黑顶黄堇的总生物碱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑顶黄堇总生物碱的提取方法。
为实现本发明的目的，提供如下实施方案。
本发明的一种黑顶黄堇总生物碱的提取方法，包括以下步骤：
1)将黑顶黄堇药材粉碎成粗粉，用1％～3％氨水至粗粉湿润；
2)将湿润的粗粉用70％～95％乙醇渗漉提取，提取3次，每次渗漉24～48小时，合并提取液；
3)将提取液减压浓缩，得到乙醇浸膏；
4)将浸膏用浓度为0.5％的盐酸溶解，用盐酸化至pH＝5～7，得到盐酸液；
5)在盐酸液中加入氯仿洗涤除脂溶性杂质，分离出氯仿；
6)将氯仿洗涤过的盐酸液用Na2CO3碱化至pH＝7.5～8.5，再用氯仿萃取3次，合并氯仿；
7)将上步萃取过的盐酸液用NaOH溶液碱化至pH＝9～10，用氯仿萃取3次，合并氯仿层；
8)将步骤6)和7)的氯仿汇合，减压浓缩回收氯仿，残留物真空干燥即得到箱60℃减压干燥至恒重即得黑顶黄堇总生物碱。
上述本发明的提取方法，进一步包括将步骤5)分离出的氯仿用0.5％的盐酸分次萃取，萃取酸液与之前洗涤过的盐酸液合并。
上述本发明的提取方法，步骤1)所述粗粉，其颗粒为40目。
上述本发明的提取方法，步骤2)所述乙醇渗漉，乙醇温度为45℃。
上述本发明的提取方法，步骤2)中粗粉与乙醇的质量体积比为1g:25ml。
上述本发明的提取方法，步骤4)中，浸膏与浓度0.5％盐酸的质量体积比为1g：2.5～2.8mL。
上述本发明的提取方法，步骤6)和7)中，盐酸液与萃取氯仿的体积比分别为1：1。
本发明人在研究黑顶黄堇总生物碱过程中，分别提取了总生物碱，以及氯仿部位、正丁醇部位和水相萃取部位的黑顶黄堇有效部位。
最近的研究发现，Cdc25B在肿瘤的发生发展中起重要作用。在多种人类恶性肿瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、非霍奇金淋巴瘤、结肠癌等均存在不同比例Cdc25B的过度表达有关。
本发明人采用黑顶黄堇总生物碱和氯仿部位、正丁醇部位及水相萃取部位的黑顶黄堇有效部位对Cdc25B酶的抑制活性和对乙酰胆碱酯酶抑制活性，黑顶黄堇提取物对Cdc25A/Cdc25B酶的抑制活性通过实验的结果(结果见表1)。可以看出，黑顶黄堇氯仿部位、正丁醇部位、总生物碱和水相萃取部位对于Cdc25A酶和Cdc25B酶均存在较好的抑制效果，其中正丁醇和水部位最为显著。另外，黑顶黄堇或及其生物碱成分具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性(结果见表2)，抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)是目前改善阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)即老年性痴呆症的最成功的方法。基于这两种活性，研发黑顶黄堇中提取制备总生物碱的方法具有较好的实用价值。本发明的方法通过优化工艺参数，总生物碱收率高，特别是植物中含量低的小檗碱，也获得0.73％的较高的指标。
表1黑顶黄堇提取物的抗肿瘤活性
表中P<0.01
表2黑顶黄堇中的生物碱对乙酰胆碱酯酶抑制活性
附图说明
图1为黑顶黄堇总生物碱的提取工艺流程图；
图2为渗漉时间与小檗碱含量曲线图；
图3为乙醇浓度与MucroniferanineA和小檗碱含量曲线图；
图4为渗漉温度与小檗碱含量曲线图；
图5为盐酸浓度与小檗碱含量曲线图；
图6为碱化pH值与小檗碱含量曲线图。
具体实施方式
以下实施例是代表性的，用于进一步解释和理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
黑顶黄堇总生物碱的提取工艺见图1。
实施例1黑顶黄堇总生物碱的提取
提取工艺：
A：黑顶黄堇药材干燥后粉碎过筛，并均匀喷洒1％～3％氨水至粗粉微湿润；
B：过筛后药材粉末用热70％～95％乙醇(乙醇温度约为45℃)渗漉提取，提取3次，每次24～48小时，合并提取液；
C：将浸膏加入(2.5～2.8mL盐酸:1g浸膏)浓度为0.5％的盐酸溶解，用氯仿洗涤除脂溶性杂质；
D：将除杂后的盐酸液用Na2CO3碱化至pH＝7.5～8.5，再用氯仿萃取3次，分离收集氯仿层，
E：萃取后的碱性溶液用NaOH碱化至pH＝9～10，用氯仿萃取3次，合并氯仿层；
F:将D和E的氯仿合并，减压浓缩回收氯仿，残留物与真空干燥箱60℃减压干燥至恒重即得黑顶黄堇总生物碱。
实施例2渗漉的时间对黑顶黄堇总生物碱质量的影响
参照实施例1的提取工艺，在提取工艺和其它参数(参数范围取中值，下相同)保持不变的条件下，改变渗漉的时间，得到的总生物碱的质量，以总生物碱中的标志物小檗碱作为总生物碱质量指标，考察黑顶黄堇乙醇(乙醇浓度)渗漉的时间对总生物碱质量的影响。结果如图2。结果表明，渗漉时间在20小时报小檗碱含量明显提高，因此，优选渗漉时间24-48小时，更优先24-40小时。
实施例3乙醇浓度对黑顶黄堇总生物碱质量的影响
参照实施例1的提取工艺，在提取工艺和其它参数保持不变的条件下，改变渗漉的乙醇浓度，获得总生物碱，以总生物碱中的标志物小檗碱和MucroniferanineA作为总生物碱质量指标，考察黑顶黄堇不同浓度的乙醇对总生物碱质量的影响。结果如图3所示。
经对黑顶黄堇中生物碱成分研究发现，其中既有极性较小生物碱(如：MucroniferanineA)，又有极性较大的生物碱(如：小檗碱)。从极性大小角度选取以上两种生物碱的含量为指标，考察总生物碱提取质量。结果表明，小檗碱含量随着乙醇浓度升高呈下降趋势，而生物碱MucroniferanineA含量则随着乙醇浓度升高而明显提升，因此，兼顾二者含量，选择70％～95％乙醇，优选75-80％乙醇，更优选80％乙醇为最优渗漉条件。
实施例4渗漉溶剂的温度选择
参照实施例1的提取工艺，在提取工艺和其它参数保持不变的条件下，改变渗漉溶剂乙醇(80％)的温度，获得总生物碱，以总生物碱中的标志物小檗碱作为总生物碱质量指标，考察黑顶黄堇在不同溶剂温度的提取对总生物碱质量的影响。结果如图4所示。提取总生物碱中小檗碱的含量随着渗漉温度的升高而升高。
根据大极性生物碱在热的乙醇中溶解度变大的规律和乙醇又是一种易燃溶剂的特征，优选45℃左右为适宜渗漉温度。
实施例5盐酸浓度的选择
参照实施例1的提取工艺，在提取工艺和其它参数保持不变的条件下，改变盐酸浓度，获得总生物碱，以总生物碱中的标志物小檗碱作为总生物碱质量指标，考察黑顶黄堇在不同浓度盐酸下的酸化对提取总生物碱质量的影响。结果如图5所示。结果显示0.4-0.6％浓度的盐酸可以获得较高小檗碱含量，优选盐酸浓度为0.5％。
实施例6碱化pH对总生物碱质量影响
参照实施例1的提取工艺，在提取工艺和其它参数保持不变的条件下，改变碱化pH大小，获得总生物碱，以总生物碱中的标志物小檗碱作为总生物碱质量指标，考察黑顶黄堇在不同碱化pH值对提取总生物碱质量的影响。结果如图6所示。结果表明随着pH的增大，测试生物碱中小檗碱的含量在增加，但随着pH增大到11时，溶液颜色明显变绿，考虑到在强碱下有的生物碱成分发生变化，选择最高为pH＝10为适宜。
实施例7实施例1黑顶黄堇总生物碱的提取
提取工艺：
A：黑顶黄堇药材干燥后粉碎过筛，并均匀喷洒2％氨水至粗粉微湿润；
B：过筛后药材粉末用热80％乙醇(乙醇温度约为45℃)渗漉提取，提取3次，每次40小时，合并提取液；
C：将浸膏加入(2.6mL盐酸:1g浸膏)浓度为0.5％的盐酸溶解，用氯仿洗涤除脂溶性杂质；
D：将除杂后的盐酸液用Na2CO3碱化至pH＝8.0～8.5范围，再用氯仿萃取3次，分离收集氯仿层，
E：萃取后的碱性溶液用NaOH碱化至pH＝9.5～10范围，用氯仿萃取3次，合并氯仿层；
F:将D和E的氯仿合并，减压浓缩回收氯仿，残留物与真空干燥箱60℃减压干燥至恒重即得黑顶黄堇总生物碱。
总生物碱的收率为2.6％。总生物碱中，Mucroniferanine A含量为1.47％，Mucroniferanine C含量为1.23％，小檗碱含量为0.73％。
Claims (10)
1.一种黑顶黄堇总生物碱的提取方法，包括以下步骤：
1)将黑顶黄堇药材粉碎成粗粉，用1％～3％氨水至粗粉湿润；
2)将湿润的粗粉用70％～95％乙醇渗漉提取，提取3次，每次渗漉24～48小时，合并提取液；
3)将提取液减压浓缩，得到浸膏；
4)将浸膏用浓度为0.5％的盐酸溶解，用盐酸化至pH＝5～7，得到盐酸液；
5)在盐酸液中加入氯仿洗涤除脂溶性杂质，分离出氯仿；
6)将氯仿洗涤过的盐酸液用Na2CO3碱化至pH＝7.5～8.5，再用氯仿萃取3次，合并氯仿层；
7)将上步萃取过的盐酸液用NaOH溶液碱化至pH＝9～10，用氯仿萃取3次，合并氯仿层；
8)将步骤6)和7)的氯仿层合并，减压浓缩回收氯仿，残留物真空干燥即得到箱60℃减压干燥至恒重即得黑顶黄堇总生物碱。
2.如权利要求1的提取方法，进一步包括将步骤5)分离出的氯仿用0.4-0.6％的盐酸分次萃取，萃取酸液与之前洗涤过的盐酸液合并。
3.如权利要求1的提取方法，步骤1)所述粗粉，颗粒为40目。
4.如权利要求1所述的提取方法，步骤2)所述乙醇渗漉，乙醇温度为45℃。
5.如权利要求1或4所述的提取方法，步骤2)中粗粉与乙醇的质量体积比为1g:25ml。
6.如权利要求1所述的提取方法，步骤4)中，盐酸浓度为0.5％，浸膏与0.5％盐酸的质量体积比为1g：2.5～2.8mL。
7.如权利要求1所述的提取方法，步骤6)和7)中，盐酸液与萃取氯仿的体积比分别为1：1。
8.如权利要求1所述的提取方法，步骤2)的乙醇为75-80％乙醇。
9.如权利要求1所述的提取方法，步骤2)的渗漉时间为24～40小时。
10.如权利要求1所述的提取方法，步骤6)和7)碱化pH分别为8.0～8.5和9.5～10。
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2022
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