CN106176982A - 黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用，属于植物提取物技术领域。选自黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位中的一种或两种以上的任意质量比的混合物。将黑顶黄堇全草粉碎，加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液回流提取，将所得提取液浓缩、干燥，得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，挥去溶剂后得黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位；将萃取后的浸膏分散液浓缩、干燥，得黑顶黄堇水相萃取部位。本发明的黑顶黄堇有效部位在制备抑制CDC25酶药物方面的应用，能够用于制备抗肿瘤药物。

Description

黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用

技术领域

黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用，属于植物提取物技术领域。

背景技术

黑顶黄堇（Corydalis nigro-apiculata C. Y. Wu）为罂粟科紫堇属植物，无毛生草本，产青海省南部（玉树、囊谦）、四川省西北部（德格）和西藏自治区东部（类乌齐、昌都、江达、察雅、八宿、左贡），生于海拔3600~4200米的山坡林下、高山草甸或高山沼泽地[参见：中国植物志.第三十二卷.北京:科学出版社,1999，32：203 ]。黑顶黄堇是一种常用中药，为历代本草记载, 清热利胆、清热解毒。治心血管系统的疾病、败血症，外用于创伤感染 ，治少阳胆经有热、口干苦、两胁不舒、心烦、热毒病证，如疮痈肿毒、创伤感染等。

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，已成为人类致死的首要原因。恶性癌细胞的防治已成为医学界所关注的重要课题。但是，恶性肿瘤发病隐匿，病因复杂，病理变化多样，对其治疗仍局限于癌症疾病的多样性及反复性。然而，尽管不同的癌症的致癌原因可能不尽相同，但其组织观察均表现出相似的细胞周期紊乱以及迅速不可控制的细胞生长及转移。因此，对参与细胞周期调控的一些家族蛋白的研究在推动癌症治疗中成为重要因素。其中，细胞分裂周期激酶（Cdk/cyclins）作为真核细胞周期的主要调控蛋白，负责推动相应阶段的细胞分裂。CDC25 磷酸蛋白酶（CDC25 phosphatases）作为细胞分裂周期蛋白激酶家族（Cdk/cyclins）的活化蛋白酶，在真核细胞的分裂周期中起了十分重要的调节作用。目前临床研究表明，这一家族的蛋白酶在多种癌症组织中均表现出过量的表达，且往往与较差的癌症早期预测有关，这些均使CDC25磷酸蛋白酶成为具有巨大潜力的癌症治疗药物靶标。近年来，许多关于CDC25磷酸蛋白酶家族的酶学研究为相关抑制剂及癌症药物的研发提供了相当重要的信息。

申请人在研究中发现：目前抗肿瘤药物的原料较少，特别是用于制备抑制CDC25酶药物的中药原料较为匮乏，发现新药原料是迫切需要解决的问题。黑顶黄堇植物含有多酚类、黄酮、三萜酸、鞣质化合物等多种化学成分，现有技术中主要有清热利胆、清热解毒之功。目前，尚未见到关于黑顶黄堇抑制CDC25酶的活性方面的研究和应用的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用，该黑顶黄堇有效部位能有效抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性，用于制备抑制CDC25酶药物，具有较好的抗肿瘤作用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该黑顶黄堇有效部位，其特征在于：选自黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位中的一种或两种以上的任意质量比的混合物。

该黑顶黄堇有效部位，其特征在于：选自黑顶黄堇正丁醇部位，或者黑顶黄堇正丁醇部位和黑顶黄堇乙酸乙酯部位任意质量比的混合物。

该黑顶黄堇有效部位的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：将黑顶黄堇全草粉碎，加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液回流提取，将所得提取液浓缩、干燥，得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，挥去溶剂后得黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位；将萃取后的浸膏分散液浓缩、干燥，得黑顶黄堇水相萃取部位。

优选的，所述的回流提取为超声波辅助回流提取，超声波辅助回流提取的具体操作为：将粉碎后的黑顶黄堇全草加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液超声波提取0.5~3小时，过滤，滤渣加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并提取液，即得。

该黑顶黄堇有效部位的应用，其特征在于：在制备抑制CDC25酶药物方面的应用。

所述抑制CDC25酶药物是通过黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位中的一种或两种以上的任意质量比的混合物，与药用辅料混合制成的口服制剂或注射制剂。

所述的注射制剂为脂质体注射剂、纳米粒注射剂或微球注射剂。

所述的口服制剂为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。

申请人对于本发明的说明如下：现有技术中，黑顶黄堇常规用途为清热利胆、解毒的功效，未见其有抗肿瘤功效的相关报道。申请人通过大量研究发现：黑顶黄堇中的部分提取物还具有抗菌、抗肿瘤的作用，但是其功效不明显，不能确定其具体的有效部位。因此通过怎样的溶剂、采用怎样制备方法，才能获得抑制CDC25酶活性效果最好的有效部位，是必须要解决的问题。申请人通过研究发现：采用本发明制备方法，筛选出的黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、和黑顶黄堇水相萃取部位，其抑制CDC25酶效果较好。

制备方法中，浸膏为粗提取物，采用不同的溶剂萃取浸膏分散液，指的是依次将石油醚加入浸膏分散液萃取分离获得石油醚萃取液、将乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分离获得乙酸乙酯萃取液、将正丁醇加入浸膏分散液萃取分离获得正丁醇萃取液；取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥发去除溶剂后，所得即选自黑顶黄堇乙酸乙酯部位和黑顶黄堇正丁醇部位；将萃取后剩余的浸膏分散液（溶剂为水），挥发去除溶剂即得黑顶黄堇水相萃取部位。水相萃取部位也可以称作水相萃取物，水相萃取部位易溶于水；而相对的，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇为有机相，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对应易溶于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。其中，黑顶黄堇乙酸乙酯部位含有游离生物碱、黄酮类化合物；黑顶黄堇正丁醇部位含有黄酮苷和酚类化合物；黑顶黄堇水相萃取部位含有多糖和有机酸类化合物。挥去溶剂即挥发去除溶剂。挥去溶剂可以采用常压加热使溶剂（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）挥发。优选的，挥去溶剂采用减压浓缩，该方法效率高，并且能避免热敏性成分因高温丧失药性。

优选的，制备的抑制CDC25酶药物，为口服制剂或注射制剂。口服制剂和注射制剂为最佳给药途径，此处所述口服制剂为经肠胃道给药制剂，优选的，口服制剂为缓释、控释型口服制剂。也可以为非肠胃给药的其他，如呼吸道给药制剂（喷雾剂、气雾剂、粉雾剂）；皮肤给药制剂（外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂）；膜给药制剂（滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏、含漱剂、舌下片剂）；腔道给药制剂（栓剂）。注射制剂可以为常规注射制剂。根据药物传递系统进行分类，优选的，本发明的注射制剂为脂质体注射剂、纳米粒注射剂或微球注射剂；其他的，本发明的注射剂还可以为微囊注射剂、聚合物胶束注射剂、微乳或亚微乳注射剂、亚微粒注射剂或凝胶注射剂，以上药物传递系统的注射剂能延长药物载体在体内的循环时间、延长载药微粒在吸收部位的停留时间、控制药物在释放初期的突释效应。药用辅料包括药物载体，以及溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、助悬剂、澄清剂、反絮凝剂、矫味剂、着色剂、防腐剂、化学灭菌剂、吸附剂、助滤剂、抗氧剂、pH调节剂、等渗调节剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、抗粘着剂、缓释剂、控释剂、包衣材料、成膜材料、胶囊材料中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用所具有的有益效果是：

1、该黑顶黄堇有效部位能有效抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性，用于制备抑制CDC25酶药物，具有较好的抗肿瘤作用。申请人经大量研究确定现有技术中具有清热解毒之功的黑顶黄堇，还具有抗肿瘤的功效。并且申请人首次在CDC25A酶和CDC25B酶上进行药效筛选，通过大量研究确定黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位中的一种或两种以上的任意质量比的混合物均具有较好的抑制CDC25A酶和CDC25B酶活性，其CDC25A酶存活率3.8~4.2%、CDC25B酶存活率10.8~11.9%，适宜开发成抗肿瘤藏药新药。进一步的，申请人通过研究确定：黑顶黄堇正丁醇部位，或者黑顶黄堇正丁醇部位和黑顶黄堇乙酸乙酯部位任意质量比的混合物，抑瘤率表现较好。综上所述，申请人研究发现黑顶黄堇的新功效，通过研究确定其所抑制的酶的种类，设计制备方法并最终获得对CDC25A酶和CDC25B酶均具有较好抑制效果的有效部位，以上过程是付出了大量的创造性劳动的。

2、该黑顶黄堇有效部位的制备方法提取方便，提取效率高。制备方法中，申请人设计加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液进行超声波辅助回流提取，提高了提取效率；萃取中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，采用以上溶剂萃取顺序所得的黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位和黑顶黄堇水相萃取部位具有较好的抑制CDC25酶的效果。

3、本发明拓展了抑制CDC25A酶和CDC25B酶药物的原料渠道，扩大了黑顶黄堇的用途，使黑顶黄堇发展成为抑制CDC25A酶和CDC25B酶药物的新原料，可显著提高黑顶黄堇的附加值。

具体实施方式

实施例1~3是本发明的黑顶黄堇有效部位及其制备方法的具体实施方式，其中实施例1为最佳实施例。

实施例1

制备方法，包括下述步骤：将黑顶黄堇全草粉碎，采用体积百分比浓度75~85%乙醇溶液超声波提取1小时，然后过滤获得超声波提取液和滤渣，滤渣加质量百分比浓度75%~85%乙醇水溶液回流提取3次，每次0.5小时，合并超声波提取液和回流提取液、浓缩干燥得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥发溶剂，得到黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位；将浸膏分散液萃取后剩余液体浓缩、干燥，得黑顶黄堇水相萃取部位。

实施例2

制备方法，包括下述步骤：将黑顶黄堇全草粉碎，采用体积百分比浓度85~95%乙醇溶液超声波提取3小时，然后过滤获得超声波提取液和滤渣，滤渣加质量百分比浓度85%~95%乙醇水溶液回流提取3次，每次1小时，合并超声波提取液和回流提取液、浓缩干燥得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥发溶剂，得到黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位；将浸膏分散液萃取后剩余液体浓缩、干燥，得黑顶黄堇水相萃取部位。

实施例3

制备方法，包括下述步骤：将黑顶黄堇全草粉碎，采用体积百分比浓度65~75%乙醇溶液超声波提取0.5小时，然后过滤获得超声波提取液和滤渣，滤渣加质量百分比浓度65%~75%乙醇水溶液回流提取2次，每次2小时，合并超声波提取液和回流提取液、浓缩干燥得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥发溶剂，得到黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位；将浸膏分散液萃取后剩余液体浓缩、干燥，得黑顶黄堇水相萃取部位。

将实施例1~3萃取所得石油醚萃取液分别挥去溶剂，得实施例1~3黑顶黄堇石油醚部位，留作后续性能测试使用。

性能测试

分别各取0.4mg干燥后的黑顶黄堇石油醚部位、黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位，各自溶解于100µL的二甲基亚砜（DMSO）中形成DMSO溶液，超声5分钟。再分别取1µL溶解样品的DMSO溶液，分别加入缓冲液99µL，分别得到用于检测黑顶黄堇抑制CDC25酶的黑顶黄堇石油醚部位的缓冲溶液、黑顶黄堇乙酸乙酯部位的缓冲溶液、黑顶黄堇正丁醇部位的缓冲溶液和黑顶黄堇水相萃取部位的缓冲溶液。缓冲液的配方为：分别取0.2423gTris-HCl、0.5138gNaCl、0.0330gBSA、0.0154gDTT、0.0167g EDTA于50mL烧杯中，加蒸馏水溶解并混匀，再加入0.5mol/L NaOH水溶液将pH调节至 8.4，然后定容至100mL容量瓶中，于4℃保存，作为储备缓冲液（buffer）。

一、抑制CDC25A酶和CDC25B酶实验：

主要实验材料为：

CDC25A酶、CDC25B酶，北京乐博生物科技有限公司产品；

Tris-HCl，上海杰美基因医药科技有限公司；

EDTA，上海居里生物科技有限公司；

DTT，上海生工生物工程股份有限公司；

BSA，上海江莱生物科技有限公司；

DMSO，上海伊卡生物技术有限公司；

NaCl（分析纯），天津红岩化学试剂厂；

NaOH（分析纯），天津河东区红岩试剂厂。

主要实验仪器为：

FLUOstar Omega全自动多功能酶标仪，广东省广州伯齐生物科技有限公司；

MP511型pH计电计，上海三信有限公司；

BRAND8道移液枪，浙江杭州汇尔仪器有限公司；

500µL移液枪、50µL移液枪，上海荣泰生化仪器有限公司；

电子天平XPE105，梅特勒-托利多仪器有限公司。

以实施例1得到的黑顶黄堇各部位为测试物，检测黑顶黄堇各部位抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性。

其方法是：分别取2.7µL 330μmol/L FDP、1.8µL 100μmol/L测试物、2µL 0.1μmol/L CDC25A/CDC25B、11.5µL FDP buffer组成18µL体系的实验组；然后取2.7µL 330μmol/LFDP、2µL 0.1μmol/L CDC25A/CDC25B、13.3µL FDP buffer组成18µL体系的对照组1；再取2.7µL 330μmol/L FDP、1.8µL 100μmol/L测试物、13.5µL FDP buffer组成18µL体系的对照组2；将需要加CDC25A/CDC25B酶的体系于37℃条件下孵育60 min，之后加酶，于同样条件下反应60 min，待反应完全，检测在485nm激发光作用下反应产物于520nm处的荧光强度。对照组1在不加入测试物在同样条件下进行。酶存活效率（%）= 实验组测定值/对照组1测定值×100%；其中酶存活效率越低，说明测试样品对组蛋白磷酸化酶CDC25A/CDC25B的抑制效果越强。

表1 黑顶黄堇有效部位抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性测试结果

。

表1中* P＜0.01，通过表1可以看出：黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位和黑顶黄堇水相萃取部位对于CDC25A酶和CDC25B酶均存在较好的抑制效果。

二、抗肿瘤活性测试：

利用MTT法测定黑顶黄堇有效部位对人肿瘤细胞的细胞毒活性。分别取实施例1所得黑顶黄堇浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水相萃取部位适量，作为受试化合物，DMSO溶解后，利用MTT法分别测定对人结肠癌HCT-8、人肝癌Bel7402细胞、人胃癌BGC-803细胞、人肺腺癌A549细胞和人卵巢癌A-2780细胞生长的抑制率。

实验方法：将对数生长期的细胞，用0.25%胰酶-EDTA消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液，根据细胞生长速度的差异，按800~2000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100 µL。24 h后，加入含不同浓度受试化合物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100 µL（DMSO终浓度<0.1%），每种受试化合物设5~7个剂量组，每组至少设3个平行孔，于37℃继续培养72 h后，弃上清液，每孔加入100 µL新鲜配制的含0.5mg/mL MTT的无血清培养基，继续培养4 h，弃上清液后，每孔加入200 µL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振荡器振荡混匀，用酶标仪在参考波长450 nm，检测波长570 nm条件下测定光密度值（OD），以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算受试化合物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC₅₀：抑制率=（对照组平均OD值－给药组平均OD值）÷对照组平均OD值×100%。将制备方法中的浸膏、以及所得的黑顶黄堇石油醚部位、黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位进行体外肿瘤细胞毒活性筛选，结果见表2。

表2 体外肿瘤细胞毒活性筛选结果

。

注：1）、HCT-8为人结肠癌细胞，Bel-7402为人肝癌细胞，BGC-823为人胃癌细胞，A549为人肺癌细胞，A2780为人卵巢癌细胞。2）、>50表明不具有抗细胞毒活性。通过表2可看出：黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位确实有较好的抗肿瘤的效果。

三、体外S₁₈₀荷瘤小鼠抗肿瘤实验。

1、实施例1各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗肿瘤实验方法如下：

a）5~6周龄昆明小鼠，随机选鼠分组，每组10只，每组雌雄各半（分笼饲养）；分组名称为：空白对照组，环磷酰胺组，给药组；给药组包括：黑顶黄堇石油醚部位低、中、高剂量组，黑顶黄堇乙酸乙酯部位低、中、高剂量组，黑顶黄堇正丁醇部位低、中、高剂量组，黑顶黄堇水相萃取部位低、中、高剂量组；对每只小鼠进行皮肤消毒；

b）于右前肢皮下接种S₁₈₀瘤液0.2ml（S₁₈₀瘤细胞数在2.0×10⁶~2.2×10⁶范围内）；

c）步骤b）接种24小时后给药；空白对照组灌胃给药10mL/kg注射用生理盐水；环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺20mg/kg；给药组采用灌胃给药实施例1制得的黑顶黄堇石油醚部位、黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位和黑顶黄堇水相萃取部位；首次给药后，隔日称小鼠首次体重；每组每天给药1次，每次给药剂量详见表3，连续给药14天；

d）末次给药1小时后，处死小鼠，称小鼠末次体重，剥瘤块称重，计算抑瘤率。抑瘤率=（空白对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）÷空白对照组平均瘤重×100%，将抑瘤率计算结果录入表3。

表3 实施例1各部位对小鼠S₁₈₀实体瘤的影响

。

2、实施例2各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠方法同实施例1，数据录入表4。

表4 实施例2各部位对小鼠S₁₈₀实体瘤的影响

。

3、实施例3各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗肿瘤实验的方法同实施例1，数据录入表5。

表5实施例3各部位对小鼠S₁₈₀实体瘤的影响

。

经申请人统计：给药组与空白对照组相比，小鼠体重变化无显著性差异（P>0.05）。表3~5中：S₁₈₀是指小鼠腹水瘤细胞，表3中抑瘤率数值越大表示抗肿瘤效果越好。由表3~5可以看出：首先，实施例1~3均有较好的抗肿瘤效果，实施例1~3中相同部位相同剂量时，各组间的抗肿瘤效果无明显差别。其次，与空白对照组相比，黑顶黄堇乙酸乙酯部位低、中、高剂量组，黑顶黄堇正丁醇中、高剂量组，黑顶黄堇水相萃取部位中、高剂量组，环磷酰胺化疗组，均可显著抑制S₁₈₀肿瘤的生长。

实施例4

将黑顶黄堇有效部位制备为片剂，采用如下步骤：将黑顶黄堇乙酸乙酯部位300mg和淀粉100mg混匀，加体积百分比浓度10%的淀粉糊40mg制成软材，过筛得湿颗粒，干燥得干颗粒，整粒，加硬脂酸镁4 mg混匀、压片，即得。

实施例5

冲剂的制备方法：按重量份配比将黑顶黄堇水相萃取部位5份、蔗糖1份、糊精3份混匀，加入适量质量百分比95%乙醇溶液2~5份，边加边搅拌，制得软材，将软材干燥、过16目筛，分装即得。

实施例6

微丸胶囊由以下重量份原料组成：黑顶黄堇正丁醇部位30份、卵磷脂5份、牛黄胆酸钠5份、微晶纤维素30份；

微丸胶囊的制备方法：按配比将黑顶黄堇正丁醇部位、卵磷脂、牛黄胆酸钠和微晶纤维素混均，倒入乙醇水溶液搅匀获得软材，将软材倒入挤出机中挤出，经滚圆获得颗粒，挤出转速250r/min，滚圆转速800r/min，滚圆时间20min，干燥、过24~30目筛获得微丸，将微丸灌装入胶囊壳内，即得。

实施例7

脂质体注射剂的制备方法：1）在氮气保护下，将50g胆固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g黑顶黄堇正丁醇部位溶解于1500ml体积比为1：1的乙醇和正丁醇的有机溶剂中，搅拌使其溶解获得混悬液；将混悬液通过减压浓缩挥去有机溶剂，获得磷脂膜；

2）在氮气保护下，向磷脂膜中加入8000ml pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，经0.22μm微孔滤膜过滤，得黑顶黄堇正丁醇部位的脂质体；

3）在无菌条件下，向黑顶黄堇正丁醇部位的脂质体中，加入100g海藻糖，搅拌均匀，超声波处理0.5~1小时，加注射用水定容，经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得黑顶黄堇正丁醇部位的脂质体注射剂。

实施例8

纳米粒注射剂的制备方法：取25g黑顶黄堇乙酸乙酯部位和100g泊洛沙姆407用3000ml无水乙醇溶解，加入30ml 1mol/L氯化锌的乙醇溶液，搅拌混合，超声波处理0.5~1小时使其溶解，获得混合液；将混合液减压浓缩挥去溶剂，放入-20℃冰箱冷冻2小时；取出加注射用水定容，超声波处理0.5~1小时，经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得黑顶黄堇乙酸乙酯部位的纳米粒注射剂。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.黑顶黄堇有效部位，其特征在于：选自黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位中的一种或两种以上的任意质量比的混合物。

2.根据权利要求1 所述的黑顶黄堇有效部位，其特征在于：选自黑顶黄堇正丁醇部位，或者黑顶黄堇正丁醇部位和黑顶黄堇乙酸乙酯部位任意质量比的混合物。

3.权利要求1 所述的黑顶黄堇有效部位的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：将黑顶黄堇全草粉碎，加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液回流提取，将所得提取液浓缩、干燥，得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，挥去溶剂后得黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位；将萃取后的浸膏分散液浓缩、干燥，得黑顶黄堇水相萃取部位。

4.根据权利要求3 所述的黑顶黄堇有效部位的制备方法，其特征在于：所述的回流提取为超声波辅助回流提取；超声波辅助回流提取的具体操作为：将粉碎后的黑顶黄堇全草加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液超声波提取0.5~3小时，过滤，滤渣加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并提取液，即得。

5.权利要求1 所述的黑顶黄堇有效部位的应用，其特征在于：在制备抑制CDC25酶药物方面的应用。

6.根据权利要求5所述的黑顶黄堇有效部位的应用，其特征在于：所述制备抑制CDC25酶药物是通过黑顶黄堇乙酸乙酯部位、黑顶黄堇正丁醇部位、黑顶黄堇水相萃取部位中的一种或两种以上的任意质量比的混合物，与药用辅料混合制成的口服制剂或注射制剂。

7.根据权利要求6所述的黑顶黄堇有效部位的应用，其特征在于：所述的注射制剂为脂质体注射剂、纳米粒注射剂或微球注射剂。

8.根据权利要求6所述的黑顶黄堇有效部位的应用，其特征在于：所述的口服制剂为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。