CN102793739A - 治疗肝细胞损伤的叶下珠制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有对肝细胞的直接保护作用，可用于预防和治疗肝细胞损伤以及以肝细胞损伤为主要表现的肝脏疾病的药物制剂，具体涉及叶下珠制剂。本发明所述的叶下珠制剂含有叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉以及药学上可接受的载体，其中叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉的比例为1∶3～5。

Description

治疗肝细胞损伤的叶下珠制剂

技术领域

本发明涉及一种具有对肝细胞的直接保护作用，可用于预防和治疗肝细胞损伤以及以肝细胞损伤为主要表现的肝脏疾病的药物制剂，具体涉及叶下珠制剂。

背景技术

肝细胞损伤是肝脏炎性病变的最主要病理基础，也是肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的重要诱因。抗肝细胞损伤治疗在病毒性肝炎、药物性肝炎、酒精肝、化学性肝损伤、免疫性肝炎等肝脏炎性疾病的治疗中具有重要的意义。

叶下珠(Phyllanthus urinania L.)为大戟科叶下珠属植物。上世纪八十年代以来，国外报道了叶下珠同属植物苦味叶下珠(Phyllanthus amarus)、珠子草(Phyllanthus naruri)等的抗乙型肝炎病毒活性。经过申请人进一步研究发现，以叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉的组成比为1∶3～5组成的处方，具有独立于其抗病毒作用的保肝降酶作用，且预防性给药和治疗性给药均有效。病理解剖还证明，无论预防性给药和治疗性给药均可使实验动物肝脏细胞组织获得明显改善。经体外对大鼠肝细胞的抗损伤实验证明，上述以叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉的组成比为1∶3～5组成的处方可对抗由四氯化碳、刀豆蛋白所致体外培养的大鼠肝细胞损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种叶下珠的药物制剂。

本发明的另一个目的在于提供制备这种叶下珠制剂的方法。

本发明所述的叶下珠制剂含有叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉以及药学上可接受的载体，其中叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉的比例为1∶3～5。

在更具体的实施方式中，本发明所述的叶下珠制剂在其活性成分中含有水溶性黄酮、水溶性鞣质，其中水溶性黄酮∶水溶性鞣质＝1∶4～8；其中水溶性鞣质中的鞣云实精含量不少于3mg/单个剂量。

本发明所述的叶下珠制剂中，叶下珠的水溶性组分的提取方法是：将叶下珠用70～85％乙醇提取，浓缩，用水沉方法除去水不溶性成分，再浓缩即可。

在更具体的实施方式中，本发明所述的叶下珠制剂由以下方法制备：

(1)以叶下珠的全草或地上部分，加入5～10倍量，浓度为70～85％的乙醇提取。提取液以50～80℃的温度浓缩成相对比重为1.20～1.25的浸膏；

(2)将上一步骤所得浸膏加入3～8倍量的水，充分搅拌后静置，滤除沉淀；反复操作至无沉淀物产生，合并液体，再以50～80℃的温度浓缩成相对比重为1.30～1.35的干浸膏，即得叶下珠水溶性组分；

(3)将叶下珠的全草或地上部分粉碎，过筛，取100～240目的细粉；

(4)按干重比1∶3～5分别称取叶下珠水溶性组分和叶下珠细粉，混合均匀，干燥得混合药粉；

(5)将上述混合药粉制成胶囊剂，或适当添加辅料后制成片剂、丸剂、混悬颗粒、胶丸。

以下提供本发明所述药物制剂的药效学实验资料

【实验一  叶下珠制剂的保肝降酶作用】

材料

试药：叶下珠制剂，昆明四创药业有限公司提供，为胶囊剂，内容物为赤褐色粉状颗粒。用蒸馏水配制成不同浓度水溶液(2.52mg/ml，7.84mg/ml，25.2mg/ml)。联苯双酯：用蒸馏水配制成浓度22.4mg/ml水溶液。D-氨基半乳糖(D-Cal)：用蒸馏水配制成浓度为89.6mg/ml水溶液。四氯化碳(CCl₄)：用植物油配制成0.1％溶液。刀豆球蛋白(Con A)：1.95ug/ml。

仪器：全自动生化分析仪(岛津CL-7000)。

动物：SR小鼠，四川省抗菌素研究所提供，体重22±2g，同批实验中性别一致，常规喂养。

方法与结果

一、对CCl₄引起的实验性肝损伤的影响

小鼠60只，雌性，随机分为6组，每组10只。除正常对照组，各组腹腔注射CCl₄10mg/kg，随后给药组分别给予叶下珠制剂46mg/kg.d，140mg/kg.d，460mg/kg.d；阳性对照组以联苯双酯200mg/kg.d；模型对照组和正常对照组均给予同体积蒸馏水，连续灌胃给药5天，于最末一次给药后12小时，断头处死动物，取血测定ALT(结果见表1)，同时取肝脏进行病理组织检查。

表1叶下珠制剂对四氯化碳引起的实验性肝损伤的保护作用

＊：模型组与正常组比较，其他各组与模型组比较，以下类同

病理组织检查：肉眼观察各组大体无异常。显微观察：CCl₄模型组，小鼠肝脏出现明显病理改变，主要损害为细胞胞浆疏松，嗜酸性变，脂肪样变，嗜酸性小体，细胞点状和灶状坏死。而在正常对照组，阳性对照组和给药组(46-460mg/kg.d)，肝细胞，肝小叶，汇管区均无异常。

二、对D-Cal所致小鼠急性肝损伤的影响

小鼠60只，雄性，随机分为6组，每组10只。给药组给予叶下珠制剂46mg/kg.d，140mg/kg.d，460mg/kg.d；阳性对照组以联苯双酯200mg/kg.d；模型对照组和正常对照组均给予同体积蒸馏水，于12小时内各灌胃给药3次，并于第一次灌胃的同时，除正常对照组，各组腹腔注射D-Gal 800mg/kg。于最末一次给药后12小时，断头处死动物，取血测定ALT和胆红素(结果见表2，表3)，并立即取肝脏进行病理组织检查。

表2叶下珠制剂对D-CaL引起的急性肝损伤的保护作用

表3叶下珠制剂对胆红素的影响

病理组织检查：各组大体观察无异常。显微观察：D-Cal模型组，小鼠肝脏细胞明显变性，主要损害为细胞浊肿，嗜酸性变，核仁消失，并可见肝细胞点状和灶状坏死。而在正常对照组，阳性对照组和给药组(46-460mg/kg.d)，均未见异常。

三、对ConA诱导的小鼠肝损伤的影响

小鼠60只，雄性，随机分为6组，每组10只。给药组给予叶下珠制剂46mg/kg.d，140mg/kg.d，460mg/kg.d；阳性对照组以联苯双酯200mg/kg.d；模型对照组和正常对照组均给予同体积蒸馏水，除正常对照组外，其他各组小鼠于实验首日上午尾静脉注射ConA 20mg·kg^-1，各给药组于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃给药1次；末次给药后4h，模型组和各给药组小鼠再次尾静脉注射ConA 20mg·kg^-1，禁食不禁水，8h后断头处死动物，取血测定ALT，(结果见表4)，并立即取肝脏进行病理组织检查。

表4叶下珠制剂对ConA诱导的小鼠肝损伤的影响

病理组织检查：肉眼观察各组动物肝脏明显病变。显微观察：ConA模型组，全部小鼠肝组织均出现病变，大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见广泛的肝细胞脂肪变性、点状坏死和灶性坏死，并出现炎性细胞浸润。正常对照组和叶下珠制剂460mg/kg.d组未见异常。阳性对照组，46mg/kg.d组，140mg/kg.d组病变较ConA模型组明细改善。

结论

实验结果表明：

1、叶下珠制剂小鼠灌胃给药46～460mg/kg.d，可非常显著地抑制CCl₄引起的血清ALT活性升高(P＜0.01，P＜0.05)，对CCl₄所致肝损伤有明显的保护作用。

2、叶下珠制剂小鼠灌胃给药46～460mg/kg.d，对D-Cal引起的血清ALT和胆红素升高有非常显著的抑制作用(P＜0.01，P＜0.05)，有明显的抗D-Cal所致急性肝损伤作用。

3、叶下珠制剂小鼠灌胃给药46～460mg/kg.d，对ConA引起的血清ALT升高有非常显著的抑制作用(P＜0.01)，有非常明显的抗ConA所诱导的免疫性肝损伤作用。

4、叶下珠制剂灌胃给药46～460mg/kg.d，对小鼠肝损伤的形态改变(肝细胞胞浆疏松，脂肪样变，嗜酸性变，肝细胞核仁消失，气球样变，细胞坏死等)有明显的保护和改善作用。

5、叶下珠制剂的保肝和降酶作用存在明显的剂量-效应关系。小鼠灌胃给药460mg/kg时效果最佳(即LD₅₀的1/10剂量，相当于成人每日用量的50倍)。

【实验二叶下珠制剂对体外培养大鼠肝细胞的抗损伤作用】

1材料

1.1大鼠原代肝细胞株，由昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室提供。

1.2药物及试剂叶下珠制剂由昆明四创药业有限公司提供。IV型胶原酶(Sigma公司)，RPMI_1640(Gibco公司)，小牛血清(由昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室提供)，CCl₄(安徽省蚌埠电化试剂厂)，噻唑蓝(MTT，上海生化试剂公司进口分装)，ALT试剂盒(上海丰翔生物技术公司)。

1.3主要仪器DH160HT型CO₂培养箱(上海三腾仪器有限公司)，751分光光度计(上海分析仪器厂)，GL20A型全自动高速冷冻离心机(湖南离心机厂)，MW1000型酶联免疫检测仪(上海京工实业有限公司)。

2 方法

2.1大鼠原代肝细胞制成1×10⁹个/L肝细胞悬液。肝细胞活力大于90％，肝实质细胞纯度达99％。将上述肝细胞悬液分别加入24孔(每孔1ml)和96孔(每孔0.1ml)培养板中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养12h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。

2.2取上述贴壁生长的肝细胞，设CCl₄模型组、叶下珠制剂5个剂量组(50，100，200，400，800ug/L)和溶媒对照组，每组设3个复孔。分别加入8mmol/LCCl₄、不同浓度的叶下珠制剂水浸出液，溶媒，继续培养6h后，离心(1800rpm，10min)，收集24孔板中的培养上清检测ALT。同时用MTT比色法测定96孔板中肝细胞的增殖。

3 结果

表1叶下珠制剂对CCL₄损伤大鼠肝细胞的影响

3.1原代大鼠肝细胞与CCl₄(8mmol/L)共育6h，可使肝细胞培养上清液中ALT水平明显升高。不同浓度的叶下珠制剂水浸出液(50、100、200、400和800ug/L)可明显改善CCl₄对原代大鼠肝细胞的损伤，使因CCl₄升高的ALT水平非常显著地呈剂量依赖性降低。

3.2不同浓度的叶下珠制剂水浸出液(50、100、200、400和800ug/L)对CCl₄降低的原代大鼠肝细胞增殖有显著恢复作用。

具体实施方式

实施例1

取叶下珠的全草50kg，加入400kg浓度为80％的乙醇提取。提取液以65℃的温度真空浓缩，至相对比重为1.25时取出浸膏，加入10kg水，充分搅拌后静置，滤除沉淀，再加入5kg水，充分搅拌后静置，滤除沉淀，反复操作，至加入水量为25kg后，滤除沉淀，合并上清液，70℃的温度真空浓缩成相对比重为1.35的干浸膏，即得叶下珠水溶性组分1.14kg。取叶下珠全草3kg粉碎，过120目筛。称取叶下珠水溶性组分400g(折合干重300g)，120目筛下叶下珠细粉1200g，混合均匀，制成细颗粒，置真空干燥箱中，以65℃温度进行真空干燥。将干燥药粒用20目筛整粒，均匀分装入6000个1#硬胶囊中，每粒胶囊装量为250mg。

实施例2

称取实施例1中叶下珠水溶性组分400g(折合干重300g)，120目筛下叶下珠细粉900g，加淀粉120g，羧甲基纤维素150g，硫酸镁3g，混合均匀，另用27g淀粉加适量水加热制成10％淀粉浆，加入混合物料中，制成细颗粒，置沸腾干燥器中，以65℃温度进行干燥。将干燥药粒用20目筛整粒，用单冲压片机压成6000片，每片重250mg。

Claims (4)

1.一种用于预防和治疗肝细胞损伤以及以肝细胞损伤为主要表现的肝脏疾病的药物制剂，含有叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉以及药学上可接受的载体，其中叶下珠的水溶性组分与叶下珠原粉的比例为1∶3～5。

2.权利要求1所述药物制剂，在其活性成分中含有水溶性黄酮、水溶性鞣质，其中水溶性黄酮∶水溶性鞣质＝1∶4～8；其中水溶性鞣质中的鞣云实精含量不少于3mg/单个剂量。

3.权利要求1所述药物制剂，其中叶下珠的水溶性组分的提取方法是将叶下珠用70～85％乙醇提取，浓缩，用水沉方法除去水不溶性成分，再浓缩即可。

4.权利要求1所述药物制剂的制备方法，包括：

(1)以叶下珠的全草或地上部分，加入5～10倍量，浓度为70～85％的乙醇提取。提取液以50～80℃的温度浓缩成相对比重为1.20～1.25的浸膏；

(2)将上一步骤所得浸膏加入3～8倍量的水，充分搅拌后静置，滤除沉淀；反复操作至无沉淀物产生，合并液体，再以50～80℃的温度浓缩成相对比重为1.30～1.35的干浸膏，即得叶下珠水溶性组分；

(3)将叶下珠的全草或地上部分粉碎，过筛，取100～240目的细粉；

(4)按干重比1∶3～5分别称取叶下珠水溶性组分和叶下珠细粉，混合均匀，干燥得混合药粉；

(5)将上述混合药粉制成胶囊剂，或适当添加辅料后制成片剂、丸剂、混悬颗粒、胶丸。