CN105695101A - 采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油及其制备方法和应用 - Google Patents

采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

采用超临界二氧化碳萃取方法得到的紫色姜挥发油的主要成分为：2-噻吩甲醛、4-萜烯醇、β-倍半水芹烯、姜黄素、1-（1,5-二甲基-4-己烯基）-4-甲基苯、3’,4’-二氢-螺[1,3-二氧戊环-2,2’(1’H)-萘]、2-（2,5-二甲基苯基）丙烯酸和1-[5-(2-呋喃甲基)-2-呋喃]乙酮。其制备方法：原料处理：超临界二氧化碳萃取：收集萃取物为紫色姜挥发油。紫色姜挥发油作为制备抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤的药物应用，作为保健食品的添加剂的应用，作为日用护肤品添加剂、洗洁用品添加剂、芳香保健品添加剂的用途。本发明的制备方法设计合理，操作简便，提取效率高，质量好，无污染，可大规模生产。

Description

采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种以傣药紫色姜为原料深加工的产品及其制备方法，具体是采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油及其制备方法和应用。
背景技术
紫色姜为姜科植物紫色姜ZingiberPurpureumRosc.的根茎。味辛，性热。归脾、胃、心、肺经。紫色姜作为傣药补累的药材来源，是西双版纳地区傣族人民传统的常用药之一，具有松弛胃肠平滑肌、缓解痉挛疼痛、增加胃蠕动等功效。以根茎磨醋外擦治皮肤顽廯等症，并在治疗多种真菌皮肤疾病及其皮肤保健护理方面具有独特疗效，具有广阔的应用前景。紫色姜被《云南省中药材标准－傣族药》（2005年版）收载。紫色姜是国药准字号品种双姜胃痛丸的主要组成药材，用药历史悠久，但其使用方法为粉碎成细粉，加炼蜜及水适量，泛丸，低温干燥制得。《云南省中药材标准》中紫色姜也仅以薄层检测，指标成分为姜黄素进行鉴别，缺少对紫色姜挥发油的相关研究。
挥发油是中草药中一类活性成分，具有多种药理活性，包括：抗菌活性、抗炎活性、解热镇痛活性、抗肿瘤活性、抗病毒活性、驱虫活性、镇静作用、抗氧化和抗过敏活性等。提取方法主要有水蒸气蒸馏法、油脂吸附法、超临界流体萃取法和冷压法等，其中工业上最常用的为水蒸气蒸馏法。
文献报道，姜科植物富含挥发油成分，且具有多种生物活性。如莪术挥发油具有抗肿瘤活性；生姜挥发油具有抑菌和抗氧化活性等。紫色姜根茎含有挥发油，但缺少提取工艺和活性研究相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前紫色姜产品单一，缺乏深加工产品的状况，提供一种紫色姜深加工产品的制备方法及其应用，具体是采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油及其制备方法和应用。
本发明的技术方案：采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油，采用超临界二氧化碳萃取方法制备的紫色姜挥发油的主要成分为质量百分含量为：20~30%的2-噻吩甲醛、30~45%的4-萜烯醇、5~10%的β-倍半水芹烯、1~2%的姜黄素、1~3%的1-（1,5-二甲基-4-己烯基）-4-甲基苯、1~3%的3’,4’-二氢-螺[1,3-二氧戊环-2,2’(1’H)-萘]、2~5%的2-（2,5-二甲基苯基）丙烯酸和10~20%的1-[5-(2-呋喃甲基)-2-呋喃]乙酮。
采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，具体步骤如下：
（1）紫色姜原料的处理：将新鲜紫色姜块茎洗净、除杂、阴干、粉碎，过筛，得到紫色姜粉备用；
（2）紫色姜的超临界二氧化碳萃取：将步骤（1）得到的紫色姜粉投入萃取釜中，加入夹带剂50-100mL无水乙醇，搅拌均匀；
（3）设定二氧化碳流量为20~35L/h，萃取压力为20~35Mpa，萃取温度为45~60℃，萃取时间为1.5~3h，萃取紫色姜粉；
（4）收集萃取物为紫色姜挥发油。
步骤（2）所述的夹带剂优选加入量为：每100g药粉加入100mL无水乙醇。
步骤（3）所述的二氧化碳流量的优选量为25L/h。
步骤（3）所述的萃取压力的优选量为35Mpa。
步骤（3）所述的萃取温度的优选量为45℃。
步骤（3）所述的萃取时间的优选量为2.5h。
紫色姜挥发油作为保健食品的添加剂的应用。
紫色姜挥发油作为日用护肤品添加剂、洗洁用品添加剂、芳香保健品添加剂的用途。
本发明是采用超临界二氧化碳萃取法提取西双版纳州产紫色姜的挥发油，为进一步提高萃取收率，在参考相关文献的基础上，以无水乙醇作为夹带剂进行紫色姜挥发油的提取。使用该方法提取的紫色姜挥发油质量好，有效成分含量高。在本发明的方法中先将原料粉碎，有利于有效成分的溶出。为使原料中的挥发油及其原料中的有效成分得到充分提取，本发明将紫色姜粉加入萃取釜中后，需要加入特定的夹带剂。在本发明中夹带剂的种类及其加入量、萃取压力、萃取温度、萃取时间和二氧化碳流量等因素都对挥发油中有效成分的种类、含量及其提取率有着至关重要影响，本发明选取实验结果较好的实验水平，进行L16（54）正交实验对最佳萃取工艺进行筛选。结果显示：当夹带剂与药材的比例为1：1、萃取压力为35Mpa、萃取温度45℃、萃取时间2.5h、二氧化碳流量为25L/h时，紫色姜挥发油得率可达1.5%，4-萜烯醇、2-噻吩甲醛及姜黄素等有效成分的种类较多，含量较高。
本发明所提取的紫色姜挥发油中富含30~45%的4-萜烯醇、20~30%的2-噻吩甲醛、1~2%的姜黄素及其它有益成分，4-萜烯醇具有抗肿瘤、抗氧化和抑菌等多种活性；2-噻吩甲醛是广谱驱虫药噻嘧啶及抗菌药物先锋霉素的中间体，具有抑菌、杀虫的作用；姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种作用。本发明对紫色姜挥发油抗肿瘤、抑菌、抗氧化活性进行了探索，结果表明紫色姜挥发油具有较高的抗菌作用和一定的抗氧化、抗肿瘤活性。紫色姜挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及大肠杆菌等细菌菌种具有抑制作用；对红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌等真菌菌种具有强烈的抑制作用；对人直肠癌SW620、人肺癌A549细胞、人胃癌SGC7901细胞的增殖具有一定的抑制作用；对羟基（OH）自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基具有较强的清除作用。本发明的产品可作为抗菌、抗氧化、抗肿瘤的药物的应用，也可作为抗菌、抗氧化、抗肿瘤的保健食品添加剂的应用。鉴于紫色姜挥发油对多种真菌皮肤疾病及其皮肤保健护理方面具有独特抗菌效果，紫色姜可以用于面部、手脚及身体的护肤品等日用护肤保健品的添加剂；可以用于洗发、沐浴、洁面及其洗手等日用洗洁用品的添加剂；还可用于精油、花露水等日用芳香保健品添加剂。本发明的制备方法设计合理，操作简便，提取效率高，质量好，无污染，可大规模生产。本发明从理论上提供紫色姜的民间用途依据，也为传统傣药紫色姜的医学和保健用途提供了更广阔的前景。
具体实施方式
结合具体实施例及其实验研究，进一步阐明本发明的技术方案及其效果。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
一、紫色姜挥发油的制备方法：
16个实施例的具体参数见表1，具体步骤如下：
（1）紫色姜原料的处理：将新鲜紫色姜块茎洗净、除杂、阴干、粉碎，过筛，得到紫色姜粉备用；
（2）紫色姜的超临界二氧化碳萃取：将步骤（1）得到的紫色姜粉投入萃取釜中，加入夹带剂50-100mL无水乙醇，搅拌均匀；
（3）设定二氧化碳流量为20~35L/h，萃取压力为20~35Mpa，萃取温度为45~60℃，萃取时间为1.5~3h，萃取紫色姜粉；
（4）收集萃取物为紫色姜挥发油。
紫色姜挥发油可作为日用护肤品的添加剂、洗洁用品的添加剂、芳香保健品的添加剂的用途。
表1
结论：
（1）夹带剂用量实验：通过实验可知，夹带剂用量与挥发油得率有直接的关系，1：1倍加入夹带剂挥发油得率最高，质量好。
（2）萃取压力的考察：萃取压力升高可提高挥发油得率，萃取压力为35Mpa时，挥发油得率高。
（3）萃取时间的考察：萃取时间对挥发油得率有很大影响，当萃取时间为2.5h时，挥发油得率最高，质量好。
（4）萃取温度的选择：实验结果显示，萃取温度45℃条件下，挥发油提取率最高，质量好。
（5）二氧化碳流量的选择：选择合适的二氧化碳流量，可降低损失且提高挥发油得率，实验结果显示流量控制在25L/h，能最大限度提取挥发油，质量好。
结果显示：当夹带剂与药材的比例为1：1、萃取压力为35Mpa、萃取温度45℃、萃取时间2.5h、二氧化碳流量为25L/h时，紫色姜挥发油得率可达1.5%，4-萜烯醇、2-噻吩甲醛及姜黄素等有效成分的种类较多，含量较高。
二、紫色姜挥发油的成分确定
将超临界二氧化碳萃取得到的紫色姜挥发油直接用做GC-MS进行分析，气相色谱条件为：HP-FFAP色谱柱30m×0.02mm×0.18μm，载气为氦气，柱前压80Kpa，50℃保持5min后，2.5℃/min升至250℃，保持20min，进样口温度270℃，进样量0.5μL，分流比20:1。质谱条件为：离子源为EI，电子能量70eV，扫描范围30-500amu，四级杆温度150℃，离子源温度230℃。采用Nbs、Nist、Weily等谱库联合检索，参考文献对挥发性成分进行鉴定，确定紫色姜挥发油的主要成分的质量百分含量为：20~30%的2-噻吩甲醛、30~45%的4-萜烯醇、5~10%的β-倍半水芹烯、1~2%的姜黄素、1~3%的1-（1,5-二甲基-4-己烯基）-4-甲基苯、1~3%的3’,4’-二氢-螺[1,3-二氧戊环-2,2’(1’H)-萘]、2~5%的2-（2,5-二甲基苯基）丙烯酸和10~20%的1-[5-(2-呋喃甲基)-2-呋喃]乙酮。
三、紫色姜挥发油活性分析
药理活性实验挥发油的制备：按照实施例10-16的制备方法制得紫色姜挥发油，备用。
紫色姜挥发油抑菌活性分析：
（1）菌体悬浮液和含菌平板的制备
供试菌用0.9%的无菌生理盐水稀释成浓度为1×109个/mL的菌液；将融化的灭菌培养基倒入无菌培养基中凝固后低价0.1mL菌悬浮液，用无菌涂布环将菌悬浮液涂布均匀即成含菌平板，备用。
（2）平板法测定紫色姜挥发油的MIC（最低抑菌浓度）
将紫色姜挥发油用1%吐温80水溶液稀释成2.5、5、7.5、10、25、50、75、100μL/mL的稀释液，移取0.1mL菌悬浮液加入至各浓度挥发油稀释液中，摇匀。移取混合液于平板中，用涂布环涂布均匀，倒置于恒温培养箱，细菌在37℃下培养24h、真菌在28℃下培养3d。观察菌体生长情况，生长菌体为阳性（＋），不生长菌体为阴性（－），以不生长菌体的挥发油的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC），以稀释剂1%吐温80水溶液为对照，重复3次。
（3）滤纸片固相扩散法测定紫色姜挥发油的抑菌活性
将直径6mm，高温蒸汽杀菌后烘干无菌小滤纸片浸泡在浓度为100μL/mL挥发油稀释液中30min，沥干后贴于含菌平板上，每板呈品字性贴3片，置于恒温培养箱中培养，细菌在37℃下培养24h、真菌在28℃下培养3d。以平板中只贴浸有1%吐温80水溶液的滤纸片为空白对照。记录形成的抑菌圈直径，每组试验重复3次。
（4）实验结果
通过实验证明紫色姜挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌细菌菌种和红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌真菌等细菌和真菌均具有很好的抑制活性，证明了民间用其治疗皮肤炎症的可行性。从表2、表3试验结果可以看出，紫色姜挥发油对供试菌均具有显著的抑制作用。
表2紫色姜挥发油对供试菌的MIC
表3紫色姜挥发油对供试菌的抑菌圈直径
五、紫色姜挥发油抗氧化活性研究
（1）DPPH自由基清除能力的测定
将紫色姜挥发油配成浓度为10、30、50、70、90、100、150、200μL/mL的溶液，移取1mL挥发油稀释液与3mL，2×10－4mol/L的DPPH溶液摇匀反应30min后在571nm处测吸光值A1；同时测定1mL对应浓度提取液加入3mL无水乙醇反应30min后的吸光值A2；作为对照，在1mL蒸馏水中加入3mLDPPH溶液反应30min后测吸光值A0，以抗坏血酸为阳性对照组。每个实验做3份平行试验，取平均值，清除率计算公式为：
清除率=[A0—（A1－A2）]/A0×100
式中：A1—1mL挥发油溶液与3mLDPPH反应后的吸光值
A2—1mL挥发油溶液与3mL无水乙醇反应后的吸光值
A0—1mL1%吐温80水溶液与3mLDPPH空白的吸光值
（2）羟基自由基清除能力测定
将紫色姜挥发油配制成50、100、150、200、250、300、350、400μL/mL的溶液，取1mL向试管中一次加入1mL9mmoL/L的FeSO4溶液与1mL不同浓度的多酚提取液、6mL9mmol/L的水杨酸溶液和1mL9mmol/L的过氧化氢溶液，室温放置60min后517nm处测定吸光值A1，以蒸馏水代替水杨酸在相同条件下测吸光值A2，将多酚提取液用蒸馏水代替在相同条件下测吸光值A0，每个实验3次重复，取平均值。清除率按照下式计算：
清除率（%）=[A0－（A1－A2）]/A0×100
式中：A1—多酚与过氧化氢-水杨酸体系反应后的溶液在571nm处测得的吸光值
A2—用1%吐温80水溶液代替水杨酸与体系反应后测得的吸光值
A0—用1%吐温80水溶液代替多酚提取液与体系反应后测得的吸光值
（3）实验结果
表4紫色姜挥发油对DPPH自由基的清除率
表5紫色姜挥发油对羟基自由基清除能力
由表4、表5试验结果可知，紫色姜挥发油对羟基（OH）自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基有明显的清除作用，紫色姜挥发油具有一定的抗氧化活性。
六、紫色姜挥发油体外抗肿瘤活性
（1）受试药物的配制：紫色姜挥发油用少量DMSO溶解后（DMSO最终含量在0.1%以内），用相应培养基配制成0.1、0.3、1、3、10、33、100、333、1000μL/mL，备用。
（2）细胞以含10％胎牛血清的培养液培养，使细胞一直处于对数生长期。细胞接种于96孔培养板，密度1-5×104/ml。37℃，5％CO2培养箱预培养24小时药，药物设10个浓度，每个浓度设3个复孔，连续作用72小时。药物作用结束后，用三氯乙酸(TCA)固定细胞，清洗后加入SRB工作液，洗涤，用Trisbase溶解与蛋白结合的SRB，SPECTRAmax190细胞标仪565nm波长下测定每个小孔的OD值。空白对照孔加20μl培养液。根据OD值，计算细胞生长抑制率：
抑制率(%)=(对照组OD值-用药组OD值)/对照组OD值×100%
用GraphpadPrism5软件处理，计算出化合物的IC50值。
（3）实验结果
表6紫色姜挥发油体外抗肿瘤活性
由表6试验结果可知，紫色姜挥发油对选取的三种肿瘤细胞株具有一定的抑制活性，人胃癌SGC7901＞人肺癌A549＞人直肠癌SW620。
通过上述实验结果显示：紫色姜挥发油具有一定的抗氧化活性和抗肿瘤活性，文献查阅，可能与挥发油中含量较高的2-噻吩甲醛、4-萜烯醇、姜黄素和β-倍半水芹烯相关，为紫色姜挥发油的应用提供基础。
本发明获得的紫色姜挥发油可作为制备抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤的药物应用。紫色姜挥发油作为保健食品的添加剂的应用。紫色姜挥发油作为日用护肤品添加剂、洗洁用品添加剂、芳香保健品添加剂的用途。

Claims (10)

1.采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油，其特征在于：采用超临界二氧化碳萃取方法得到的紫色姜挥发油的主要成分的质量百分含量为：20~30%的2-噻吩甲醛、30~45%的4-萜烯醇、5~10%的β-倍半水芹烯、1~2%的姜黄素、1~3%的1-（1,5-二甲基-4-己烯基）-4-甲基苯、1~3%的3’,4’-二氢-螺[1,3-二氧戊环-2,2’(1’H)-萘]、2~5%的2-（2,5-二甲基苯基）丙烯酸和10~20%的1-[5-(2-呋喃甲基)-2-呋喃]乙酮。
2.如权利要求1所述的采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）紫色姜原料的处理：将新鲜紫色姜块茎洗净、除杂、阴干、粉碎，过筛，得到紫色姜粉备用；
（2）紫色姜的超临界二氧化碳萃取：将步骤（1）得到的紫色姜粉投入萃取釜中，加入夹带剂50-100mL无水乙醇，搅拌均匀；
（3）设定二氧化碳流量为20~35L/h，萃取压力为20~35Mpa，萃取温度为45~60℃，萃取时间为1.5~3h，萃取紫色姜粉；
（4）收集萃取物为紫色姜挥发油。
3.如权利要求2所述的采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的夹带剂优选加入量为：每100g药粉加入100mL无水乙醇。
4.如权利要求2所述的采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的二氧化碳流量的优选量为25L/h。
5.如权利要求2所述的采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的萃取压力的优选量为35Mpa。
6.如权利要求2所述的采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的萃取温度的优选量为45℃。
7.如权利要求2所述的采用超临界二氧化碳萃取的紫色姜挥发油的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的萃取时间的优选量为2.5h。
8.如权利要求1所述的一种以紫色姜为原料制备挥发油的应用，其特征在于，紫色姜挥发油作为制备抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤的药物应用。
9.如权利要求1所述的一种以紫色姜为原料制备挥发油的应用，其特征在于，紫色姜挥发油作为保健食品的添加剂的应用。
10.如权利要求1所述的一种以紫色姜为原料制备挥发油的应用，其特征在于，紫色姜挥发油作为日用护肤品添加剂、洗洁用品添加剂、芳香保健品添加剂的用途。
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