CN107629133A - 一种硅藻多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种硅藻多糖及其制备方法，属于多糖提取技术领域，硅藻多糖的制备步骤包括细胞壁破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥，在提取前利用活性多肽和反复冻融法对岩藻细胞壁破碎，提高多糖得率，并且通过分离纯化进一步提高多糖纯度，本发明提取的硅藻多糖纯度高，作用效果好，在具有免疫调节、降血脂、抗凝血功能的保健品中使用。

Description

一种硅藻多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种硅藻多糖及其制备方法。

背景技术

硅藻是一类具有色素体的单细胞植物，常由几个或很多细胞个体连结成各式各样的群体，硅藻是海洋生物中的主要组成者，在海洋生态系统的物质和能量循环中起着极其重要的作用，研究表明硅藻胞外多糖有着多方面的生物及药理活性，在激活免疫系统功能、抗肿瘤、抗病毒等方面活性大且毒副作用小，经硫酸酯化的修饰的产物药理活性更加明显，成为当前医药学和养生学研究的热门课题，硅藻具有种类多，分布广，繁殖快等特点，其多糖作用具有很好的研究价值。目前国内外对硅藻多糖的研究主要以胞外多糖为主，且提取方法复杂，提取率不高，严重制约着硅藻多糖的产业化应用。

现有技术如，中国发明授权专利文献，授权公告号CN1206245C，，该发明公开了一种从海藻中综合提取多糖、植物增长激素、EPA、DHA等物质的方法。将海藻粉碎，加酸浸提，加乙醇沉淀分级，酸水解，得分子量不同的多糖产品；提取多糖后往海藻残渣中加乙醇浸提，回收溶剂，萃取，分离提纯得到蕨藻红素；提取多糖后的海藻残渣用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，色谱分离得EPA和DHA的单酯衍生物，再酸水解，萃取，得EPA、DHA。采用该发明的提取方法，能把从海藻中提取的海藻硫酸、羧酸多糖依分子量大小分离得到不同规格的产品，以满足不同行业的需要；而且能从提取多糖后的海藻残渣中进一步提取蕨藻红素、EPA、DHA等多种物质，简化了工艺，充分利用原料，降低了成本，但是该方法提取的多糖的得率和纯度不太高。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种硅藻多糖，硅藻多糖纯度高，作用效果好，在具有免疫调节、降血脂、抗凝血功能的保健品中使用。

本发明的目的之二在于提供一种硅藻多糖的制备方法，在提取前利用活性多肽和反复冻融法对岩藻细胞壁破碎，提高多糖得率，并且通过分离纯化进一步提高多糖纯度。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种硅藻多糖，硅藻多糖的制备步骤包括细胞壁破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥。

一种硅藻多糖的制备方法，硅藻多糖的具体操作步骤如下：

1）细胞壁破碎：取硅藻粉末过筛，制成藻液固液比为1:30-40，并加入活性多肽，细胞破碎步骤中在藻液中加入硅藻粉重量的0.2%~0.4%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYVLHPGKLCACVNCSR，选用磷酸钠盐缓冲液pH值为6.8-7.0，作为提取剂，细胞破碎步骤中反复冻融是在-20℃和37℃，反复冻融4-5次，每次2-3h，梯度超声波辅助冻融，梯度超声波功率为380-500w，时间为10-15min，每隔2~5min超声波功率增强10~16w，直至反复冻融结束，离心，得粗蛋白提取液；

2）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，加入的乙醇为藻液体积的3~4倍，乙醇浓度为94%~97%，乙醇醇沉时间为10-12h，离心得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为7000-8000Da，自来水流水透析40-46h，蒸馏水透析20-22h，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥，得硅藻粗多糖；

3）多糖柱层析：将硅藻多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱3.5×25cm，蒸馏水洗脱，NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，NaCl洗脱，收集洗脱液真空浓缩，透析；

4）冷冻干燥：将透析液冷冻干燥，冷冻干燥温度为-38℃至-35℃，得硅藻多糖。

与现有相比，本发明的有益效果为：本发明提取的硅藻多糖纯度高，作用效果好，在具有免疫调节、降血脂、抗凝血功能的保健品中使用，在提取前利用活性多肽和反复冻融法对岩藻细胞壁破碎，提高多糖得率，并且通过分离纯化进一步提高多糖纯度，使用的活性多肽具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于水中，亲脂性使其与硅藻细胞膜结合，使细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，有利于硅藻多糖得率，利用活性肽结合冻融法进行细胞破碎，大大缩短了提取时间，提取效果好，得到的粗多糖含量高，还有效避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性，本发明的硅藻多糖提取工艺简单，可操作性强，生产成本低。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种硅藻多糖的制备方法，硅藻多糖的具体操作步骤如下：

1）细胞壁破碎：取硅藻粉末过筛，制成藻液固液比为1:34，并加入活性多肽，细胞破碎步骤中在藻液中加入硅藻粉重量的0.26%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYVLHPGKLCACVNCSR，选用磷酸钠盐缓冲液pH值为6.9，作为提取剂，细胞破碎步骤中反复冻融是在-20℃和37℃，反复冻融4次，每次2h，梯度超声波辅助冻融，梯度超声波功率为400w，时间为12min，每隔4min超声波功率增强12w，直至反复冻融结束，5000r/min离心6min，得粗蛋白提取液；

2）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，加入的乙醇为藻液体积的4倍，乙醇浓度为95%，乙醇醇沉时间为11h，6000r/min离心11min，得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为7000Da，自来水流水透析42h，蒸馏水透析21h，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥冷冻温度为-39℃，得硅藻粗多糖；

3）多糖柱层析：将硅藻多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱3.5×25cm，蒸馏水洗脱，用0~2.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0Ml/min，收集洗脱液，将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，0.1mol/L的NaCl洗脱，流速0.2mL/min，收集洗脱液真空浓缩，流水透析46h，蒸馏水透析49h；

4）冷冻干燥：将透析液冷冻干燥，冷冻干燥温度为-38℃，得硅藻多糖。

实施例2：

1）细胞壁破碎：取硅藻粉末过筛，制成藻液固液比为1:37，并加入活性多肽，细胞破碎步骤中在藻液中加入硅藻粉重量的0.3%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYVLHPGKLCACVNCSR，选用磷酸钠盐缓冲液pH值为7.0，作为提取剂，细胞破碎步骤中反复冻融是在-20℃和37℃，反复冻融4次，每次2h，梯度超声波辅助冻融，梯度超声波功率为500w，时间为14min，每隔3min超声波功率增强12w，直至反复冻融结束，5000r/min离心5min，得粗蛋白提取液；

2）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，加入的乙醇为藻液体积的3倍，乙醇浓度为95%，乙醇醇沉时间为11h，6000r/min离心10min，得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为7000Da，自来水流水透析42h，蒸馏水透析21h，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥冷冻温度为-40℃，得硅藻粗多糖；

3）多糖柱层析：将硅藻多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱3.5×25cm，蒸馏水洗脱，用0~2.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0Ml/min，收集洗脱液，将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，0.1mol/L的NaCl洗脱，流速0.2mL/min，收集洗脱液真空浓缩，流水透析48h，蒸馏水透析50h；

4）冷冻干燥：将透析液冷冻干燥，冷冻干燥温度为-38℃，得硅藻多糖。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 兰溪市沉默生物科技有限公司

<120> 一种硅藻多糖及其制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

His Ser His Ala Cys Ala Ser Tyr Tyr Cys Ser Lys Phe Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly Thr Ala His Tyr Ser Ser Cys Thr His Tyr Val Leu His Pro Gly

20 25 30

Lys Leu Cys Ala Cys Val Asn Cys Ser Arg

35 40

Claims (8)

1.一种硅藻多糖，其特征在于：所述硅藻多糖的制备步骤包括细胞壁破碎，多糖提取，多糖柱层析，冷冻干燥。

2.一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：硅藻多糖的具体操作步骤如下：

1）细胞壁破碎：取硅藻粉末过筛，制成藻液并加入活性多肽，选用磷酸钠盐缓冲液作为提取剂，反复冻融，梯度超声波辅助冻融，离心，得粗蛋白提取液；

2）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，离心得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥，得硅藻粗多糖；

3）多糖柱层析：将硅藻多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱3.5×25cm，蒸馏水洗脱，NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，NaCl洗脱，收集洗脱液真空浓缩，透析；

4）冷冻干燥：将透析液冷冻干燥得硅藻多糖。

3.根据权利要求2所述的一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎步骤中在藻液中加入硅藻粉重量的0.2%~0.4%的活性多肽，所述活性多肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYVLHPGKLCACVNCSR。

4.根据权利要求2所述的一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎步骤中硅藻藻液的固液比为1:30-40，所述磷酸钠盐缓冲液的pH值为6.8-7.0。

5.根据权利要求2所述的一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎步骤中反复冻融是在-20℃和37℃，反复冻融4-5次，每次2-3h，梯度超声波功率为380-500w，时间为10-15min，每隔2~5min超声波功率增强10~16w，直至反复冻融结束。

6.根据权利要求2所述的一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：所述多糖提取步骤中加入的乙醇为藻液体积的3~4倍，乙醇浓度为94%~97%，乙醇醇沉时间为10-12h。

7.根据权利要求2所述的一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：所述多糖提取步骤中透析袋的透过分子量为7000-8000Da，自来水流水透析40-46h，蒸馏水透析20-22h。

8.根据权利要求2所述的一种硅藻多糖的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥温度为-38℃至-35℃。