CN104366192B - 含有稠李多糖的抗喉癌保健品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有稠李多糖的抗喉癌保健品。按重量百分比组成如下：稠李多糖30％‑50％，稠李花色苷20％‑40％，高粱米多肽5％‑10％，板栗多肽5％‑10％，僵蚕提取物5％‑10％、桔梗提取物5％‑10％、薏苡仁提取物5％‑10％、白花蛇舌草提取物5％‑10％。本发明具开创性的技术是将稠李多糖及稠李花色苷作为抗喉癌的核心功能性原料，根据现代营养学模型合理搭配、科学组合应用，形成具有显著抗喉癌的多糖、花色苷、多肽类、中草药混合保健品。本发明通过对体外人喉癌细胞的实验研究，发现稠李多糖的组合物对体外肿瘤细胞具有较好的抑制作用，对于喉癌的防治有着非常显著的效果。

Description

含有稠李多糖的抗喉癌保健品

技术领域

本发明属于保健品领域，具体的涉及一种具有抗喉癌功能的含有稠李多糖的保健品。

背景技术

喉癌是我国常见的头颈部恶性肿瘤之一，约占所有肿瘤的3～5％，在耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌和鼻腔，鼻窦癌，居第三位。好发年龄为50～70岁。男性较女性多见，约为8：1，以东北、华北和华东地区发病率最高。喉癌大多数为鳞状细胞癌，占全部喉癌的93～99％)。由于喉部是人体的发声器官，如果早期诊断和治疗不及时，会严重影响病人的语言表达和生活质量，甚至危及生命。喉鳞状细胞癌的主要治疗方法是手术，通常首选全喉切除手术，其次是放射治疗，这些会严重损害患者的喉功能和生活质量。鉴于上述原因，人们把目光转向天然抗肿瘤药物的研发上。

发明内容

本发明的目的是以东北地区观赏性植物稠李属稠李出发，制备稠李多糖、稠李花色苷，和其他活性物质混合，提供一种抗喉癌的天然保健品。

本发明采用的技术方案是：含有稠李多糖的抗喉癌保健品，由以下原料按重量百分比组成：

稠李多糖30％-50％，稠李花色苷20％-40％，高粱米多肽5％-10％，

板栗多肽5％-10％，僵蚕提取物5％-10％，桔梗提取物5％-10％，

薏苡仁提取物5％-10％，白花蛇舌草提取物5％-10％。

本发明涉及的稠李多糖是由稠李提取的，采用超声波-微波-复合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李多糖。稠李花色苷也是由稠李提取的，采用复合酶酶解-微波-超声波分步法的工艺组合提取稠李花色苷。

采用超声波-微波-复合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李多糖的并通过Sephadex G-200层析纯化的步骤如下：

1)超声浸提：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。将稠李冻干粉溶于水中，料液比按质量比1:10-1:50，控制温度为50-90℃，pH值5.0-9.0，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，离心，收集提取液继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：取提取液，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，收集提取液继续进行复合酶酶解；

3)复合酶酶解提取：取提取液，加入提取液重量1.0％-5.0％的复合酶，控制温度为30-60℃，pH3.0-6.0，酶解时间为30min-60min，离心，抽滤，取滤液，滤液旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，3000r/min离心后去除上清液，沉淀冷冻干燥，得稠李粗多糖。所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合；

4)将冷冻干燥的稠李粗多糖加入适量蒸馏水重新溶解，Sephadex G-200层析进行分离纯化，用蒸馏水洗脱，流速为1ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，进行后续实验。用DEAE-32进一步纯化，磷酸盐缓冲液-水作为流动相，梯度模式进行洗脱，流速为0.8ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分。

采用复合酶酶解-微波-超声波分步法的工艺组合提取稠李花色苷并用AB-8大孔树脂进行静态纯化的步骤如下：

1)复合酶酶解提取：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。料液比按质量比1:10-1:50，将稠李冻干粉溶于水，复合酶加入量为稠李冻干粉的总重量的1.0％-5.0％，进行热水浸提，控制温度为30-70℃，pH范围值3.0-6.0酶解时间为30min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行微波提取；所用的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合；

2)微波辅助提取：料液比按质量比1:10-1:15，将酶解后的沉淀物溶于水，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行超声浸提；

3)超声浸提：料液比按质量比1:10-1:15，将微波后的沉淀物溶于乙醇中，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，pH值为2-6，抽滤，提取液备用；

4)合并复合酶酶解的提取液、微波辅助的提取液和超声浸提的提取液，提取液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到粗稠李花色苷干粉；

5)大孔树脂静态纯化：粗稠李花色苷干粉配成8mg/ml的水溶液，静态吸附条件是：温度20℃，树脂的添加量为0.16g/ml；解析条件是：解吸剂70％乙醇，pH值为3，温度为60℃，得稠李花色苷干粉。

本发明的有益效果是：首次采用天然植物稠李果实提取的多糖、花色苷作为活性物质，制备抗喉癌保健品或药品，不存在合成药剂的毒副作用，而且服用和携带十分的方便，吸收快速且效果好，因此拥有十分广阔市场前景。

附图说明

图1是稠李多糖组合物对人喉癌细胞株Hep-2细胞生长影响。

图2是稠李多糖组合物抑制Hep-2细胞集落形成的集落试验结果。

图3是稠李多糖组合物抑制Hep-2细胞迁移试验结果。

具体实施方式

实施例1含有稠李多糖的抗喉癌保健品

(一)稠李多糖的制备

采用超声波-微波-复合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李多糖并通过SephadexG-200层析纯化的步骤如下：

1)超声浸提：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。将稠李冻干粉溶于水中，料液比按质量比1:30，控制温度为60℃，pH值7.0，超声波功率为400W，超声时间为40min，3000r/min进行离心15min，收集提取液继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：取超声后的提取液，微波功率400W，微波时间为40min，3000r/min进行离心15min，收集提取液继续进行复合酶酶解；

3)复合酶酶解提取：取微波后的提取液，加入其总重量4.0％的复合酶，控制温度为50℃，pH4.0，酶解时间为40min，3000r/min进行离心15min，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，3000r/min离心后去除上清液，冷冻干燥，得稠李粗多糖。所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:1的混合；

4)将冷冻干燥的稠李粗多糖加入适量蒸馏水重新溶解，Sephadex G-200层析进行分离纯化，用蒸馏水洗脱，流速为1ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，进行后续实验。用DEAE-32进一步纯化，磷酸盐缓冲液-水作为流动相，梯度模式进行洗脱，流速为0.8ml/min，每2ml收集一试管，用硫酸-蒽酮法跟踪检测至无糖，收集含量最多的多糖组分。

(二)稠李花色苷的制备

本实施例采用超声波-微波-混合酶酶解分步法的工艺组合提取稠李花色苷并用AB-8大孔树脂进行静态纯化，步骤如下：

1)复合酶酶解提取：将稠李果实去柄，破碎，去核，放入零下80℃冰箱冷冻过夜，在冷冻干燥机中干燥，待干燥之后取出，研磨成粉。将稠李冻干粉溶于水，料液比按质量比1:30，所用的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:1的混合，复合酶加入量为稠李冻干粉的总重量的3.0％，进行热水浸提，控制温度为50℃，pH范围值5.0酶解时间为50min，6000r/min进行离心10min，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：料液比按质量比1:10，将酶解后的沉淀物溶于水中，微波功率400W，微波时间为40min，6000r/min进行离心10min，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行超声浸提；

3)超声浸提：料液比按质量比1:10，将微波后的沉淀物溶于60％乙醇中，超声波功率为400W，超声时间为30min，pH值为4，抽滤，提取液备用；

4)合并复合酶酶解的提取液、微波辅助的提取液和超声浸提的提取液，提取液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到粗稠李花色苷干粉；

5)大孔树脂静态纯化：粗稠李花色苷干粉配成8mg/ml的水溶液，静态吸附条件是：温度20℃，树脂的添加量为0.16g/ml；解析条件是：解吸剂70％乙醇，pH值为3，温度为60℃，得稠李花色苷干粉。

(三)高粱米多肽的制备

木瓜蛋白酶提取高粱米多肽步骤如下：

1)将高粱米粉碎，按料液比为1:15，在pH为10的氢氧化钠溶液中浸泡3h，提取温度为50℃，5000r/min离心20min，取上清液，用90％硫酸铵进行沉淀，再次离心，分离得到沉淀，进行冷冻干燥得到高粱米蛋白；

2)将高粱米蛋白配成8％的水溶液，pH调节为6.5，酶活添加量为6000u/g料，温度为60℃，提取时间为3h，然后沸水浴10min灭酶，3500r/min离心15min，取上清，纯净水透析、采用截留分子量为l0kDa超滤板超滤后进行冷冻干燥，得到高粱米多肽粉末。

(四)板栗多肽的制备

1)板栗去皮干燥后，用粉碎机粉碎，按料液比为1:10，加入pH11的NaOH，提取温度为50℃，时间为3h，离心收集沉淀，冷冻干燥制备板栗蛋白。

2)复合酶分步水解：首先，以复合风味蛋白酶进行水解，然后再以碱性蛋白酶分步水解制备板栗多肽，复合风味蛋白酶酶解条件为：pH6，酶活添加量为6000u/g料，时间1h，温度55℃，碱性蛋白酶酶解条件为：pH8，酶活添加量为6000u/g料，时间3h，温度50℃；将水解液加热到100℃，保持10min杀灭酶的活力；采用截留分子量为l0kDa超滤板超滤得到的酶解液，收集分子量为10kDa以下的酶解液；将酶解液用低温冷冻干燥机制得板栗多肽粉末。

(五)僵蚕提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的僵蚕固体粉末；按质量比1:10比例称取僵蚕固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得僵蚕提取物。

(六)桔梗提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的桔梗固体粉末；按质量比1:10比例称取桔梗固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得桔梗提取物。

(七)薏苡仁提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的薏苡仁固体粉末；按质量比1:10比例称取薏苡仁固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得薏苡仁提取物。

(八)白花蛇舌草提取物的制备

在室温条件下，称量粉碎成200目的白花蛇舌草固体粉末；按质量比1:10比例称取白花蛇舌草固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得白花蛇舌草提取物。

(九)含有稠李多糖的抗喉癌保健品组合物

由以下原料按重量百分比组成：

稠李多糖40％，稠李花色苷30％，高粱米多肽5％，板栗多肽5％，

僵蚕提取物5％，桔梗提取物5％，薏苡仁提取物5％，白花蛇舌草提取物5％。

(十)MTT实验

本实施例使用人喉癌细胞株Hep-2细胞，采用MTT法检测稠李多糖组合物体外抗癌活性，实验步骤如下：

1)取对数生长期的喉癌细胞系(Hep-2)细胞接种于96孔板，过夜培养使其贴壁；

2)稠李多糖组合物的浓度(25、50、100、150和200μg/ml)；

3)分别在24,48,or 72h后加入MTT(5mg/ml)；

4)然后将96孔板放在37℃恒温培养箱中继续培养4h；

5)处理结束后，将MTT吸出，加入150μl的DMSO，使甲瓒晶体完全溶解；

6)通过测量每个孔在490nm处的吸光度值来评估Hep-2细胞的增值；结果如图1所示。

如图1所示，不同浓度的稠李多糖组合物(25、50、100、150和200μg/ml)分别孵育Hep-2细胞24、48和72h，然后利用MTT比色法检测。结果显示，LMP2处理Hep-2细胞一段时间后，浓度为50、100、150和200μg/ml的稠李多糖组合物均表现出显著的抑制作用，最高浓度为200μg/ml组抑制率在72h后达到了37.2％，结果表明，稠李多糖组合物在体外可抑制人喉癌细胞生长。

(十一)集落形成实验

不同的处理组的Hep-2细胞以每孔1000个细胞的密度接种于孔板上，培养过夜使其贴壁。分别加入100和200μg/ml的稠李多糖组合物培养10d，吸出培养基，每孔用PBS仔细洗两次。使用甲醇将集落固定20min，然后用0.5％结晶紫染色15min，用清水冲洗并拍照，结果如图2所示。

如图2所示，稠李多糖组合物抑制Hep-2细胞集落形成的集落试验结果。稠李多糖组合物孵育Hep-2细胞一段时间后，集落数量与对照组相比明显降低。浓度为100μg/mlLMP2能够显著减少Hep-2细胞形成的集落，浓度为200μg/ml的LMP2在72h时集落数量显著减少。

(十二)Transwell实验

肿瘤细胞迁移实验采用直径为6.5mm的transwell小室，其中内孔大小为8.0μm。将Hep-2细胞血清饥饿24h，然后使用胰蛋白酶消化，计数，并用无血清1640培养基重悬。大约1×10⁵细胞被接种到上层小室，下层小室加入含有10％胎儿牛血清的1640培养基。细胞放在37℃培养24h。培养后，上层小室内表面的细胞被迁移。将穿过小室的细胞固定和染色并在显微镜下统计。每个实验组做三个平行取其平均值，结果如图3所示。

由图3可见，肿瘤细胞的一个重要特点是他们具有入侵和迁移到远端器官的能力，这是几乎所有癌症死亡的主要原因，利用Transwell实验分析稠李多糖组合物对Hep2细胞的迁移影响。如图3所示，与对照组相比，稠李多糖组合物处理组Hep-2细胞跨膜迁移的数量大幅下降，结果显示稠李多糖组合物可以显著抑制Hep-2细胞迁移。

实施例2含有稠李多糖的抗喉癌保健品

含有稠李多糖的抗喉癌保健品，由以下原料按重量百分比组成：

稠李多糖30％，稠李花色苷20％，高粱米多肽5％，板栗多肽5％，

僵蚕提取物10％，桔梗提取物10％，薏苡仁提取物10％，白花蛇舌草提取物10％。

实施例3含有稠李多糖的抗喉癌保健品

含有稠李多糖的抗喉癌保健品，由以下原料按重量百分比组成：

稠李多糖50％，稠李花色苷20％，高粱米多肽5％，板栗多肽5％，

僵蚕提取物5％，桔梗提取物5％，薏苡仁提取物5％，白花蛇舌草提取物5％。

Claims (3)

1.含有稠李多糖的抗喉癌保健品，其特征在于由以下原料按重量百分比组成：

稠李多糖30％-50％，稠李花色苷20％-40％，高粱米多肽5％-10％，

板栗多肽5％-10％，僵蚕提取物5％-10％，桔梗提取物5％-10％，

薏苡仁提取物5％-10％，白花蛇舌草提取物5％-10％；

所述的僵蚕提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的僵蚕固体粉末；分别按质量比1:10比例称取僵蚕固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得僵蚕提取物；

所述的桔梗提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的桔梗固体粉末；分别按质量比1:10比例称取桔梗固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得桔梗提取物；

所述的薏苡仁提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的薏苡仁固体粉末；分别按质量比1:10比例称取薏苡仁固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得薏苡仁提取物；

所述的白花蛇舌草提取物的制备方法：在室温条件下，称量粉碎成200目的白花蛇舌草固体粉末；分别按质量比1:10比例称取白花蛇舌草固体粉末和去离子水，超声破碎30min，室温浸提3h，滤纸初过滤、超滤膜超滤，超滤液无菌冷冻干燥，得白花蛇舌草提取物。

2.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗喉癌保健品，其特征在于：稠李多糖的制备方法如下：

1)超声浸提：料液比按质量比1:10-1:50，将稠李冻干粉溶于水中，控制温度为50-90℃，pH值5.0-9.0，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，离心，取提取液继续进行微波提取；

2)微波辅助提取：取提取液，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，取提取液继续进行复合酶酶解；

3)复合酶酶解提取：取提取液，复合酶加入量为提取液重量的1.0％-5.0％，控制温度为30-60℃，pH 3.0-6.0，酶解时间为30min-60min；抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心，去除上清液，冷冻干燥；所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合。

3.如权利要求1所述的含有稠李多糖的抗喉癌保健品，其特征在于：所述的稠李花色苷的制备方法如下：

1)复合酶酶解提取：料液比按质量比1:10-1:50，将稠李冻干粉溶于水，复合酶加入量为稠李冻干粉的总重量的1.0％-5.0％，进行热水浸提，控制温度为30-70℃，pH范围值3.0-6.0，酶解时间为30min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行微波提取；所述的复合酶是纤维素酶与果胶酶按质量比1:0.5～2的混合；

2)微波辅助提取：料液比按质量比1:10-1:15，将沉淀物溶于水，微波功率300W-500W，微波时间为20min-60min，离心，过滤，提取液备用，沉淀物继续进行超声浸提；

3)超声浸提：料液比按质量比1:10-1:15，将沉淀物溶于乙醇中，超声波功率为100W-500W，超声时间为10min-50min，pH值为2-6，抽滤，提取液备用；

4)合并复合酶酶解的提取液、微波辅助的提取液和超声浸提的提取液，提取液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到粗稠李花色苷干粉；

5)大孔树脂静态纯化：粗稠李花色苷干粉配成8mg/ml的水溶液，静态吸附条件是：温度20℃，树脂的添加量为0.16g/ml；解析条件是：解吸剂70％乙醇，pH值为3，温度为60℃，得稠李花色苷干粉。