CN104611226A - 一种灵芝孢子活性成分的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝孢子活性成分的提取方法及其应用，提取方法包括以下步骤：(1)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0.2-0.5％纤维素酶和质量浓度为0.2-0.5％果胶酶组成的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁；(2)低温真空干燥；(3)低温破壁：在低温环境下对灵芝孢子进行机械粉碎破壁。本发明结合了双酶溶液和低温机械法软化并破碎灵芝孢子细胞壁的方法，有效减低了破碎灵芝孢子细胞壁的难度且缩短了时间。本发明提取的灵芝孢子活性成分对人皮肤成纤维细胞无毒、无副作用，能有效应用于抗衰老化妆产品中。如面膜、面霜、乳液等化妆品，有效达到祛痘、消除痘痕、除皱、去细纹等的效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物与化妆品领域，具体涉及灵芝孢子活性成分的提取方法，以及灵芝孢子活性成分在抗衰老产品中的应用。
背景技术
灵芝，又称之为灵芝草、仙草等，原产于亚洲东部，中国分布最广的在江西。灵芝属于担子菌亚门、多孔菌目、多孔菌科、灵芝菌属的真菌。李时珍在《本草纲目》中指出，灵芝有“增智慧，好颜色”之功效，灵芝是一种具有抗皱、消炎、清除色斑、保护皮肤的真菌。灵芝含有抑制黑色素的成分及多种对皮肤有益的微量元素等，这些成分能够通过减少人体自由基，加速细胞的再生，增加皮肤的厚度并增加胶原质，达到丰润皮肤、消除细纹与皱纹的效果。其中的多糖成分能够通过保持和调节皮肤水性，恢复皮肤弹性，使皮肤湿润、细腻。近年来，大家对灵芝中的灵芝酸、灵芝多糖及灵芝多肽的提取及药用价值研究颇多，而真正提取灵芝孢子活性成分的很少，更别提将其应用于抗衰老产品中。本发明主要研究灵芝孢子活性成分的分离以及该活性成分在抗衰老产品中的应用。
灵芝孢子长在灵芝菌盖中，成熟后由灵芝菌管弹射出来，一些会落在菌盖表面，一些会飘洒在四周。对于灵芝孢子，其呈褐色、卵形(8.5～ll.2)μm×(5.2-6.9)μm，具双层壁。且灵芝孢子包裹的两层壁十分坚韧，一般的化学，物理方法很难将其打破，故限制了对其化学成分、生物活性成分的研究。建立有效的破壁方法，可以促进对其生物活性成分的提取、药用价值及抗衰老方面的研究。
现有的破壁方法主要有两种：一是生物破壁法，以无菌的灵芝孢子粉加入蛹虫草进行固体发酵，使灵芝孢子粉破壁。由于其制备过程中需要经过长时间的发酵，而且发酵后必须经过固液分离，干燥，才能得到破壁后的灵芝孢子粉，工艺较为复杂，容易引入其它杂质，破坏灵芝孢子的营养成分。二是机械粉碎法，精选灵芝孢子粉，添加20～80％的水，50℃干燥12h以上，放入罐体，球料比(2-3):1，球料占罐体的四分之三左右，球磨时间4～9h，大珠、中珠、小珠的个数比例为1:1:1，进行破壁处理，得破壁灵芝粉。此种方法球磨效率一般，破壁率较低，球磨过程中对于营养成分的损失较大，且容易引入重金属元素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种更为有效的破壁方法，即先将灵芝孢子用质量浓度为0.2-0.5％果胶酶和质量浓度为0.2-0.5％纤维素酶联合消化后，再将干冰和无水乙醇的组成混合溶液将温度控制在(-60℃)-(-20℃)，采用超声波机械粉碎破碎的方法破碎灵芝孢子细胞壁，从而有效得到灵芝孢子活性成分。并将灵芝孢子活性成分进行纯化冻干，应用在抗衰老产品中。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种灵芝孢子活性成分的提取方法，将准备好的灵芝孢子进行以下处理：
(1)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0.2-0.5％纤维素酶和质量浓度为0.2-0.5％果胶酶组成的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁；
(2)低温真空干燥：将灵芝孢子置于(-60℃)-(-20℃)的干冰和无水乙醇的混合溶液中保存，真空干燥处理；
(3)低温破壁：在(-60℃)-(-20℃)下对灵芝孢子用超声波进行机械粉碎破壁，得到灵芝孢子提取物。
优选的，软化所述灵芝孢子壁3-8小时。
优选的，所述灵芝孢子低温保存时间为1-5小时。
优选的，将所述灵芝孢子置于干冰和无水乙醇的混合物中，并优选为-20℃的条件下，采用超声波进行机械粉碎破壁。本发明中采用的机械粉碎破壁方法相对传统的机械粉碎方法其时间更短，破壁率更高，可充分使灵芝孢子内部有效活性成分释放，提高了灵芝孢子制品的应用价值。
所述灵芝孢子的准备包括以下步骤：
(1)收集：人工培养灵芝结束后，收集灵芝孢子；
(2)筛选：将灵芝孢子用筛网进行过滤；
(3)漂洗：用水冲洗过滤后的灵芝孢子。
优选的，所述灵芝孢子筛选采用200目以上的筛网进行过滤。
一种将权利要求1的灵芝孢子提取物制成灵芝孢子活性成分冻干粉的方法，包括以下步骤：
(1)过滤：收集灵芝孢子提取液，用孔径小于0.45μM的滤膜过滤；
(2)浓缩：浓缩上清液，浓缩至浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml；
(3)过滤：经浓缩液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤；
(4)冻干处理：冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36小时，即得到灵芝孢子活性成分冻干粉。
所述的灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中应用，尤其是在化妆品中的应用。所述抗衰老扶护品即不局限于在面霜、面膜、乳液、洗面乳、爽肤水、眼霜等化妆品或其它抗衰老产品中的应用。能有效达到祛痘、消除痘痕、除皱、去细纹等的效果。
所述灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中的添加量为1-5μg/ml。
有益效果：
1、破碎灵芝孢子细胞壁时间短。本发明结合了双酶溶液和低温机械法软化并破碎灵芝孢子细胞壁的方法，即先用纤维素酶和果胶酶联合软化灵芝孢子壁，然后在低温环境中对灵芝孢子进行机械粉碎破壁处理。有效缩短了破碎灵芝孢子细胞壁的时间，大大的提高了灵芝孢子的破壁率。
2、本发明提取的灵芝孢子活性成分对人皮肤成纤维细胞无毒、无副作用，能有效应用于抗衰老产品中。本发明将灵芝孢子活性成分应用于抗衰老产品中，如面膜、面霜、乳液等化妆品，有效达到祛痘、消除痘痕、除皱、去细纹等的效果。
附图说明
图1为灵芝孢子活性成分的提取及应用流程图；
图2为灵芝孢子活性成分冻干粉水溶液对人皮肤成纤维细胞(HSF)增殖活力的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
图1为灵芝孢子活性成分的提取及应用流程图。下面结合实施例进一步说明。
实施例1
一种灵芝孢子活性成分的提取方法，包括以下步骤：
1、灵芝孢子的培育
(1)本发明采用斜面培养基培养灵芝菌种(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 5.616)。该斜面培养基为马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂培养基，具体配方见表1。灵芝菌种的培养条件是：培养温度28℃，湿度暗培养，培养时间为7天。
表1 马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂培养基配方
| 名称 | 含量 | 名称 | 含量 |
| 七水硫酸镁 | 1.5g/L | 磷酸二氢钾 | 3.0g/L |
| 葡萄糖 | 20g/L | 维生素B1 | 0.05g/L |
| 土豆提取液 | 200g/L |
(2)一级液体种子培养基培养
将灵芝菌种培养7天后，转移到一级液体种子培养基中培养，具体配方见表2。一级液体种子培养条件为：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。培养时间为15天。
表2 一级液体种子培养基配方
| 名称 | 含量 | 名称 | 含量 |
| 七水硫酸镁 | 0.5g/L | 磷酸二氢钾 | 1.0g/L |
| 葡萄糖 | 35g/L | 维生素B1 | 0.05g/L |
| 蛋白胨 | 5g/L | 酵母粉 | 2.5g/L |
(3)液体深层发酵培养
在一级液体培养基中培养结束后，将灵芝菌种转移到发酵罐中进行液体深层发酵培养，液体深层发酵培养基配方详见表3。
培养条件为温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。培养时间为15天。下表3是液体深层发酵培养基的配方。
表3 液体深层发酵培养基配方
| 名称 | 含量 | 名称 | 含量 |
| 七水硫酸镁 | 0.5g/L | 磷酸二氢钾 | 1.0g/L |
| 乳糖 | 35g/L | 维生素B1 | 0.05g/L |
| 蛋白胨 | 5g/L | 酵母粉 | 5g/L |
2、灵子孢子活性成分的提取
(1)收集：人工培养灵芝结束后，收集灵芝孢子。
(2)筛选：将灵芝孢子用300目筛网进行过滤，过滤杂质。
(3)漂洗：用无菌水冲洗过滤后的灵芝孢子。
(4)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0.2％纤维素酶和质量浓度为0.2％果胶酶组成的的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁5小时。
(5)低温真空干燥：将灵芝孢子置于-40℃环境(乙醇和干冰的混合物)中保存2小时，继续进行真空干燥处理。
(6)低温破壁：在-40℃环境中对灵芝孢子进行机械粉碎破壁，得到灵芝孢子提取物。
实施例2
一种灵芝孢子活性成分冻干粉的制备方法，其包括以下步骤：
(1)收集灵芝孢子提取液，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩。
(2)采用BCA法检测上清液中的蛋白浓度，通过浓缩方法调整浓缩液中蛋白浓度为50μg/ml。
(3)将得到的浓缩上清液用0.22μM的滤膜过滤除菌。
(4)除菌后进行冻干处理，冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为24小时，即得到灵芝孢子活性成分冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。
灵芝孢子活性成分冻干粉产品检测质量标准
(1)肉眼观察灵芝孢子活性成分冻干粉产品为白色粉末状。按标示量1ml去离子水溶解后为澄清、透明的淡黄色液体。
(2)pH值的测定
采用精密pH测试仪检测灵芝孢子活性成分冻干粉的pH值。先校正pH测试仪，然后取冻干粉水溶液进行检测。该冻干粉水溶液的pH值在6.0。
实施例3 灵芝孢子活性成分冻干粉的体外毒性实验
(1)采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)检测灵芝孢子活性成分冻干粉水溶液对人皮肤成纤维细胞(HSF)增殖活力的影响
1)制备HSF细胞悬液：用含10％DMEM低糖培养基重悬HSF细胞，调整其密度为5×104cells/ml，分别接种在96孔板上，100μl/孔，每个处理组分别设4个复孔，置含5％CO2、37℃培养箱内培养24小时。
2)实验分组：24小时后弃原培养液，各组分别加入含1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的用10％DMEM低糖培养基溶解的灵芝孢子活性成分冻干粉，设10％DMEM低糖培养基为对照组，置于含5％CO2、37℃培养箱内分别培养24小时、48小时、72小时以及96小时。
3)各观察期终止时，加入10μl/孔的CCK-8溶液，孵育2小时。震荡10分钟，在免疫酶标仪上450nm波长处测定其吸光度值。根据吸光度值，按下列公式计算细胞相对存活率(RGR)。
4)毒性分级：
| 分级 | RGR | 结果判定 |
| 0 | ≥100 | 促进细胞生长 |
| 1 | 75～99 | 无毒 |
| 2 | 50～74 | 结合细胞形态综合评价 |
| 3 | 25～49 | 有毒性 |
| 4 | 1～24 | 有毒性 |
| 5 | 0 | 有毒性 |
5)实验结果
实验结果如图2所示，图2为灵芝孢子活性成分冻干粉水溶液对人皮肤成纤维细胞(HSF)增殖活力的影响。
从图2中的吸光值计算出HSF细胞的相对存活率，结果显示灵芝孢子活性成分冻干粉对HSF细胞没有毒性作用，反而促进HSF细胞的增殖，随着灵芝孢子活性成分冻干粉溶液的浓度增高，对HSF细胞的增殖作用越发明显，且在24小时后开始逐渐增强，到96小时时达到高峰。
将实施例2提取得到的灵芝孢子活性成分用于抗衰老的化妆品中，如面膜，试用结果发现：陈女士，35岁，使用本实施例制备的面膜前面部有痘、痘痕和色斑，使用所述产品抗衰老面膜1个月后，面部的色斑和痘痕略有淡化，长痘趋势变弱；使用所述产品2个月后，色斑和痘痕明显变淡，些许长出几颗新痘；继续使用3个月后，面部的色斑和痘痕已经靠肉眼不容易看出，不再长痘。
实施例4
一种灵芝孢子活性成分的提取方法，包括以下步骤：
1、灵芝菌种的培养同实施例1
2、一级液体种子培养基培养同实施例1
3、液体深层发酵培养同实施例1
4、灵子孢子活性成分的提取
(1)收集：人工培养灵芝结束后，收集灵芝孢子。
(2)筛选：将灵芝孢子用200目筛网进行过滤，过滤杂质。
(3)漂洗：用无菌水冲洗过滤后的灵芝孢子。
(4)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0.5％纤维素酶和质量浓度为0.5％果胶酶组成的的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁3小时。
(5)低温真空干燥：将灵芝孢子置于-60℃环境(乙醇和干冰的混合物)中保存5小时，继续进行真空干燥处理。
(6)低温破壁：在-60℃环境中对灵芝孢子进行机械粉碎破壁，得到灵芝孢子提取物。
实施例5 制备灵芝孢子活性成分冻干粉
(1)收集灵芝孢子提取液，用0.25μM的滤膜对其进行过滤，浓缩。
(2)采用BCA法(Bicinchoninic acid)检测上清液中的蛋白浓度，通过浓缩方法调整浓缩液中蛋白浓度为50.5μg/ml。
(3)将得到的浓缩上清液用0.12μM的滤膜过滤除菌。
(4)除菌后进行冻干处理，冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为36小时，即得到灵芝孢子活性成分冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。
灵芝孢子活性成分冻干粉的质量检测
(1)肉眼观察灵芝孢子活性成分冻干粉产品为白色粉末状。按标示量1ml去离子水溶解后为澄清、透明的淡黄色液体。
(2)pH值的测定
采用精密pH测试仪检测灵芝孢子活性成分冻干粉的pH值。先校正pH测试仪，然后取冻干粉水溶液进行检测。该冻干粉水溶液的pH值在8.0。
采用HE染色法检测灵芝孢子活性成分冻干粉水溶液对HSF细胞形态的影响
1)制备HSF细胞悬液：同实施例1
2)实验分组：同实施例1
3)固定爬片：取出细胞爬片，用PBS溶液洗3次，每次5分钟，用4％的多聚甲醛固定细胞爬片30分钟。
4)弃固定液，苏木精染色12～15分钟，自来水洗3遍
5)镜下观察，若细胞核染色过深，用1％盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤2次。
6)浸入伊红染液染色5分钟，自来水洗涤3次。
7)自然晾干细胞爬片，用中性树胶封片
8)在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并拍照。
9)实验结果：在倒置显微镜下观察到细胞大多呈梭形或者多边形，与刚伸展的细胞形态相似。说明灵芝孢子活性成分冻干粉水溶液对HSF细胞形态影响不大。
将本实施例4提取得到的灵芝孢子活性成分用于抗衰老的化妆品中，如乳液，试用结果发现：周女士，40岁，使用本实施例制备的面膜前皮肤容易引发炎症、眼角有细纹、额头有皱纹。使用所述产品抗衰老乳液1个月后，皮肤出现刺痒、瘙痒等症状的情况减弱，眼角的细纹、额头的皱纹略有淡化；使用所述产品抗衰老乳液2个月后，皮肤出现刺痒、瘙痒等症状的情况明显减弱，眼角的细纹、额头的皱纹略明显淡化；继续使用4个月后，皮肤不会出现刺痒、瘙痒等症状，面部皮肤光泽富有弹性，眼角的细纹、额头的皱纹肉眼察觉不出。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，将准备好的灵芝孢子进行以下处理：
(1)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0.2-0.5％纤维素酶和质量浓度为0.2-0.5％果胶酶组成的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁；
(2)低温真空干燥：将灵芝孢子置于(-60℃)-(-20℃)下保存，真空干燥处理；
(3)低温破壁：在(-60℃)-(-20℃)下对灵芝孢子进行机械粉碎破壁，得到灵芝孢子提取物。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，软化所述灵芝孢子壁3-8小时。
3.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述灵芝孢子低温保存时间为1-5小时。
4.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，将所述灵芝孢子置于干冰和无水乙醇的混合物中，采用超声波进行机械粉碎破壁。
5.根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述灵芝孢子的准备包括以下步骤：
(1)收集：人工培养灵芝结束后，收集灵芝孢子；
(2)筛选：将灵芝孢子用筛网进行过滤；
(3)漂洗：用水冲洗过滤后的灵芝孢子。
6.根据权利要求5所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述灵芝孢子筛选采用200目以上的筛网进行过滤。
7.一种将权利要求1的灵芝孢子提取物制成灵芝孢子活性成分冻干粉的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)过滤：收集灵芝孢子提取液，用孔径小于0.45μM的滤膜过滤；
(2)浓缩：浓缩上清液，浓缩至浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml；
(3)过滤：经浓缩液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤；
(4)冻干处理：冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36小时，即得到灵芝孢子活性成分冻干粉。
8.权利要求7所述的灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗衰老扶护品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼箱、洗面乳。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中的添加量为1-5μg/ml。
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