CN110892988B - 一种针叶樱桃的破壁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物破壁方法，公开了一种针叶樱桃的破壁方法，包括步骤：将针叶樱桃破碎后在pH5.5～7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，加入果胶酶进行酶解，取沉淀真空冷冻干燥，得针叶樱桃单细胞；将所述针叶樱桃单细胞中加入pH7.4～8.0的磷酸盐缓冲液混匀，使得细胞溶胀；向溶胀后的针叶樱桃单细胞中加入无水乙醇，在二氧化碳氛围下加压，并保持一定时间后瞬间释放压力，得到含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。本发明克服了针叶樱桃破壁效率较低，使得有效成分的提取效率较低，造成原料浪费的缺陷，破壁效率相较于现有的破壁方法而言明显提升，从而使维生素C、蛋白质、芦丁及烟酰胺等的提取率得到了较大的提高。

Description

一种针叶樱桃的破壁方法
技术领域
本发明涉及一种植物的破壁方法，尤其涉及一种针叶樱桃的破壁方法。
背景技术
20世纪初，针叶樱桃(Malpighia emarginata D.C.)由热带美洲传至美国夏威夷，后经印度、东南亚各国开始在世界热带及亚热带地区广泛传播，在巴西的东北部的沙地里，有许多种植的和野生的巴西大樱桃树，现巴西已经成为最大的针叶樱桃种植国和出口国。
针叶樱桃富含维生素C，每100克果中维C含量达1677毫克，是柠檬的31倍，草莓的27倍，猕猴桃的18倍，也是被认为维生素C极高的番石榴的7倍，是名副其实的“天然维生素C之王”之一，同时还含有维A、维B1、维B2、维B3，铁、钙等元素，还含有蛋白质、糖、芦丁及烟酰胺等。维生素C是维持人体生命不可欠缺的重要成份，它能够防感冒，防坏血病，改善人体抵抗能力，对美容以及癌症有一定功效。在保健、饮料、美容方面有广泛的应用。芦丁有维生素P样作用和抗炎作用，能降低(如芥子油)对动物眼睛或皮肤引起的炎症，有强烈的抗氧性，把芦丁加入到富含溶酶体的匀浆内，能抑制类脂质过氧化物的形成。能强烈吸收在280～335nm范围内的紫外线，可用于防晒增白型化妆品,也可用作食用抗氧化剂和营养增强剂等。烟酰胺是维生素B3的一种衍生物，也是美容皮肤科学领域公认的皮肤抗老化成份，其在皮肤抗老化方面最重要的功效是减轻和预防皮肤在早期衰老过程中产生的肤色黯淡、发黄。另外，烟酰胺也可以修复受损的角质层脂质屏障，提高皮肤抵抗力。
由于针叶樱桃中的维生素C含量较高，使得针叶樱桃中维生素C的提取相较于其他的水果而言更加方便容易。但是现有的针叶樱桃在提取维生素C的过程中其提取率不高，水提液中提取的维生素C的含量最高仅占针叶樱桃总维生素C的70％～75％，另有大约20％以上的维生素C在提取过程中被浪费。例如专利申请号为CN201710959494.X的一种以针叶樱桃提取物、雨生红球藻和鱼胶原蛋白肽为原料的美容抗衰老食品及其制备方法，其在技术方案中记载了针叶樱桃的提取物的制备方法，其经过水提、过滤、真空浓缩、减压干燥，粉碎过筛即得。但是这种提取方法并不能对每一个针叶樱桃细胞进行破壁，使得无法完全提取其中的维生素C，在水提过滤之后的滤渣中依然含有较多的维生素C，因此维生素C的提取效率较低。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的针叶樱桃在提取其中的有效成分时，破壁效率较低，使得有效成分的提取效率较低，造成原料的浪费；因此本发明提供了一种针叶樱桃破壁的方法，本方法能够使得破壁率大大提升，从而为提升维生素C的提取率提供了可能，同时也会极大的提高针叶樱桃中蛋白质、芦丁以及烟酰胺的提取率。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种针叶樱桃的破壁方法，包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃破碎成2mm～3mm的碎块，在pH值为5.5～7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶，30～40℃、30～80rpm搅拌酶解3～6h，所得酶解物离心取沉淀，真空冷冻干燥，得到针叶樱桃单细胞；其中，所述针叶樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1：(5～20)；所述果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.1％～0.5％，所述果胶酶的酶活为5万U/g；
S2、细胞溶胀：将步骤S1所述针叶樱桃单细胞加入pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液混匀，静置，使缓冲液充分进入针叶樱桃单细胞溶胀，得到含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；其中，所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％以上；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入无水乙醇至液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％～55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12～28MPa，加压保持时间为10～30min，然后释放压力，释压时间0.1s，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
优选方式下，步骤S1所述取沉淀具体为：将所述酶解物在4000～5000rpm离心10～30min，取沉淀；所述真空冷冻干燥的条件为：-50℃、真空度10Pa。
优选方式下，步骤S2所述静置时间为10～30min；所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％～40％。
优选方式下，所述针叶樱桃的破壁方法，包括步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，加入其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液，浸泡24h，然后加入所述针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
现有针叶樱桃破壁技术中，通常第一步是将针叶樱桃进行研磨，使得细胞中的有效成分释放出来，但是由于机械研磨无法使得每一个细胞的细胞壁进行破壁，使得没有破壁的针叶樱桃中的有效成分无法充分提取，从而造成了浪费。
因此本发明中的针叶樱桃的破壁方法第一步的目的在于将细胞打散，使原本成为一体的针叶樱桃相互分离成为针叶樱桃单细胞。由于植物细胞的细胞壁与相邻的细胞的细胞壁之间通过胞间层固定连接，胞间层其主要成分为果胶，因此本发明采用果胶酶将细胞胞间层中的果胶分解，从而相邻的细胞之间便没有进一步的连接关系，从而更加容易分散为单个细胞。
将单个针叶樱桃细胞冷冻烘干后再加入微碱性缓冲液(即步骤S2所述pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液)，能够让针叶樱桃细胞溶胀，溶胀后具有以下作用：(1)使细胞壁软化易于破碎；(2)加入微碱性缓冲液后，其在第三步中加入的二氧化碳能够在高压的作用下更加容易地溶解于细胞中的缓冲液，使得细胞中的含气量大大提升。
当密闭容器在瞬间释压后，细胞中原本溶解的二氧化碳能够迅速释放，冲破细胞壁，使得每一个细胞的细胞壁能够在同时破坏。同时，本发明中在步骤(3)中还添加了一定量的无水乙醇，由于乙醇的沸点较低，其在释压后会迅速的汽化，从而进一步的使得细胞壁的破坏更加彻底。
本发明中在果胶酶催化过程中需要进行缓慢的搅拌，其原因在于过快的搅拌会造成对针叶樱桃细胞的剪切，从而在这一步骤中出现细胞破损，使得细胞中的有效成分在这一步骤中浪费，经过试验，当搅拌速率在30～80rpm下即能够使得针叶樱桃单细胞有效分离，又能够使得单细胞不会被剪切破损。
本发明中使用微碱性缓冲液的目的如下：(1)提升二氧化碳在针叶樱桃中的溶解量；(2)尽可能的防止针叶樱桃中的有效成分与失活。经过试验，本发明中当pH值为7.4～8.0时，其二氧化碳浓度以及针叶樱桃中的有效成分活性能够处于有效平衡。
本发明中在加压过程中的压力为12～28MPa，其能够有效将针叶樱桃单细胞进行压缩，其中有一部分的针叶樱桃在压缩过程中的细胞壁已经会出现破损或者裂缝，由于在巨大的压力下，二氧化碳能够随着施压时间的延续有效溶解于针叶樱桃内部的缓冲液中，当在瞬间释压的条件下，其中的二氧化碳、乙醇以及原本存在于细胞壁内部的空气便会迅速膨胀，将细胞壁撑破，从而实现了细胞壁的完全破裂，同时细胞内的Vc和其它成分如蛋白质、芦丁、烟酰胺也更容易被提取出来。
一种提取针叶樱桃中维生素C的方法，包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用破碎成2mm～3mm的碎块，浸泡在pH值为5.5～7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶，30～40℃、30～80rpm搅拌酶解3～6h，所得酶解物离心取沉淀，真空冷冻干燥，得到针叶樱桃单细胞；其中，所述针叶樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1：(5～20)；所述果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.1％～0.5％，所述果胶酶的酶活为5万U/g；
S2、细胞溶胀：将步骤S1所述针叶樱桃单细胞加入pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液混匀，静置，使缓冲液充分进入针叶樱桃单细胞溶胀，得到含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；其中，所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％以上；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞溶液中加入无水乙醇至液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％～55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12～28MPa，加压保持时间为10～30min，然后释放压力，释压时间0.1s，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取维生素C：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液与水按照质量比1:10混合，搅拌30～60min，离心取上清液，得维生素C粗提液；将所述维生素C粗提液用滤纸过滤，取滤液加入滤液质量的5％的活性炭，搅拌45min，将含有活性炭的滤液倒入含有5cm厚100～200目硅胶的砂芯漏斗中抽滤，得到精滤液，将所述精滤液真空冷冻干燥，得到维生素C粉末。
优选方式下，步骤S1所述取沉淀具体为：将所述酶解物在4000～5000rpm离心10～30min，取沉淀。
优选方式下，步骤S2所述静置时间为10～30min；所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％～40％。
优选方式下，步骤S4所述静置离心条件4000～5000rpm离心10～30min；所述真空冷冻干燥的条件为：-50℃、真空度10Pa。
一种提取针叶樱桃中蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用破碎成2mm～3mm的碎块，在pH值为5.5～7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶，30～40℃、30～80rpm搅拌酶解3～6h，所得酶解物离心取沉淀，真空冷冻干燥，得到针叶樱桃单细胞；其中，所述针叶樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1：(5～20)；所述果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.1％～0.5％，所述果胶酶的酶活为5万U/g；
S2、细胞溶胀：将步骤S1所述针叶樱桃单细胞加入pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液混匀，静置，使缓冲液充分进入针叶樱桃单细胞溶胀，得到含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；其中，所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％以上；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞溶液中加入无水乙醇至液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％～55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12～28MPa，加压保持时间为10～30min，然后释放压力，释压时间0.1s，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取蛋白质：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液中加入浓硫酸，调节PH值在1.0～2.0，进行搅拌提取，提取的温度在40℃、时间为2小时，布氏漏斗滤纸过滤取滤液；所述滤液经AB-8大孔树脂吸附至饱和，树脂柱的高径比为8:1～15:1，吸附为动态吸附；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为3～5BV，洗掉针叶樱桃水溶液中的水溶性杂质；用体积分数浓度为90％的乙醇进行洗脱，洗脱体积为6BV，收集洗脱液；洗脱液在真空度0.08Mpa，50℃条件下，经减压回收乙醇，得到针叶樱桃蛋白浓缩液；将所述针叶樱桃蛋白浓缩液真空冷冻干燥，得针叶樱桃蛋白粉成品。
优选方式下，步骤S1所述取沉淀具体为：将所述酶解物在4000～5000rpm离心10～30min，取沉淀。
优选方式下，步骤S2所述静置时间为10～30min；所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％～40％。
优选方式下，步骤S4所述真空冷冻干燥的条件为：-50℃，真空度10Pa。
一种提取针叶樱桃中芦丁的方法，包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃破碎成2mm～3mm的碎块，在pH值为5.5～7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶，30～40℃、30～80rpm搅拌酶解3～6h，所得酶解物离心取沉淀，真空冷冻干燥，得到针叶樱桃单细胞；其中，所述针叶樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1：(5～20)；所述果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.1％～0.5％，所述果胶酶的酶活为5万U/g；
S2、细胞溶胀：将步骤S1所述针叶樱桃单细胞加入pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液混匀，静置，使缓冲液充分进入针叶樱桃单细胞溶胀，得到含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；其中，所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％以上；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞溶液中加入无水乙醇至液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％～55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12～28MPa，加压保持时间为10～30min，然后释放压力，释压时间0.1s，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取芦丁：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，5000rpm离心10min后，取沉淀A；加入所述沉淀A质量1％～5％的硼砂、1％～5％的Na2SO3和所述沉淀A质量15～30倍的体积分数60％的乙醇水溶液，使用碳酸氢钠调节pH至9，再加入所述沉淀质量0.35％～0.45％的Tween 20和0.05％～0.15％的OP-15；在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤取滤液A，向所述滤液A中加入活性炭，30℃下避光搅拌10min，过滤除活性炭，取滤液B；在所述滤液B中加入盐酸酸化至pH＝3，静置30min，抽滤得芦丁粗品；所述活性炭和所述滤液B的质量体积比为：5:100g/ml。
优选方式下，步骤S1所述取沉淀具体为：将所述酶解物在4000～5000rpm离心10～30min，取沉淀。
优选方式下，步骤S2所述静置时间为10～30min；所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％～40％。
一种提取针叶樱桃中烟酰胺的方法，包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃破碎成2mm～3mm的碎块，在pH值为5.5～7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶，30～40℃、30～80rpm搅拌酶解3～6h，所得酶解物离心取沉淀，真空冷冻干燥，得到针叶樱桃单细胞；其中，所述针叶樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1：(5～20)；所述果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.1％～0.5％，所述果胶酶的酶活为5万U/g；
S2、细胞溶胀：将步骤S1所述针叶樱桃单细胞加入pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液混匀，静置，使缓冲液充分进入针叶樱桃单细胞溶胀，得到含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；其中，所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％以上；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞溶液中加入无水乙醇至液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％～55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12～28MPa，加压保持时间为10～30min，然后释放压力，释压时间0.1s，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取烟酰胺：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，加入其2～5倍体积的水，在30kHz、40～50℃条件下超声波提取15～25min之后过滤，取滤液A；将所述滤液A在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末A；将所述粉末A溶解在其10倍体积的无水乙醇中，过滤得滤液B；将所述滤液B在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末B；将所述粉末B溶解在其10倍体积的甘油中，过滤得滤液C；将所述滤液C在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末C，即为烟酰胺粗品。
优选方式下，步骤S1所述取沉淀具体为：将所述酶解物在4000～5000rpm离心10～30min，取沉淀。
优选方式下，步骤S2所述静置时间为10～30min；所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25％～40％。
因此，本发明具有以下有益效果是：
(1)破壁效率相较于现有的破壁方法而言明显提升；
(2)能够有效保持针叶樱桃内部有效成分的活性以及提取率；由于针叶樱桃细胞破壁率的提高，使得维生素C、蛋白质、芦丁及烟酰胺等的提取率都得到了较大的提高。
附图说明
图1为本发明压力与破壁率的关系曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。下述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于下述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
(1)细胞离析：将针叶樱桃打浆后浸渍于缓冲液中一定时间，然后加入果胶酶，缓慢搅拌下酶解一定时间，分离干燥得到针叶樱桃单细胞；
(2)细胞溶胀：将干燥针叶樱桃单细胞中加入微碱性缓冲液，使得细胞溶胀；
(3)压力破壁：将溶胀后的针叶樱桃单细胞转移到密闭容器中，再加入一定量的无水乙醇，然后将在二氧化碳氛围下加压，并保持一定时间后瞬间释放压力，得到破壁针叶樱桃细胞。
现有技术中的针叶樱桃通常第一步是将针叶樱桃进行研磨，使得细胞中的有效成分释放出来，但是由于机械研磨无法使得每一个细胞的细胞壁进行破壁，使得没有破壁的针叶樱桃中的有效成分无法提取，从而造成了浪费。
因此本发明中的针叶樱桃的破壁方法第一步的目的在于将细胞打散，使原本成为一体的针叶樱桃相互分离成为针叶樱桃单细胞。由于植物细胞的细胞壁与相邻的细胞的细胞壁之间通过胞间层固定连接，胞间层其主要成分为果胶，因此本发明采用果胶酶将细胞胞间层中的果胶分解，从而相邻的细胞之间便没有进一步的连接关系，从而更加容易分散为单个细胞。
将单个针叶樱桃细胞烘干后再加入微碱性缓冲液，能够让针叶樱桃细胞溶胀，溶胀后具有以下作用：(1)使细胞壁软化易于破碎；(2)加入微碱性缓冲液后，其在第三步中加入的二氧化碳能够在高压的作用下更加容易地溶解于细胞中的缓冲液，使得细胞中的含气量大大提升。
当密闭容器在瞬间释压后，细胞中原本溶解的二氧化碳能够迅速释放，冲破细胞壁，使得每一个细胞的细胞壁能够在同时破坏。同时，本发明中在步骤(3)中还添加了一定量的无水乙醇，由于乙醇的沸点较低，其在释压后也会迅速的汽化，从而进一步的使得细胞壁的破坏更加彻底。
作为优选，所述步骤(1)中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，其pH值为5.5～7，樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1：(5～20)，浸泡时间为1～3h。
作为优选，所述步骤(1)中果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.1％～0.5％，酶解温度为30～40℃，搅拌速率为30～80rpm，酶解时间3～6h。
本发明中在果胶酶催化过程中需要进行缓慢的搅拌，其原因在于过快的搅拌会造成对针叶樱桃细胞的剪切，从而在这一步骤中出现细胞破损，使得细胞中的有效成分在这一步骤中浪费，经过试验，当搅拌速率在30～80rpm下即能够使得针叶樱桃单细胞有效分离，又能够使得单细胞不会被剪切破损。
作为优选，所述步骤(1)中酶解完成后在4000～5000rpm下离心10～30min后得到针叶樱桃单细胞。
作为优选，所述步骤(2)中微碱性缓冲液为pH值为7.4～8.0的磷酸盐缓冲液。
本发明中使用微碱性缓冲液的目的如下：(1)提升二氧化碳在针叶樱桃中的溶解量；(2)尽可能的防止针叶樱桃中的有效成分与失活。经过试验，本发明中当pH值为7.4～8.0时，其二氧化碳浓度以及针叶樱桃中的有效成分活性能够处于有效平衡。
作为优选，所述磷酸盐缓冲液的添加量为干燥针叶樱桃单细胞质量的25～40％，混合均匀后静置10～30min。
作为优选，所述步骤(3)添加无水乙醇的至体系中液含量为45～55wt％。
作为优选，所述步骤(3)中密闭容器中的压力为12～28MPa，加压保持时间为10～30min，释压时间0.1s。
本发明中在加压过程中的压力为12～28MPa，其能够有效将针叶樱桃单细胞进行压缩，其中有一部分的针叶樱桃在压缩过程中的细胞壁已经会出现破损或者裂缝，由于在巨大的压力下，二氧化碳能够随着施压时间的延续有效溶解于针叶樱桃内部的缓冲液中，当在瞬间释压的条件下，其中的二氧化碳、酒精以及原本存在于细胞壁内部的空气便会迅速膨胀，将细胞壁撑破，从而实现了细胞壁的完全破裂。
实施例1
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其5倍质量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.1％、酶活为5万U/g的果胶酶，30rpm、30℃搅拌酶解3h，所得酶解物在4000rpm下离心10min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入25g、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置10min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入20g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12MPa，加压保持时间为10min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
实施例2
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
实施例3
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其10倍质量的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.3％、酶活为5万U/g的果胶酶，50rpm、35℃搅拌酶解5h，所得酶解物在4500rpm下离心20min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入35g、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置20min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的50％，在二氧化碳氛围下加压，压力为20MPa，加压保持时间为20min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
实施例4
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其8倍质量的pH值为5.8的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心14min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入30g、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置18min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入18g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的48％，在二氧化碳氛围下加压，压力为15MPa，加压保持时间为15min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
实施例5
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.45％、酶活为5万U/g的果胶酶，75rpm、37℃搅拌酶解4h，所得酶解物在4500rpm下离心28min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入38g、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置28min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入12g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的50％，在二氧化碳氛围下加压，压力为25MPa，加压保持时间为25min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
对比例1
本对比例使用传统机械研磨法对针叶樱桃进行破壁。
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，并放入热泵烘干抽湿机干燥，得颗粒物；
S2、将步骤S1获得的颗粒物用粉碎机进行粉碎，得破壁针叶樱桃粉，测得细粉粒的粒径分布D90为15～105um。
提取维生素C：取步骤S2所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，搅拌30min，4000rpm离心10min取上清液，得维生素C粗提液；将所述维生素C粗提液用滤纸过滤，取滤液加入滤液质量的5％的活性炭，搅拌45min，将含有活性炭的滤液倒入含有5cm厚100～200目硅胶的砂芯漏斗中抽滤，得到精滤液，将所述精滤液在-50℃、真空度10Pa下真空冷冻干燥，得到维生素C粉末。
提取蛋白质：取步骤S2所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，加入浓硫酸，调节PH值在1.0，进行搅拌提取，提取的温度在40℃、时间为2小时，布氏漏斗滤纸过滤取滤液；所述滤液经AB-8大孔树脂吸附至饱和，树脂柱的高径比为8:1，吸附为动态吸附；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为3BV，洗掉针叶樱桃水溶液中的水溶性杂质；用体积分数浓度为90％的乙醇进行洗脱，洗脱体积为6BV，收集洗脱液；洗脱液在真空度0.08Mpa，50℃条件下，经减压回收乙醇，得到针叶樱桃蛋白浓缩液；将所述针叶樱桃蛋白浓缩液在-50℃，真空度10Pa下真空冷冻干燥，得针叶樱桃蛋白粉成品。
提取芦丁：取步骤S2所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，得溶液，加入所述溶液质量1％的硼砂、5％的Na2SO3和15倍的体积分数60％乙醇水溶液，使用碳酸氢钠调节pH至9，再加入所述沉淀质量0.35％的Tween 20和0.15％的OP-15；在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤取滤液A，向所述滤液A中加入活性炭，30℃下避光搅拌10min，过滤除活性炭，取滤液B；在所述滤液B中加入盐酸酸化至pH＝3，静置30min，抽滤得芦丁粗品；所述活性炭和所述滤液B的质量体积比为：5:100g/ml。
提取烟酰胺：取步骤S2所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，在30kHz、40℃条件下超声波提取15min之后过滤，取滤液A；将所述滤液A在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末A；将所述粉末A溶解在其10倍体积的无水乙醇中，过滤得滤液B；将所述滤液B在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末B；将所述粉末B溶解在其10倍体积的甘油中，过滤得滤液C；将所述滤液C在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末C，即为烟酰胺粗品。
对比例2
本对比例使用传统酶解法对针叶樱桃进行破壁。
一种针叶樱桃的破壁方法，所述方法包括以下步骤：
S1、将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，浸泡在pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶进行搅拌酶解破壁，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀，将所述沉淀真空冷冻干燥，得到破壁针叶樱桃细胞粉；
其中，所述针叶樱桃与磷酸盐缓冲液的质量比为1:20；所述果胶酶的添加量为针叶樱桃质量的0.5％，所述果胶酶的酶活为5万U/g，所述酶解的温度为40℃，搅拌速率为80rpm，酶解时间6h。
提取维生素C：取步骤S1所述破壁针叶樱桃细胞粉与水按照质量比1:10混合，搅拌30min，4000rpm离心10min取上清液，得维生素C粗提液；将所述维生素C粗提液用滤纸过滤，取滤液加入滤液质量的5％的活性炭，搅拌45min，将含有活性炭的滤液倒入含有5cm厚100～200目硅胶的砂芯漏斗中抽滤，得到精滤液，将所述精滤液在-50℃、真空度10Pa下真空冷冻干燥，得到维生素C粉末。
提取蛋白质：取步骤S1所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，加入浓硫酸，调节PH值在1.0，进行搅拌提取，提取的温度在40℃、时间为2小时，布氏漏斗滤纸过滤取滤液；所述滤液经AB-8大孔树脂吸附至饱和，树脂柱的高径比为8:1，吸附为动态吸附；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为3BV，洗掉针叶樱桃水溶液中的水溶性杂质；用体积分数浓度为90％的乙醇进行洗脱，洗脱体积为6BV，收集洗脱液；洗脱液在真空度0.08Mpa，50℃条件下，经减压回收乙醇，得到针叶樱桃蛋白浓缩液；将所述针叶樱桃蛋白浓缩液在-50℃，真空度10Pa下真空冷冻干燥，得针叶樱桃蛋白粉成品。
提取芦丁：取步骤S1所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，得溶液，加入所述溶液质量1％的硼砂、5％的Na2SO3和15倍的体积分数60％乙醇水溶液，使用碳酸氢钠调节pH至9，再加入所述沉淀质量0.35％的Tween 20和0.15％的OP-15；在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤取滤液A，向所述滤液A中加入活性炭，30℃下避光搅拌10min，过滤除活性炭，取滤液B；在所述滤液B中加入盐酸酸化至pH＝3，静置30min，抽滤得芦丁粗品；所述活性炭和所述滤液B的质量体积比为：5:100g/ml。
提取烟酰胺：取步骤S1所述破壁针叶樱桃粉与水按照质量比1:10混合，在30kHz、40℃条件下超声波提取15min之后过滤，取滤液A；将所述滤液A在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末A；将所述粉末A溶解在其10倍体积的无水乙醇中，过滤得滤液B；将所述滤液B在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末B；将所述粉末B溶解在其10倍体积的甘油中，过滤得滤液C；将所述滤液C在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末C，即为烟酰胺粗品。
实施例6
一种针叶樱桃Vc的提取方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其5倍质量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.1％、酶活为5万U/g的果胶酶，30rpm、30℃搅拌酶解3h，所得酶解物在4000rpm下离心10min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入25g、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置10min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入20g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12MPa，加压保持时间为10min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取维生素C：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液与水按照质量比1:10混合，搅拌30min，4000rpm离心10min取上清液，得维生素C粗提液；将所述维生素C粗提液用滤纸过滤，取滤液加入滤液质量的5％的活性炭，搅拌45min，将含有活性炭的滤液倒入含有5cm厚100～200目硅胶的砂芯漏斗中抽滤，得到精滤液，将所述精滤液在-50℃、真空度10Pa下真空冷冻干燥，得到维生素C粉末。
实施例7
一种针叶樱桃Vc的提取方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取维生素C：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液与水按照质量比1:10混合，搅拌60min，5000rpm离心30min取上清液，得维生素C粗提液；将所述维生素C粗提液用滤纸过滤，取滤液加入滤液质量的5％的活性炭，搅拌45min，将含有活性炭的滤液倒入含有5cm厚100～200目硅胶的砂芯漏斗中抽滤，得到精滤液，将所述精滤液在-50℃、真空度10Pa下真空冷冻干燥，得到维生素C粉末。
实施例8
一种针叶樱桃Vc的提取方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其10倍质量的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.3％、酶活为5万U/g的果胶酶，50rpm、35℃搅拌酶解5h，所得酶解物在4500rpm下离心20min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入35g、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置20min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的50％，在二氧化碳氛围下加压，压力为20MPa，加压保持时间为20min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取维生素C：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液与水按照质量比1:10混合，搅拌45min，4000rpm离心30min取上清液，得维生素C粗提液；将所述维生素C粗提液用滤纸过滤，取滤液加入滤液质量的5％的活性炭，搅拌45min，将含有活性炭的滤液倒入含有5cm厚100～200目硅胶的砂芯漏斗中抽滤，得到精滤液，将所述精滤液在-50℃、真空度10Pa下真空冷冻干燥，得到维生素C粉末。
实施例9
一种提取针叶樱桃中蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其5倍质量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.1％、酶活为5万U/g的果胶酶，30rpm、30℃搅拌酶解3h，所得酶解物在4000rpm下离心10min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入25g、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置10min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入20g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12MPa，加压保持时间为10min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取蛋白质：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液中加入浓硫酸，调节PH值在1.0，进行搅拌提取，提取的温度在40℃、时间为2小时，布氏漏斗滤纸过滤取滤液；所述滤液经AB-8大孔树脂吸附至饱和，树脂柱的高径比为8:1，吸附为动态吸附；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为3BV，洗掉针叶樱桃水溶液中的水溶性杂质；用体积分数浓度为90％的乙醇进行洗脱，洗脱体积为6BV，收集洗脱液；洗脱液在真空度0.08Mpa，50℃条件下，经减压回收乙醇，得到针叶樱桃蛋白浓缩液；将所述针叶樱桃蛋白浓缩液在-50℃，真空度10Pa下真空冷冻干燥，得针叶樱桃蛋白粉成品。
实施例10
一种提取针叶樱桃中蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取蛋白质：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液中加入浓硫酸，调节PH值在2.0，进行搅拌提取，提取的温度在40℃、时间为2小时，布氏漏斗滤纸过滤取滤液；所述滤液经AB-8大孔树脂吸附至饱和，树脂柱的高径比为15:1，吸附为动态吸附；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为5BV，洗掉针叶樱桃水溶液中的水溶性杂质；用体积分数浓度为90％的乙醇进行洗脱，洗脱体积为6BV，收集洗脱液；洗脱液在真空度0.08Mpa，50℃条件下，经减压回收乙醇，得到针叶樱桃蛋白浓缩液；将所述针叶樱桃蛋白浓缩液在-50℃，真空度10Pa下真空冷冻干燥，得针叶樱桃蛋白粉成品。
实施例11
一种提取针叶樱桃中蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其10倍质量的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.3％、酶活为5万U/g的果胶酶，50rpm、35℃搅拌酶解5h，所得酶解物在4500rpm下离心20min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入35g、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置20min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的50％，在二氧化碳氛围下加压，压力为20MPa，加压保持时间为20min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取蛋白质：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，将所述溶液中加入浓硫酸，调节PH值在1.5，进行搅拌提取，提取的温度在40℃、时间为2小时，布氏漏斗滤纸过滤取滤液；所述滤液经AB-8大孔树脂吸附至饱和，树脂柱的高径比为10:1，吸附为动态吸附；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为4BV，洗掉针叶樱桃水溶液中的水溶性杂质；用体积分数浓度为90％的乙醇进行洗脱，洗脱体积为6BV，收集洗脱液；洗脱液在真空度0.08Mpa，50℃条件下，经减压回收乙醇，得到针叶樱桃蛋白浓缩液；将所述针叶樱桃蛋白浓缩液在-50℃，真空度10Pa下真空冷冻干燥，得针叶樱桃蛋白粉成品。
实施例12
一种提取针叶樱桃中芦丁的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其5倍质量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.1％、酶活为5万U/g的果胶酶，30rpm、30℃搅拌酶解3h，所得酶解物在4000rpm下离心10min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入25g、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置10min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入20g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12MPa，加压保持时间为10min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取芦丁：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，5000rpm离心10min后，取沉淀A；加入所述沉淀A质量1％的硼砂、5％的Na2SO3和所述沉淀A质量15倍的体积分数60％乙醇水溶液，使用碳酸氢钠调节pH至9，再加入所述沉淀质量0.35％的Tween 20和0.15％的OP-15；在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤取滤液A，向所述滤液A中加入活性炭，30℃下避光搅拌10min，过滤除活性炭，取滤液B；在所述滤液B中加入盐酸酸化至pH＝3，静置30min，抽滤得芦丁粗品；所述活性炭和所述滤液B的质量体积比为：5:100g/ml。
实施例13
一种提取针叶樱桃中芦丁的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取芦丁：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，5000rpm离心10min后，取沉淀A；加入所述沉淀A质量5％的硼砂、1％的Na2SO3和所述沉淀A质量30倍的体积分数60％的乙醇水溶液，使用碳酸氢钠调节pH至9，再加入所述沉淀质量0.45％的Tween 20和0.05％的OP-15；在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤取滤液A，向所述滤液A中加入活性炭，30℃下避光搅拌10min，过滤除活性炭，取滤液B；在所述滤液B中加入盐酸酸化至pH＝3，静置30min，抽滤得芦丁粗品；所述活性炭和所述滤液B的质量体积比为：5:100g/ml。
实施例14
一种提取针叶樱桃中芦丁的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其10倍质量的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.3％、酶活为5万U/g的果胶酶，50rpm、35℃搅拌酶解5h，所得酶解物在4500rpm下离心20min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入35g、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置20min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的50％，在二氧化碳氛围下加压，压力为20MPa，加压保持时间为20min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取芦丁：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，5000rpm离心10min后，取沉淀A；加入所述沉淀A质量3％的硼砂、3％的Na2SO3和沉淀A质量20倍的体积分数60％乙醇水溶液，使用碳酸氢钠调节pH至9，再加入所述沉淀质量0.4％的Tween 20和0.1％的OP-15；在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤取滤液A，向所述滤液A中加入活性炭，30℃下避光搅拌10min，过滤除活性炭，取滤液B；在所述滤液B中加入盐酸酸化至pH＝3，静置30min，抽滤得芦丁粗品；所述活性炭和所述滤液B的质量体积比为：5:100g/ml。
实施例15
一种提取针叶樱桃中烟酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其5倍质量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.1％、酶活为5万U/g的果胶酶，30rpm、30℃搅拌酶解3h，所得酶解物在4000rpm下离心10min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入25g、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置10min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入20g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％，在二氧化碳氛围下加压，压力为12MPa，加压保持时间为10min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取烟酰胺：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，加入其2倍体积的水，在30kHz、40℃条件下超声波提取15min之后过滤，取滤液A；将所述滤液A在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末A；将所述粉末A溶解在其10倍体积的无水乙醇中，过滤得滤液B；将所述滤液B在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末B；将所述粉末B溶解在其10倍体积的甘油中，过滤得滤液C；将所述滤液C在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末C，即为烟酰胺粗品。
实施例16
一种提取针叶樱桃中烟酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55％，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取烟酰胺：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，加入其5倍体积的水，在30kHz、50℃条件下超声波提取25min之后过滤，取滤液A；将所述滤液A在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末A；将所述粉末A溶解在其10倍体积的无水乙醇中，过滤得滤液B；将所述滤液B在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末B；将所述粉末B溶解在其10倍体积的甘油中，过滤得滤液C；将所述滤液C在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末C，即为烟酰胺粗品。
实施例17
一种提取针叶樱桃中烟酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，在其10倍质量的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.3％、酶活为5万U/g的果胶酶，50rpm、35℃搅拌酶解5h，所得酶解物在4500rpm下离心20min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入35g、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置20min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的50％，在二氧化碳氛围下加压，压力为20MPa，加压保持时间为20min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液；
S4、提取烟酰胺：取步骤S3所述含有破壁针叶樱桃细胞的溶液，加入其3倍体积的水，在30kHz、45℃条件下超声波提取20min之后过滤，取滤液A；将所述滤液A在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末A；将所述粉末A溶解在其10倍体积的无水乙醇中，过滤得滤液B；将所述滤液B在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末B；将所述粉末B溶解在其10倍体积的甘油中，过滤得滤液C；将所述滤液C在-50℃，真空度10Pa下进行真空冷冻干燥，得粉末C，即为烟酰胺粗品。
将实施例1～5中的破壁方法与传统机械研磨法(对比例1)以及酶解法(对比例2)进行测试，比较其破壁率。
破壁率的测定说明：将处理过的针叶樱桃细胞用显微镜放大400倍镜检。每个样重复制片3张，观察视野内的细胞破碎情况。计算如下:破壁率/％＝(1－视野中未破壁的细胞数/视野中细胞总数)×100％。
针叶樱桃破壁率、细胞直径如表1所示。
表1
本发明实施例和对比例每克针叶樱桃制备的维生素C、蛋白、芦丁和烟酰胺的含量如表2～表5所示。
维生素C(mg/g针叶樱桃)含量如表2所示。
表2
实施例6 实施例7 实施例8 对比例1 对比例2
18.8 19.9 18.5 13.2 16.6
蛋白(mg/g针叶樱桃)含量如表3所示。
表3
实施例9 实施例10 实施例11 对比例1 对比例2
3.25 3.36 3.31 1.86 2.01
芦丁(μg/g针叶樱桃)含量如表4所示。
表4
实施例12 实施例13 实施例14 对比例1 对比例2
4.1 4.5 4.2 2.3 3.1
烟酰胺(μg/g针叶樱桃)含量如表5所示。
表5
实施例15 实施例16 实施例17 对比例1 对比例2
59.5 62.3 61.4 35.8 45.9
从上表1中可以看出，通过本发明中的方法对针叶樱桃进行破壁后，其破壁率相较于传统的机械法以及酶解法而言明显提升，同时由于破壁率的提升，使得维生素C、蛋白、芦丁以及烟酰胺的提取率大大提高。
此外，本发明还探究了压力大小与破壁率之间的关系，包括以下步骤：
S1、细胞离析：取针叶樱桃用打浆机破碎成2mm～3mm的碎块，浸泡在其5倍质量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入针叶樱桃质量0.1％，酶活为5万U/g的果胶酶，30rpm、30℃搅拌酶解6h，所得酶解物静置30min，然后4000rpm下离心10min，取沉淀，将所述沉淀真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入25g、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置10min，使得细胞吸收溶胀，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入20g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45％，在二氧化碳氛围下加压，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
其结果如图1所示，我们发现随着压力的增加，破壁率有所提升，直到压力一定时，破壁率趋于平稳。
综上所述，本发明提供了一种针对针叶樱桃的新型破壁方法，该方法相较于传统的机械破壁以及酶解法破壁而言，破壁效率大大提升，从而提升针叶樱桃内部有效成分的活性以及提取率，节约了原料，降低了成本。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种针叶樱桃的破壁方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃破碎成2~3mm的碎块，在pH值为5.5~7的磷酸盐缓冲液中浸泡24h，然后加入果胶酶，30~40℃、30~80rpm搅拌酶解3~6h，所得酶解物离心取沉淀，真空冷冻干燥，得到针叶樱桃单细胞；其中，所述针叶樱桃与所述磷酸盐缓冲液的质量比为1:(5~20)；所述果胶酶的添加量为所述针叶樱桃质量的0.1%~0.5%，所述果胶酶的酶活为5万U/g；
S2、细胞溶胀：将步骤S1所述针叶樱桃单细胞加入pH值为7.4~8.0的磷酸盐缓冲液混匀，静置，得到含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；其中，所述磷酸盐缓冲液的添加量为所述干燥针叶樱桃单细胞质量的25%~40%；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入无水乙醇至液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的45%~55%，在二氧化碳氛围下加压，压力为12~28MPa，加压保持时间为10~30min，然后释放压力，释压时间0.1s，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
2.根据权利要求1所述针叶樱桃的破壁方法，其特征在于，步骤S1所述取沉淀具体为：将所述酶解物在4000~5000rpm离心10~30min，取沉淀。
3.根据权利要求1所述针叶樱桃的破壁方法，其特征在于，步骤S1所述真空冷冻干燥的条件为：-50℃、真空度10Pa。
4.根据权利要求1所述针叶樱桃的破壁方法，其特征在于，步骤S2所述静置时间为10~30min。
5.根据权利要求1所述针叶樱桃的破壁方法，其特征在于，包括步骤：
S1、细胞离析：将针叶樱桃用打浆机破碎成2mm~3mm的碎块，加入其20倍质量的pH值为7的磷酸盐缓冲液，浸泡24h，然后加入所述针叶樱桃质量0.5％、酶活为5万U/g的果胶酶，80rpm、40℃搅拌酶解6h，所得酶解物在5000rpm下离心30min，取沉淀；将所述沉淀置于-50℃、真空度10Pa的条件下，真空冷冻干燥，得到干燥针叶樱桃单细胞；
S2、细胞溶胀：取步骤S1所述干燥针叶樱桃单细胞100g，加入40g、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，混合均匀后静置30min，得含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液；
S3、压力破壁：将步骤S2所述含有溶胀的针叶樱桃单细胞的溶液中加入15g无水乙醇，使得液体含量为步骤S2所述干燥针叶樱桃单细胞质量的55%，在二氧化碳氛围下加压，压力为28MPa，加压保持时间为30min，然后在0.1s内瞬间释放压力，得含有破壁针叶樱桃细胞的溶液。
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