CN107893029A - 一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法 - Google Patents

一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法。所述复合破壁处理方法包括如下方法：在静置状态下，采用灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液对灵芝孢子粉进行浸润式萌发培养和孢壁酶解；经所述浸润式萌发培养和孢壁酶解后的所述灵芝孢子粉经干燥后进行机械破壁，即实现所述灵芝孢子粉的复合破壁处理。本发明方法对灵芝孢子粉进行萌动激发和孢壁酶解双重处理后，结合液氮低温脆化处理，不仅可以大幅缩短机械破壁处理时间，更好保存活性成分，有效减少机械杂质和重金属污染，避免外源酶污染，而且可以有效提高灵芝孢子粉的破壁率，实现灵芝孢子粉的绿色高效破壁。

Description

一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法
技术领域
本发明涉及一种灵芝孢子粉的破壁处理方法，具体涉及一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma Lucidum)是我国历史悠久的食药两用的名贵药材，具有保肝护肝、健脑健身等功能。灵芝孢子(Ganoderma Lucidum spore)作为灵芝的生殖细胞，不仅包含灵芝的全部活性物质，其有效成分、药用价值和保健价值高于灵芝子实体。灵芝孢子呈淡褐色至黄褐色，内含一油滴，卵形，直径约为(8.5～11.2)μm×(5.2～6.9)μm[7]，顶端常平截，双层壁，内孢壁有突起的小刺，外孢壁平滑，无色。
多糖是灵芝孢子中主要的活性物质之一，具有显著的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗HIV-1蛋白酶、提高免疫力等生理活性。灵芝孢子的双层壁由几丁质和葡聚糖构成，具有同心圆层网结构，质地坚韧、耐酸碱，极难氧化分解，限制了人体对孢子内有效物质的吸收利用。研究表明，未破壁的孢子只有约12％的有效成分能被人体吸收，而破壁后其吸收率可达95％以上，其抗肿瘤、抗氧化和免疫调节作用更加显著。
灵芝孢子直径只有5～7μm，其质地坚硬，破壁有一定困难，目前最常采用的灵芝孢子破壁方法是使用特殊工作原理和结构的粉碎机械对孢子粉进行物理破壁。该破壁方法操作简单易行，破壁率较高，但其破壁时间长、能耗高，破壁过程中大量产热，会导致部分热敏物质失活，同时破壁产品容易混入机械杂质，易造成重金属污染等。与机械破壁法相比，生物破壁法能耗低，破壁过程不产热，能最大程度地保留灵芝孢子中的活性成分。生物破壁法主要包括酶解法、菌溶法、激活孢子萌发法，现阶段生物破壁法存在的主要问题有：普通酶解法的酶解时间较长，破壁率较低，除去产品中残余的酶比较困难；菌溶法的破壁周期长，易受杂菌污染；激活孢子萌发法的萌发条件不易控制，萌发处理时间长，易受杂菌污染，而且破壁率不高等。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法，所述复合破壁处理方法首先是在灵芝孢子粉中接种添加同源灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液，在带菌丝发酵液(或发酵滤液)全部浸润并覆盖灵芝孢子粉后，调节环境温度，使灵芝孢子处于适宜萌发的条件，同时灵芝发酵液中的自源性破壁酶会对灵芝孢子粉的孢壁层进行酶解作用，在萌发培养和孢壁酶解的内外双重合力作用下，一定程度上破坏孢壁层内部结构；然后，采用液氮对灵芝孢子粉进行低温脆化处理，同时采用机械破碎法对经萌发酶解处理后的灵芝孢子粉进行物理破壁处理，最终获得破壁率高、活性损失小、生产周期短、重金属污染小、无外源酶污染的破壁灵芝孢子粉。本发明所采用的复合破壁处理方法在不破坏灵芝孢子粉活性成分的前提下，不仅可以缩短破壁处理时间，有效保持活性成分含量，避免外源酶污染，减小重金属污染，还可使灵芝孢子破壁率提高到90％以上。
本发明所提供的灵芝孢子粉的复合破壁处理方法，包括如下方法：
在静置状态下，采用灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液对灵芝孢子粉进行浸润式萌发培养和孢壁酶解；经所述浸润式萌发培养和孢壁酶解后的所述灵芝孢子粉经干燥后进行机械破壁，即实现灵芝孢子粉的复合绿色高效破壁处理。
上述的复合破壁处理方法中，将所述灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液覆盖所述灵芝孢子粉，调节环境温度，使灵芝孢子处于适宜萌发的条件，在静置状态下对灵芝孢子粉进行全浸润式萌发培养和孢壁酶解。
上述的复合破壁处理方法中，所述灵芝孢子粉经所述浸润式萌发培养和孢壁酶解之前要先进行湿热灭菌处理，以去除所述灵芝孢子粉中的其他杂菌，避免灵芝孢子萌发培养和孢壁酶解过程中的杂菌污染；
所述湿热灭菌的温度可为105～130℃，时间可为10～30min，灭菌后在灭菌锅中保温2～20h后干燥处理。
上述的复合破壁处理方法中，所述灵芝孢子粉与所述灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液的料液比可为1g：0.5～8mL，具体可为1g：1.7～7.7mL、1g：1.7mL、1g：2mL、1g：3mL、1g：5mL、1g：6mL或1g：7.7mL。
上述的复合破壁处理方法中，所述浸润式萌发培养和孢壁酶解处理是在避光条件下进行，温度可为25～35℃，时间可为2～4天。
上述的复合破壁处理方法中，所述灵芝菌丝体液态深层培养发酵液按照包括如下步骤的方法制备：
将灵芝菌丝体于种子培养基中进行摇瓶振荡培养得到种子液，然后接种于发酵培养基中进行液态发酵培养。
上述的复合破壁处理方法中，所述摇瓶振荡培养的温度可为25～30℃，时间可为2～4天；
所述发酵培养的温度可为25～30℃，时间可为3～8天；
所述种子液的接种量可为10～30％，即所述种子液的体积占所述发酵培养基的体积的比值。
上述的复合破壁处理方法中，所述种子培养基的组成如下：
葡萄糖10.0～20.0g/L；
酵母粉5.0～10.0g/L；
KH2PO4 1.0～5.0g/L；
MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L；
余量为水；
所述种子培养基的pH为4.0～8.0。
上述的复合破壁处理方法中，所述发酵培养基为下述(1)～(2)中任一种：
(1)11°～12°Brix的麦芽汁培养基或青稞汁培养基，；
具体可为下述a)～d)中任一种：
a)11°Brix的麦芽汁培养基，pH自然；
b)12°Brix的麦芽汁培养基，pH自然；
c)11°Brix的青稞芽汁培养基，pH自然；
d)12°Brix的青稞芽汁培养基，pH自然；
所述麦芽汁和所述青稞芽汁的制备方法如下：取一定量的麦芽(青稞芽)烘干、粉碎；加4～8倍量60℃的自来水，置于55℃～60℃的恒温箱中糖化4～6h，期间不断搅拌。取一滴糖化液和碘液进行反应，当碘呈色反应为无色时，证明糖化完成。将糖化液用纱布过滤，去残渣，回收滤液并煮沸，再用脱脂棉过滤一次，即得澄清的所述麦芽汁(青稞芽汁)；
(2)组成如下，为质量百分含量：
葡萄糖25.0～30.0g/L；
酵母粉5.0～15.0g/L；
KH2PO4 1.0～2.0g/L；
MgSO4·7H2O 1.0～5.0g/L；
余量为水；
所述种子培养基的pH为4.0～8.0。
上述的复合破壁处理方法中，所述干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
上述的复合破壁处理方法中，在对灵芝孢子粉进行低温脆化处理的同时进行所述机械破壁处理；
所述机械破壁处理的方式为研磨、珠磨、超微粉碎或高压喷射粉碎等。
上述的复合破壁处理方法中，所述低温脆化处理为液氮低温处理。
所述液氮低温处理方式为在破壁设备中加入液氮。
所述液氮低温处理中，所述灵芝孢子粉与液氮的料液比可为1g：2～10mL，可使破壁系统内环境温度瞬时降至-100～-200℃。
本发明为一种不破坏灵芝孢子有效活性成分的复合高效破壁方法。本发明方法首先采用灵芝液态深层培养发酵液或其滤液全部浸润并覆盖灵芝孢子粉后，调节环境温度，对灵芝孢子粉同时进行内部萌发和外部孢壁酶解双重处理，孢子粉然后经冷冻干燥处理，再进行机械破壁，在机械破壁的同时要对灵芝孢子粉进行低温脆化处理，实现灵芝孢子粉的绿色高效破壁。本发明采用的灵芝液态深层培养发酵液中含有一些由灵芝菌丝体在液态培养过程中产生的纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶等，上述酶系可使灵芝菌丝体在发酵培养的后期出现自溶，因此可以利用灵芝菌丝体作为溶壁菌、灵芝发酵液中的酶系作为灵芝孢子的破壁酶，同过在灵芝孢子粉中添加足够量的灵芝发酵液并调节环境温度，可实现对灵芝孢子粉的萌动激发和孢壁酶解双重处理，在内力和外力的双重作用下，使灵芝孢子壁的结构破坏，再结合低温脆化处理，可以大幅提高灵芝孢子粉机械破壁处理的破壁率，缩短破壁处理时间，减少机械污染和重金属污染。本发明方法对灵芝孢子粉进行萌动激发和孢壁酶解双重处理后，结合液氮低温脆化处理，不仅可以大幅缩短机械破壁处理时间，更好保存活性成分，有效减少机械杂质和重金属污染，避免外源酶污染，而且可以有效提高灵芝孢子粉的破壁率，实现灵芝孢子粉的绿色高效破壁。
附图说明
图1为破壁前和经本发明实施例1破壁后的灵芝孢子粉的红外光谱图。
图2为破壁前、一般机械法破壁后和经本发明实施例1破壁后的灵芝孢子粉的光学显微镜照片，依次为图2(A)、图2(B)和图2(C)。
图3为破壁前、一般机械法破壁后和经本发明实施例1破壁后的灵芝孢子粉的扫描电子显微镜照片，依次为图3(A)、图3(B)和图3(C)。
图4为本发明实施例2中湿热灭菌后干燥、湿热灭菌后与发酵液混合后、与发酵液混合静置萌动培养后和静置萌动培养后干燥后的孢子粉的照片，依次为图4(A)、图4(B)、图4(C)和图4(D)。
图5为经本发明实施例2破壁后的灵芝孢子粉中粗多糖的DPPH自由基清除率。
图6为经本发明实施例2破壁后的灵芝孢子粉中粗多糖的ABTS自由基清除率。
图7为经本发明实施例2破壁后的灵芝孢子粉中的多糖的羟基自由基清除率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
1、取0.2g灵芝孢子粉于105℃灭菌30min，在灭菌锅中保温8h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖2g，酵母粉0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·H2O 0.1g，水100mL，pH 6.0。
(2)发酵培养基：葡萄糖15g，酵母粉7.5g，KH2PO41g，MgSO4·H2O 0.5g，水500mL，pH6.0。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于种子培养基中25℃摇瓶振荡培养3天后，按照15％的接种量转接于发酵培养基中28℃培养5天。
3、无菌条件下取1.2mL发酵液加入到灭过菌的0.2g灵芝孢子粉中，混匀。
4、25℃，黑暗条件下静置培养3天。
5、将处理后的孢子粉置于冷冻干燥机中进行干燥处理。
6、将干燥后的孢子粉置于研钵中倒入2mL液氮，使体系温度为-180℃，研磨15min。
红外光谱检测：
采用KBr压片法，分别取适量破壁前和经本实施例破壁后的灵芝孢子粉，加入150mg的KBr粉末，充分研磨后用压片机压成薄片，应用傅立叶变换红外光谱仪VECTOR22进行扫描，扫描范围为4000～400cm-1，分辨率为4cm-1。
如图1所示，破壁前样品在1081cm-1处有峰，这个峰是纤维素和几丁质单体连接的化学键C-O-C的伸缩振动特征峰，破壁后减弱说明此化学键发生部分断裂。
多糖含量的测定：
分别取破壁前与经本实施例破壁后的灵芝孢子粉0.1g，加入7.5mL蒸馏水于70℃下水浴50min，冷却后离心，取上清液加入三倍体积95％乙醇水溶液，4℃沉淀12h，离心收集沉淀，用硫酸苯酚法测定多糖含量，测定结果如表1所示。
由表1中的数据可以看出，经本发明方法破壁后，灵芝孢子粉的多糖溶出率大大提高，为破壁前的3.6倍。
表1破壁前与经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的多糖含量
样品 多糖含量mg/mL
破壁前 0.5mg/mL
破壁后 1.81mg/mL
破壁率的测定：
在普通光学显微镜10×40倍下观察灵芝孢子粉的破壁情况，如图2所示，用血球计数板计算一般机械法破壁孢子粉的破壁率为26.35％，经本实施例破壁后的破壁率为91.06％。
扫描电镜观察：
在扫描电子显微镜5000倍下观察灵芝孢子粉的破壁情况，如图3所示。未破壁的灵芝孢子形态完整饱满，如图3(A)所示，电镜下可观察到孢子表面有许多小孔，每个孢子表面都有一处凸起的小圆形物，顶端一个小圆形凹坑，底端呈卵圆形。一般机械法破壁的孢子粉有部分孢子破裂，但数量不多，如图3(B)所示。经本实施例破壁后的孢子粉中绝大部分孢子的孢壁完全分解为数块残片，内容物全部溢出，只有个别的孢子没有完全破碎，如图3(C)。
实施例2、
1、取25g灵芝孢子粉于105℃灭菌20min，在灭菌锅中保温15h后烘干，如图4(A)所示。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖2g，酵母粉0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·H2O 0.1g，水100mL，pH 6.0。
(2)发酵培养基：葡萄糖15g，酵母粉7.5g，KH2PO41g，MgSO4·H2O 0.5g，水500mL，pH6.0。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于种子培养基中28℃摇瓶振荡培养3天后，按照15％的接种量转接于发酵培养基中25℃培养5天。
3、无菌条件下取150ml发酵液加入灭过菌的25g灵芝孢子粉中，混匀，如图4(B)所示。
4、25℃，黑暗条件下恒温萌动培养2天，如图4(C)所示。
5、将孢子粉置于冷冻干燥机中进行干燥处理，如图4(D)所示。
6、在超微粉碎机中加入125mL液氮，使体系温度为-190℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为94％。
体外抗氧化能力测定：提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖，与未破壁灵芝孢子粉粗多糖、一般机械法破壁灵芝孢子粉粗多糖、灵芝子实体粗多糖、灵芝液态发酵胞外粗多糖以及阳性对照Vc进行体外抗氧化能力的对比测定。
(1)DPPH自由基清除能力测定结果如图5所示：五种多糖以及阳性对照Vc均具有一定的DPPH自由基清除能力，可以看出，五种多糖中清除能力最强的是本发明方法破壁的灵芝孢子粗多糖，浓度为5mg/mL时清除率为84.6％。
(2)ABTS自由基清除能力测定结果如图6所示：五种多糖以及阳性对照Vc均具有一定的ABTS自由基清除能力，可以看出，五种多糖中ABTS自由基清除能力最强的是本发明方法破壁的灵芝孢子粗多糖，浓度为5mg/mL时清除率均为99.9％。
(3)羟基自由基清除能力测定结果如图7所示：五种多糖以及阳性对照Vc均具有一定的羟基自由基清除能力，可以看出，五种多糖中清除能力最强的是本发明方法破壁的灵芝孢子粗多糖，浓度为5mg/mL时清除率为91.0％。
综上所述，本发明复合法破壁灵芝孢子粗多糖的抗氧化活性显著高于未破壁灵芝孢子粗多糖、一般机械法破壁灵芝孢子粗多糖、灵芝子实体粗多糖以及灵芝液态发酵胞外粗多糖。
实施例3、
1、取75g灵芝孢子粉于121℃灭菌10min，在灭菌锅中保温8h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖1.5g，酵母粉0.75g，KH2PO40.2g，MgSO4·H2O 0.1g，水100mL，pH 5.0。
(2)发酵培养基：11°Brix的麦芽汁培养基500mL，pH自然。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中26℃
振荡培养3天后，按照12％的接种量转接于液体发酵培养基中26℃培养4天。
3、无菌条件下取150ml发酵液滤液加入到灭过菌的75g灵芝孢子粉中，混匀。
4、25℃，黑暗条件下恒温萌动培养2天。
5、将处理后的孢子粉置于喷雾干燥机中进行干燥处理。
6、在超微粉碎机中加入225mL液氮，使体系温度为-150℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为96％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。
实施例4、
1、取1kg灵芝孢子粉于121℃灭菌30min，在灭菌锅中保温5h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖20g，酵母粉8g，KH2PO41g，MgSO4·H2O 0.8g，水1L，pH4.0。
(2)发酵培养基：11°Brix的麦芽汁培养基5L，pH自然。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中30℃摇瓶振荡培养4天后，按照30％的接种量转接于液体发酵培养基中28℃培养4天。
3、无菌条件下取5L发酵液滤液加入到灭过菌的1kg灵芝孢子粉中，混匀。
4、28℃，黑暗条件下恒温萌动培养4天。
5、将处理后的孢子粉置于喷雾干燥机中进行干燥处理。
6、在研磨机中加入8L液氮，使体系温度为-195℃将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为98％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。
实施例5、
1、取3kg灵芝孢子粉于121℃灭菌25min，在灭菌锅中保温10h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖15g，酵母粉5g，KH2PO43.5g，MgSO4·H2O 1g，水1L，pH 8.0。
(2)发酵培养基：11°Brix的青稞汁培养基5L，pH自然。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中25℃摇瓶振荡培养2天后，按照13％的接种量转接于液体发酵培养基中32℃培养6天。
3、无菌条件下取5L发酵液加入到灭过菌的3kg灵芝孢子粉中，混匀。
4、35℃，黑暗条件下恒温萌动培养2.5天。
5、将处理后的孢子粉置于喷雾干燥机中进行干燥处理。
6、在珠磨机中加入6L液氮，使体系温度为-150℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为98％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。
实施例6、
1、取6.5kg灵芝孢子粉于125℃灭菌15min，在灭菌锅中保温10h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖100g，酵母粉60g，KH2PO430g，MgSO4·H2O 2g，水10L，pH7.5。
(2)发酵培养基：12°Brix的青稞汁培养基50L。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中25℃摇瓶振荡培养4天后，按照25％的接种量转接于液体发酵培养基中26℃培养7天。
3、无菌条件下取50L发酵液滤液加入到灭过菌的6.5kg灵芝孢子粉中，混匀。
4、26℃，黑暗条件下恒温萌动培养4天。
5、将处理后的孢子粉置于真空干燥机中进行干燥处理。
6、在高压喷射粉碎机中加入39L液氮，使体系温度为-195℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为97％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。
实施例7、
1、取30kg灵芝孢子粉于115℃灭菌15min，在灭菌锅中保温20h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖150g，酵母粉50g，KH2PO4 50g，MgSO4·H2O 5g，水10L，pH5.5。
(2)发酵培养基：葡萄糖1.25kg，酵母粉0.75kg，KH2PO4 0.1kg，MgSO4·H2O0.15kg，水50L，pH 7.0。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中27℃摇瓶振荡培养2.5天后，按照13％的接种量转接于液体发酵培养基中25℃培养7天。
3、无菌条件下取50L发酵液加入到灭过菌的30kg灵芝孢子粉中，混匀。
4、27℃，黑暗条件下恒温萌动培养2.5天。
5、将处理后的孢子粉置于真空干燥机中进行干燥处理。
6、在高压喷射粉碎机中加入300L液氮，使体系温度为-200℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为97％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。
实施例8、
1、取80kg灵芝孢子粉于130℃灭菌5min，在灭菌锅中保温10h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖0.8kg，酵母粉0.2g，KH2PO4 0.04kg，MgSO4·H2O 0.04kg，水40L，pH 6.5。
(2)发酵培养基：葡萄糖7.5kg，酵母粉3.75kg，KH2PO40.5kg，MgSO4·H2O 0.75kg，水250L，pH 7.0。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中25℃摇瓶振荡培养4天后，按照19％的接种量转接于液体发酵培养基中26℃培养4天。
3、无菌条件下取250L发酵液滤液加入到灭过菌的80kg灵芝孢子粉中，混匀。
4、29℃，黑暗条件下恒温萌动培养2天。
5、将处理后的孢子粉置于喷雾干燥机中进行干燥处理。
6、在超微粉碎机中加入560L液氮，使体系温度为176℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为99％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。
实施例9、
1、取300kg灵芝孢子粉于125℃灭菌10min，在灭菌锅中保温15h后烘干。
2、制备灵芝菌丝体液态深层培养发酵液：
(1)种子培养基：葡萄糖1.8kg，酵母粉0.9kg，KH2PO4 0.1kg，MgSO4·H2O 0.1g，水100L，pH 6.0。
(2)发酵培养基：葡萄糖15kg，酵母粉7.5kg，KH2PO41kg，MgSO4·H2O 0.5kg，水500L，pH 6.0。
(3)制备方法：将灵芝菌丝体于液体种子培养基中28℃摇瓶振荡培养3天后，按照20％的接种量转接于液体发酵培养基中28℃培养4.5天。
3、无菌条件下取500L发酵液加入到灭过菌的300kg灵芝孢子粉中，混匀。
4、30℃，黑暗条件下恒温萌动培养2天。
5、将处理后的孢子粉置于真空干燥机中进行干燥处理。
6、在高压喷射粉碎机中加入1200L液氮，使体系温度为-160℃，将孢子粉在其中进行破壁处理，孢子粉破壁率约为99％。
提取经本实施例破壁后的灵芝孢子粉的粗多糖进行如实施例2中的体外抗氧化能力测试，测试结果与实施例2中无实质性差异。

Claims (10)

1.一种灵芝孢子粉的复合破壁处理方法，包括如下方法：
在静置状态下，采用灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液对灵芝孢子粉进行浸润式萌发培养和孢壁酶解；经所述浸润式萌发培养和孢壁酶解后的所述灵芝孢子粉经干燥后进行机械破壁，即实现所述灵芝孢子粉的复合破壁处理。
2.根据权利要求1所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述灵芝孢子粉经所述浸润式萌发培养和孢壁酶解处理之前先进行湿热灭菌处理；
所述湿热灭菌的温度为105～130℃，时间为5～30min，灭菌后在灭菌锅中保温2～20h后进行所述干燥处理。
3.根据权利要求1或2所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述灵芝孢子粉与所述灵芝菌丝体液态深层培养发酵液或其滤液的料液比为1g：0.5～8mL。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述浸润式萌发培养和孢壁酶解在避光条件下进行，温度为25～35℃，培养与酶解时间为2～4天。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述灵芝菌丝体液态深层培养发酵液按照包括如下步骤的方法制备：
将灵芝菌丝体于种子培养基中进行培养得到种子液，然后接种于发酵培养基中进行发酵培养。
6.根据权利要求5所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述培养的温度为25～30℃，时间为2～4天；
所述发酵培养的温度为25～30℃，时间为3～8天；
所述种子液的接种量为10～30％。
7.根据权利要求5或6所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述种子培养基的组成如下：
葡萄糖 10.0～20.0g/L；
酵母粉 5.0～10.0g/L；
KH2PO4 1.0～5.0g/L；
MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L；
余量为水；
所述种子培养基的pH为4.0～8.0。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述发酵培养基为下述(1)～(2)中任一种：
(1)11°～12°Brix的麦芽汁培养基或青稞汁培养基，pH自然，溶剂为水；
(2)组成如下，为质量百分含量：
葡萄糖 25.0～30.0g/L；
酵母粉 5.0～15.0g/L；
KH2PO4 1.0～2.0g/L；
MgSO4·7H2O 1.0～5.0g/L；
余量为水；
所述种子培养基的pH为4.0～8.0。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的复合破壁处理方法，其特征在于：在低温脆化处理的同时进行所述机械破壁；
所述机械破壁的方式为研磨、珠磨、超微粉碎或高压喷射粉碎。
10.根据权利要求9所述的复合破壁处理方法，其特征在于：所述低温脆化处理为液氮低温处理；
所述液氮低温处理中，所述灵芝孢子粉与液氮的料液比为1g：2～10mL。
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