CN1298741A - 获取灵芝孢子萌动期活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在灵芝孢子萌动期通过破壁及超临界CO2流体萃取技术获取灵芝孢子萌动期活性物质的方法。筛选成熟饱满的灵芝孢子,经浸泡诱导催芽、萌动培养、破壁、超临界CO2流体萃取及萃取物分离等工序,萃取的呈油脂状的活性物质占萃取前灵芝孢子总重量的36.8%～37%。灵芝孢子萃取物可应用于肿瘤治疗及作为无毒副作用抗癌药物开发,并可作为一种端粒酶活性的抑制剂应用于临床治疗。
Description
本发明涉及一种在灵芝孢子萌动期通过破壁及超临界CO2流体(SFE-CO2)萃取技术获取灵芝孢子萌动期活性物质的方法。
灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌。灵芝孢子是灵芝成熟期从菌盖下部弹射出来的极微细的褐色卵形孢子(6-7×10-12μm)。据文献记载，灵芝孢子具有灵芝的全部遗传活性物质。由于灵芝孢子孢壁结构致密及异常坚韧，常规的提取方法很难抽提到灵芝孢子的有效活性物质，导致灵芝孢子壁囊内含量丰富的具有极其重要药用价值的呈油脂状的活性物质未被广泛应用。令人鼓舞的是，本发明在进行灵芝孢子催芽萌发实验中，不仅发现处于萌动期的灵芝孢子孢壁韧性明显降低，有利于提高破壁率，更重要的是发现处于休眠状态的灵芝孢子在萌动期被充分激活并产生具有诱导激发神经系统产生应急调节反应及激活机体免疫系统的极强生理活性物质。有文献指出，灵芝孢子的药效及价值与灵芝孢子的破壁技术或破壁率有关，破壁率越高的产品，越易被人体吸收。有研究指出，对灵芝孢子活性成分的测试，多糖类检测不适用于灵芝孢子样本。针对灵芝孢子生理活性成分与抗癌机理及其药物开发已受到广泛关注。
本发明的目的是提供一种获取灵芝孢子萌动期活性物质的方法，以使灵芝孢子得到充分、有效的利用。
本发明发现，及时采集用原木培植的灵芝孢子，由于新鲜程度高，养分供给充足，孢子成熟饱满，采用常规方法破壁，破壁率极高。实验发现，已破壁的灵芝孢子，可以将贮存在灵芝孢子壁囊内的呈油脂状的活性物质释出，经超临界CO2流体萃取，可获取高达37％的呈油脂状的活性物质；而未经破壁的灵芝孢子，同等条件萃取率不足3.5％。动物实验和临床试验结果表明，在灵芝孢子萌动期破壁萃取的活性物质生理活性极强，对肝癌及肝癌组织端粒酶活性有显著抑制作用；对HBV病毒感染者有显著疗效。医学报告指出，未破壁的灵芝孢子抑瘤率为23.2％；萌动期破壁的灵芝孢子抑瘤率为86.1％。可见灵芝孢子萌动期释出的具有极强生理活性物质对抑制肿瘤作用十分显著。
本发明的方法是在灵芝孢子萌动期通过破壁及超临界CO2流体萃取技术获取灵芝孢子萌动期活性物质，即利用在临界点附近，体系温度和压力的微小变化可导致溶解度发生几个数量级的突变及渗透力增强的特性来实现将灵芝孢子壁囊内呈油脂状的活性物质与孢壁分离，在超临界流体萃取装置内同时完成萃取和蒸馏两步操作，分离效率高，萃取的灵芝孢子活性物质能保留原有的生物活性，不氧化，无异味，无溶剂残留。灵芝孢子萃取物可应用于肿瘤治疗及作为无毒副作用抗癌药物开发，并可作为一种端粒酶活性的抑制剂应用于临床治疗。
本发明方法具体步骤如下：
一、原料：采集成熟饱满的灵芝孢子并经进一步严格筛选，最好确保选用成熟饱满的灵芝孢子。
二、浸泡诱导催芽：加入清水或蒸馏水、生理盐水或促使灵芝孢子快速萌发的营养液进行浸泡诱导催芽，如0.5％～25％灵芝子实体或灵芝菌丝体浸出液、0.1％～0.5％生物素培养液，可选用其中一种或一种以上，加入量是灵芝孢子重量的0.01倍～5倍。浸泡时间10min～8h，浸液温度16℃～43℃。
三、萌动培养：将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。培养箱的相对湿度为60％～98％，温度为16℃～48℃，萌动时间为10min～24h。处于萌动期的灵芝孢子孢壁韧性明显降低，有利提高其破壁率。
四、破壁：采用通常工业机械超微粉碎，或碾压，或磨碎等物理破碎方法进行超微破壁，选用的设备有碾压破壁，磨碎破壁，剪切滚磨破壁，超微粉碎破壁，超高速气流碰撞破壁，超高压微射流破壁，超低温粉碎破壁等类型设备，使灵芝孢子破壁。亦可以在破壁前在灵芝孢子中加入通常工业应用的几丁质酶，纤维素酶等水解酶，保持酶解适宜的条件如水分、温度、pH、酶解时间等，使孢壁被酶解软化并进一步失去韧性，再经机械方法破壁。
经酶解的破壁灵芝孢子通过高速离心装置或超滤薄膜装置分离水分。离心装置的转速为3000r/min～30000r/min；超滤薄膜装置滤孔分子量为10000。
五、将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜中，使其与超临界流体充分接触、溶解、萃取、分离，其工艺条件设定如下：萃取压力为5MPa～60MPa；萃取温度为32℃～85℃；CO2流体流量为5kg/h～80kg/h；萃取时间为0.5h～6h。萃取过程可以加入夹带剂，如乙醇、水等，加入量为投入原料量的2％～200％。
六、收集萃取物，经高速离心装置将加入夹带剂的乙醇或水与萃取物分离，离心装置的转速为3000r/min～30000r/min。
本发明方法萃取的呈油脂状的灵芝孢子萌动期活性物质占萃取前灵芝孢子总重量的36.8％～37％。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入5％灵芝子实体浸出液2kg，生理盐水150kg，进行浸泡诱导6h，水温32℃。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度90％，温度34℃，萌动时间为3h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．将经萌动激活的灵芝孢子经超微磨破壁，显微镜检验破壁率达99.6％。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内。萃取工艺条件为：压力为45MPa；温度为53℃；CO2流体流量为60kg/h；萃取时间为1.5h。
6．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为37kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味。
实施例二：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入1％生物素培养液20kg，蒸馏水250kg，进行浸泡诱导3h，水温43℃。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度60％，温度18℃，萌动时间为24h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．加入几丁质酶0.005kg，纤维素酶0.01kg，蒸馏水150kg。酶解条件为：温度43℃，pH为6.8，酶解时间为1.5h。在酶解过程中坚韧的孢壁逐渐失去韧性。经进一步采用超微粉碎机破壁处理，灵芝孢子破壁率为99.8％。
经酶解的破壁灵芝孢子通过高速离心装置分离水分，离心装置的转速为3000r/min。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入90％乙醇10kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力40MPa；温度为32℃；CO2流体流量为15kg/h；萃取时间为5h。
6．经高速离心装置将加入作为夹带剂的乙醇与萃取物分离，离心装置的转速为6000r/min。
7．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为36.9kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味，无溶剂残留。
实施例三：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入蒸馏水200kg，水温16℃，浸泡8h。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度98％，温度48℃，萌动时间为10min。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．加入几丁质酶0.01kg，纤维素酶0.02kg，蒸馏水200kg，酶解条件为：温度38℃，pH为6.8，酶解时间为3h。在酶解过程中坚韧的灵芝孢子孢壁逐渐失去韧性。经进一步采用碾压破碎破壁处理，使灵芝孢子破壁。
经酶解的破壁灵芝孢子通过超滤薄膜装置分离水分。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，萃取工艺条件为：压力为60MPa；温度为48℃；CO2流体流量为5kg/h；萃取时间为4.5h。
6．将萃取物称重，里油脂状的活性物质重量为36.9kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味。
实施例四：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入0.5％灵芝子实体浸出液10kg，0.1％生物素培养液10kg，清水200kg，水温25℃，浸泡30min。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度80％，温度16℃，萌动时间为24h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．经超高速气流碰撞破壁处理，显微镜检验破壁率达99.6％。
将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入无水乙醇50kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力为10MPa；温度为85℃；CO2流体流量为80kg/h；萃取时间为6h。
5．经高速离心装置将加入作为夹带剂的乙醇与萃取物分离，离心装置的转速为20000r/min。
6．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为37kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味，无溶剂残留。
实施例五：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入5％灵芝菌丝体浸出液50kg，0.1％生物素培养液5kg，水温38℃，浸泡5h。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度70％，温度30℃，萌动时间为1.5h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．加入几丁质酶0.02kg，蒸馏水180kg。酶解条件为：温度38℃，pH为6.4，酶解时间为4h。在酶解过程中坚韧的孢壁逐渐失去韧性。经进一步采用剪切滚磨破壁处理，灵芝孢子破壁率为99.9％。
经酶解的破壁灵芝孢子通过高速离心装置分离水分，离心装置的转速为15000r/min。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入蒸馏水50kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力为55MPa；温度为55℃；CO2流体流量为42kg/h；萃取时间为2h。
6．经高速离心装置将加入作为夹带剂的水与萃取物分离，离心装置的转速为20000r/min。
7．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为37kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味。
实施例六：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入20％灵芝子实体浸出液5kg，清水150kg，水温28℃，浸泡2h。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度65％，温度40℃，萌动时间为3h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．经超微粉碎破壁处理，显微镜检验破壁率达99.7％。
将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入95％乙醇200kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力为55MPa；温度为68℃；CO2流体流量为70kg/h；萃取时间为2h。
5．经高速离心装置将加入作为夹带剂的乙醇与萃取物分离，离心装置的转速为20000r/min。
6．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为37kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味，无溶剂残留。
实施例七：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入25％灵芝菌丝体浸出液20kg，清水150kg，进行浸泡诱导6h，水温22℃。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度75％，温度26℃，萌动时间为4h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．加入纤维素酶0.02kg，蒸馏水250kg。酶解条件为：温度45℃，pH为5.6，酶解时间为2h。在酶解过程中坚韧的孢壁逐渐失去韧性。经碾压破碎处理，灵芝孢子破壁率为99.7％。
经酶解的破壁灵芝孢子通过高速离心装置分离水分，离心装置的转速为15000r/min。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，萃取工艺条件为：压力为55MPa；温度为70℃；CO2流体流量为60kg/h；萃取时间为0.5h。
6．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为36.9kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味，无溶剂残留。
实施例八：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入1％生物素培养液20kg，蒸馏水150kg，进行浸泡诱导2h，水温40℃。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度88％，温度18℃，萌动时间为12h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．经剪切滚磨破壁处理，显微镜检验破壁率达99.9％。
经酶解的破壁灵芝孢子通过高速离心装置分离水分，离心装置的转速为25000r/min。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入95％乙醇70kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力为10MPa；温度为38℃；CO2流体流量为18kg/h；萃取时间为4h。
6．经高速离心装置将加入作为夹带剂的乙醇与萃取物分离，离心装置的转速为15000r/min。
7．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为37kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味，无溶剂残留。
实施例九：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入蒸馏水250kg，水温34℃，浸泡10h。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度80％，温度31℃，萌动时间为2h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．加入几丁质酶0.01kg，纤维素酶0.01kg，蒸馏水250kg。酶解条件为：温度44℃，pH为6.8，酶解时间为2h。在酶解过程中坚韧的孢壁逐渐失去韧性。经采用超微碾压破壁处理，灵芝孢子破壁率为99.9％。
经酶解的破壁灵芝孢子通过超滤薄膜装置分离水分。
5．将破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入蒸馏水2kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力为14MPa；温度为45℃；CO2流体流量为12kg/h；萃取时间为2h。
6．经高速离心装置将加入作为夹带剂的水与萃取物分离，离心装置的转速为30000r/min。
7．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为36.8kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味。
实施例十：
1．筛选成熟饱满的灵芝孢子100kg。
2．加入生理盐水200kg，水温22℃，浸泡6h。
3．将经浸泡的灵芝孢子放置于保温保湿通风培养箱中进行孢子萌动培养。湿度75％，温度34℃，萌动期时间为5h。经检查，灵芝孢子萌动率达95％，萌动期孢壁已明显软化。
4．经超高压微射流处理，显微镜检验破壁率达99.9％。
破壁灵芝孢子放入超临界CO2流体萃取装置的萃取釜内，加入85％乙醇65kg作为夹带剂，萃取工艺条件为：压力为14 MPa；温度为40℃：CO2流体流量为25kg/h；萃取时间为1h。
5．经高速离心装置将加入作为夹带剂的乙醇与萃取物分离，离心装置的转速为8000r/min。
6．将萃取物称重，呈油脂状的活性物质重量为37kg。经检测呈透明油状物，无沉淀，不氧化，有灵芝孢子特有香气，无异味，无溶剂残留。
Claims (8)
1．一种获取灵芝孢子萌动期活性物质的方法，其特征是灵芝孢子经浸泡诱导催芽、萌动培养、破壁、超临界CO2流体萃取及萃取物分离工序处理。
2．一种如权利要求1所述的方法，其特征是选用成熟饱满的灵芝孢子。
3．一种如权利要求1所述的方法，其特征是浸泡诱导催芽时加入清水、蒸馏水、生理盐水或促使灵芝孢子快速萌发的营养液——0.5％～5％灵芝子实体或菌丝体浸出液、0.1％～5％生物素培养液，选用其中一种或一种以上，加入量是灵芝孢子重量的0.01倍～5倍，浸泡时间10min～8h，浸液温度16℃～43℃。
4．一种如权利要求1所述的方法，其特征是萌动培养的相对湿度为65％～98％，培养温度为16℃～48℃，萌动时间为10min～24h。
5．一种如权利要求1所述的方法，其特征是破壁时采用机械超微粉碎，或碾压，或磨碎的物理破碎方法进行超微破壁。
6．一种如权利要求1所述的方法，其特征是破壁时加入几丁质酶和/或纤维素酶。
7．一种如权利要求1所述的方法，其特征是超临界CO2流体萃取压力为5MPa～60MPa；萃取温度为32℃～85℃；CO2流体流量为5kg/h～80kg/h；萃取时间为0.5h～6h。
8．一种如权利要求1所述的方法，其特征是超临界CO2流体萃取过程加入夹带剂乙醇和/或水，加入量是灵芝孢子重量的2％～200％。
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