CN1733754A - 一种从柿子中提取柿子多酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从柿子中提取柿子多酚的方法，它是一种以柿子为原料，经提取溶媒提取、浓缩、分离纯化、干燥提取柿子多酚的方法，它以水或低碳醇如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等作为溶媒；提取的方法采用水或低碳醇加热提取，也可以采用超声波提取、或者微波提取；分离纯化可以采用柱层析分离纯化。提取物中柿子多酚重量含量为70％以上；所述提取物中柿子多酚中抗氧化性能指标TEAC和ORAC显示柿子多酚具有极强的抗氧化活性，能有效去除过氧化物质。本发明方法生产的柿子多酚含量高、避免了活性成分的损失、简化了生产工艺、缩短了生产周期。
Description
技术领域
本发明涉及一种柿子提取物的制备方法，具体地说，涉及一种从柿子中提取柿子多酚的方法。
背景技术
柿子，除味道可口外，还有药用功效，具《本草纲目》记载：“食用柿子，能美容而补虚益肺。”柿蒂是止咳逆呕吐的良药；柿露清火解毒，对治便血有特效，又有治疗喉咙、口舌疮痛的功能。柿子还有润肺止咳、清热生津、化痰软坚之功效。鲜柿生食，对肺痨咳嗽虚热肺痿、咳嗽痰多、虚劳咯血等症有良效。红软熟柿，可治疗热病烦渴、口干唇烂、心中烦热、热痢等症。
植物中的多酚成分具有抗癌作用已得到证明，例如，绿茶中的儿茶素单体ECG和EGCG、棉籽中的棉子酚、柳树皮中的氯原酸、栎树和橡树中的栎精和橡精等都属于多酚类。德国科学家日前对多酚抑制肿瘤细胞生长的机理有了进一步认识，并且发现许多植物中都包含这种天然抗癌物质。研究小组在实验中选取了白血病细胞、肺部肿瘤细胞和乳腺癌细胞作为研究对象，结果发现，即使只有微量的多酚也能够抑制肿瘤细胞里的酶，而这些酶对引发肿瘤细胞生长“信号”分子的产生是必需的。在植物药疗法中，多酚被认为是预防和抑制肿瘤的物质。
柿子多酚不光具有抗癌作用，而且柿子中含有一类特殊的多酚物质，和现已发现的其它多酚类物质如葡萄籽多酚、松树皮多酚、茶多酚等相比存在很大的差异。其多酚类物质主要是由多个茶多酚结构聚合而成的一类大分子的物质，将此类多酚水解后可以得到具有强抗氧化生理活性的低聚体酚类物质，实验表明，抗氧化性能指标TEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)和ORAC(Oxygen RadicalAbsorbance Capacity)显示柿子多酚具有极强的抗氧化活性，能有效去除过氧化物质。
经过专利检索，目前还没有发现以柿子为原料提取柿子多酚的相关研究报导。
发明内容
本发明需要解决的技术问题就在以克服现有技术中没有以柿子为原料提取柿子多酚的缺陷，提供一种从柿子中提取柿子多酚的方法，本发明方法提取物中柿子多酚重量含量为70％以上。本发明方法生产的柿子多酚含量高、避免了活性成分的损失、简化了生产工艺、缩短了生产周期。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明从柿子中提取柿子多酚的方法，它是一种以柿子为原料，经提取溶媒提取、浓缩、分离纯化提取柿子多酚的方法，提取物中柿子多酚重量含量为70％以上。
本发明方法所用柿子可以为鲜柿子和/或干柿子。
本发明方法可以在提取前先将柿子进行破碎，柿子经破碎后有利于各种成分的充分溶出；鲜果将其榨碎即可。
本发明方法所述提取方法为加热提取或超声波提取或微波提取。
本发明方法所述提取方法为加热提取，提取次数是影响收率和含量的一个关键，一般提取次数为1～3次，根据试验，综合考虑提取设备使用空间的利用率及成品的有效物含量，提取次数最好为2次；溶媒用量为3～12倍，温度为40～100℃，提取时间为溶媒沸腾后1～3小时。
本发明所述柿子提取后需要进行回收低碳醇处理，温度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上，回收低碳醇的药液与原料重量比应控制在1∶2～5之间。
本发明方法中所述提取溶媒为水或低碳醇。所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇，所述低碳醇的重量浓度为1％～95％。
本发明方法所述超声波提取条件为工作频率15～80kHz，时间5～120min；微波提取条件为工作频率900～2500MHz，时间5～120min。
本发明所述分离纯化为柱层析分离纯化。
本发明柱层析分离纯化为：
1)提取液经浓缩(真空浓缩，温度控制在60摄氏度以下，真空度0.08MPa以上，浓缩至原来提取液体积的1/4-1/2)、回收低碳醇、离心(卧式离心机：4800r/min)后，直接进入大孔树脂柱，流速控制在0.5～1.5BV/hr左右；
2)用去离子水洗柱至流出液清澈，约2h；
3)用低碳醇洗柱至洗脱液澄清、透明，流速略慢于吸附的速度；
4)收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明，略带醇味的洗脱液，收集洗脱液约是树脂量的1～3倍左右；
5)醇水洗脱液经浓缩(真空浓缩，温度控制在60摄氏度以下，真空度0.06-0.1MPa，浓缩至10～15婆美度左右，即浓缩至原来提取液体积的1/4-1/2。)，干燥(喷雾干燥：进风口温度160～200℃，出风口温度80～110℃)得柿子多酚。
其中所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或戊醇，低浓度醇水溶液的浓度最低为体积浓度30％，高浓度醇水溶液的浓度最高为体积浓度95％；其中所述大孔树脂为以聚苯乙烯为骨架的材料，如DIAION品牌，型号为：D101、D130、AB-8或HP-20。
本发明方法制备的提取物中的柿子多酚中抗氧化性能指标TEAC和ORAC显示柿子多酚具有极强的抗氧化活性，能有效去除过氧化物质。
本发明方法生产的柿子多酚含量高，其重量含量为70％以上，避免了活性成分的损失、提高了生产工艺、缩短了生产周期。
柿子多酚中抗氧化性能指标TEAC(Trolox Equivalent AntioxidantCapacity)和ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity)抗氧化活性试验：
血清中ORAC的抗氧化性能试验
试剂准备：
1.225mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)：将39mL 0.45M NaH2PO4和61mL0.45M Na2HPO4混合，调节pH至7.0，用去离子水稀释至200mL(室温保存)；
2.60nM R-藻红蛋白(PE)：用10mL去离子水溶解19.80μL R-藻红蛋白(使用前摇匀)；
3.18mM AAPH：用10mL去离子水溶解488.1mg AAPH(使用前摇匀)
方法：
血清的前处理
1.将20μL的高氯酸和60μL血清于1.5-mL的试管中混匀；
2.然后，加入300μL n-丁醇，等待十秒钟；
3.将试管于12,000rpm离心十分钟；
4.移取50L的上浮液到另一1.5-mL的试管中；
5.用纯氮吹干；
6.加入2mL 225mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)
ORAC试验
1.将2mL预处理过的血清和2mL的PE于棕色试管中混匀；
2.37℃预孵卵5分钟；
3.通过在37摄氏度下加入2mLAAPH试剂开始荧光分析(激发光540nm，辐射光565nm)，在每3至5分钟将部分反应溶液转移至一小试管后测试荧光强度(如果荧光强度降低至原始值的20％以下，停止测试)
注意：
1.ORAC试验过程中要避光，关闭实验室荧光灯；
2.R-藻红蛋白处理后要及时使用；
3.AAPH溶解后，十分钟内必须使用，因为溶液不稳定；
4.ORAC实验后用1N HCl洗棕色试管，去除荧光蛋白。
血清中TEAC的抗氧化性能试验
试剂准备
(1)1.25mM trolox溶液(标准)
在10ml 5mM PBS(pH7.4)里溶解3.13mg Trolox，-20℃保存
(2)450mM过氧化氢(培养基)
将0.5ml 30％过氧化氢(H2O2)和9.3ml 5mM PBS混匀，4℃保存(使用时用5mM PBS稀释成450μM H2O2溶液)
(3)5mM ABTS(磷酸氢二氨)溶液(色原体)
将27.43mg ABTS溶解在10ml 5mM PBS中，4℃棕色试管避光保存(使用时用5mM PBS稀释至500μM ABTS溶液)
(4)70μM Met Mb溶液(色原体)
1)纯化Met Mb
将68mg肌球素(Mb)溶解于10ml 5mM PBS(400μM Mb)
将2.44mg of K3[Fe(CN)6]溶解于10ml 5mM PBS(740μMK3[Fe(CN)6])
取10ml 400μM Mb和10ml 740μM K3[Fe(CN)6]混合后，室温下放置，活化15分钟
将Met Mb溶液通过用5mM PBS平衡过的Sephadex G15-120柱(2.5φ×40cm)
用下面的公式计算洗提收率：
2)计算纯度和浓度
用下列的微平衡计算各部分的纯度：
[Met Mb]＝146A490-108A560+2.1A580
[Ferryl Mb]＝-62A490+242A560-123A580
[MbO2]＝2.8A490-127A560+153A580
(减去700nm处的值来修正背景吸收)
当总蛋白血红素＞95％收集Met Mb部分，用上面的公式计算洗出液中的浓度。
3)制备70μM Met Mb溶液
用5mM PBS稀释纯化后的Met Mb溶液，4℃保存
实验方法：
(1)36μL 70μM Met Mb到1.5-ml的样品试管中；
(2)向试管中加入300μl 500μM ABTS和487μl 5mM PBS
(3)加入10μl血清或1.25mM trolox溶液
(4)慢慢混匀后，将试管于0℃储存5分钟
(5)然后加入167μl 450μM H2O2，混匀，放置十秒钟
(6)室温下(20-25℃)精确控制时间，反应5分钟
(7)用紫外分光光度计于734nm测试样品
Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)
(1)参考每单位1.25mM trolox溶液来计算血清样品的吸光率
(2)参考1.00mM trolox来计算血清样品中TEAC(mM)的值
具体实施方式
实施例1
1)前处理：将柿子鲜果榨碎。
2)提取：将原料与去离子水按1∶3比例混合装入提取罐，加热至沸腾后保持温度2小时，收取第一次提取料液，第二次提取再加入3倍量的去离子水，加热沸腾保温2小时，收取第二次提取料液。
3)减压浓缩：将提取液导入浓缩器中进行减压浓缩，温度控制在60摄氏度以下，真空度控制在0.06MPa以上。
4)离心：将浓缩后的提取液通过离心机离心。
5)浓缩、离心后的提取液直接进大孔树脂柱；
6)用水洗柱至流出液清澈；
7)用乙醇洗柱至流出液无味；
8)收集从大孔树脂柱中的流出液；
9)洗脱液进行减压浓缩，浓缩至10婆美度；
10)喷雾干燥、灭菌包装
实施例2
1)前处理：将拣选、剔除杂质后的柿子干果和鲜果破碎；
2)提取：将合格的原料投入到洁净的提取罐中，加入5倍量65％(v/v)乙醇，第一次回流提取3h，从溶媒沸腾计时，控制温度80℃，保温到时，压出药液，第二次再加入3倍量65％(v/v)的乙醇回流提取2h，合并滤液；
3)回收乙醇：将提取的药液抽入浓缩罐中进行减压浓缩、回收乙醇，温度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上。回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
4)加水，静置，冷却：回收乙醇的药液与原料比应控制在1∶4左右，不够则加水，静置，冷却；
5)离心：将冷却的药液用离心机离心，药液应是无任何沉淀物；
6)柱吸附：将离心后的药液进D101树脂柱；
7)水洗：吸附完毕后，用去离子水进行水洗，水洗约2h左右。
8)洗脱：用70％(v/v)乙醇进行洗脱，收集略带醇味，且洗脱液澄清，透明，收集洗脱液约是树脂量的3倍左右；
9)浓缩：洗脱液进行减压浓缩，温度控制在60℃以下，真空度应控制在0.06MPa以上，浓缩至15波美度左右。
10)喷雾干燥、灭菌包装。
实施例3
1)前处理：将拣选、剔除杂质后的柿子干果破碎；
2)提取：将合格的原料与重量浓度为60％的乙醇按1∶10比例混合，进行超声波提取，提取条件为工作频率80kHz，时间120min，提取2次；
3)回收乙醇：将提取的药液抽入浓缩罐中进行减压浓缩、回收乙醇，温度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上。回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
4)加水，静置，冷却：回收乙醇的药液与原料比应控制在1∶4左右，不够则加水，静置，冷却；
5)离心：将冷却的药液用离心机离心，药液应是无任何沉淀物；
6)柱吸附：将离心后的药液进D101树脂柱；
7)水洗：吸附完毕后，用去离子水进行水洗，水洗约2h左右。
8)洗脱：用70％(v/v)乙醇进行洗脱，收集略带醇味，且洗脱液澄清，透明，收集洗脱液约是树脂量的3倍左右；
9)浓缩：洗脱液进行减压浓缩，温度控制在60℃以下，真空度应控制在0.06MPa以上，浓缩至15波美度左右。
10)喷雾干燥、灭菌包装。
实施例4
1)前处理：将拣选、剔除杂质后的柿子干果破碎；
2)提取：将合格的原料投入到洁净的提取罐中，加入10倍量85％(v/v)甲醇，第一次回流提取3h，，第二次再加入8倍量85％(v/v)的甲醇回流提取2h，合并滤液；
3)回收甲醇：将提取的药液抽入浓缩罐中进行减压浓缩、回收甲醇，温度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上。回收至无醇味后，将药液压入储液罐；
4)加水，静置，冷却：回收甲醇的药液与原料比应控制在1∶3左右，不够则加水，静置，冷却；
5)离心：将冷却的药液用离心机离心，药液应是无任何沉淀物；
6)柱吸附：将离心后的药液进HP20树脂柱；
7)水洗：吸附完毕后，用去离子水进行水洗，水洗约2h左右。
8)洗脱：用90％(v/v)甲醇进行洗脱，收集略带醇味，且洗脱液澄清，透明，收集洗脱液约是树脂量的3倍左右；
9)浓缩：洗脱液进行减压浓缩，温度控制在60℃以下，真空度应控制在0.06MPa以上，浓缩至15波美度左右。
10)喷雾干燥、灭菌包装。
Claims (13)
1、一种从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于它是一种以柿子为原料，经提取溶媒提取、浓缩、分离纯化提取柿子多酚的方法，提取物中柿子多酚重量含量为70％以上。
2、如权利要求1所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述柿子为鲜柿子和/或干柿子。
3、如权利要求1所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述提取方法为加热提取或超声波提取或微波提取。
4、如权利要求1所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述加热提取溶媒为水或低碳醇，提取次数为1～3次，溶媒用量为原料重量的3～12倍量；温度为40～100℃，提取时间为溶媒沸腾后1～3小时。
5、如权利要求4所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述柿子提取后需要进行回收低碳醇处理，温度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上，回收低碳醇的药液与原料重量比控制在1∶2～5之间。
6、如权利要求4或5所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。
7、如权利要求3所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：超声波提取条件为工作频率15～80kHz，时间5～120min。
8、如权利要求3所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：微波提取条件为工作频率900～2500MHz，时间5～120min。
9、如权利要求1所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述分离纯化为柱层析分离纯化。
10、如权利要求9所述从荔枝中提取荔枝多酚的方法，其特征在于：所述柱层析分离纯化步骤为：
A提取液经浓缩、回收低碳醇、离心后，直接进入大孔树脂柱，流速为0.5～1.5BV/hr；所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度控制在60℃以下，真空度为0.08MPa以上，浓缩至原来提取液体积的1/4-1/2；离心采用卧式离心机，转速为4800r/min；
B用去离子水洗柱至流出液清澈，时间为2h；
C用低碳醇洗柱至洗脱液澄清、透明，流速略慢于吸附的速度；
D收集从大孔树脂柱中的流出的澄清、透明，略带醇味的洗脱液，收集洗脱液是树脂量的1～3倍左右；
E醇水洗脱液浓缩、干燥，所述浓缩为真空浓缩，温度控制在60℃以下，真空度0.06-0.1MPa，浓缩至10～15婆美度；干燥为喷雾干燥：进风口温度160～200℃，出风口温度80～110℃。
11、如权利要求10所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或戊醇，低浓度醇水溶液的浓度最低为体积浓度30％，高浓度醇水溶液的浓度最高为体积浓度95％。
12、如权利要求11所述从柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于：所述大孔树脂为以聚苯乙烯为骨架的材料，型号为D101、D130、AB-8或HP-20。
13、一种如权利要求1-12之任一所述的制备方法制备的提取物，其特征在于：所述提取物中的柿子多酚中抗氧化性能指标TEAC和ORAC显示柿子多酚具有极强的抗氧化活性，能有效去除过氧化物质。
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