CN1958555A - 一种丹参酚酸a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹参酚酸A的制备方法，其工艺步骤为：1.提取；2.水沉和/或醇沉除杂；3.溶剂萃取法、液－液逆流分配色谱法和/或柱色谱法分离、纯化；4.柱色谱法或重结晶法精制；5.干燥。经步骤1～5，可以得到高纯度的丹参酚酸A，含量可达90％以上，且质量稳定，可大规模生产。

Description

一种丹参酚酸A的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物丹参酚酸A的制备方法，特别经过以下步骤1.提取；2.水沉和/或醇沉除杂；3.溶剂萃取法、液-液逆流分配色谱法和/或柱色谱法分离、纯化；4.柱色谱法或重结晶法精制；5.干燥。

背景技术

丹参酚酸A是中药丹参的一种活性成分，其结构式如下：

                   丹参酚酸A(Sal-A)

中药丹参是我国传统医学中常用药物之一，有活血祛瘀、通经活络等功效。其作为治疗心脑血管性疾病的药物，具有广泛的临床用药基础，且疗效显著，有悠久的临床应用历史。但关于丹参治疗心脑血管疾病的药效物质基础并不清楚，长期以来，一直认为脂溶性的丹参酮和水溶性的原儿茶醛、丹参素是其活性成分。复方丹参片、复方丹参滴丸、香丹注射液(复方丹参注射液)、丹香冠心注射液等临床常用药皆以脂溶性的丹参酮和/或水溶性的原儿茶醛/和或水溶性的丹参素为含量测定指标。

二十世纪80年代以后，国内外许多学者对丹参的水溶性成分进行系统的研究，分离得到丹参酚酸A，B，C，D，E，E，G，迷迭香酸，紫草酸，丹参素，原儿茶醛等酚酸类化合物。药理实验结果证明这些酚酸类化合物具有抗血栓、改善微循环、抗细胞脂质过氧化损伤等作用。其中丹参酚酸A活性最强，丹参酚酸B次之，而原儿茶醛和丹参素活性最弱。

目前，丹参的各类制剂在国内已是常用药物，在临床治疗心脑血管疾病，如：心绞痛、脑血管意外等方面占有非常重要的地位。其缺点是产品提取工艺落后，提取物中有效成份含量低，成分不明确；制剂稳定性差，疗效不稳定等。因此，改善并提高丹参制剂原料的提取工艺，提取其中活性最强组分丹参酚酸A及活性次强组分丹参酚酸B，使提取物化学成分明确，有效成分含量高，是提高丹参制剂的稳定性，提高药品质量，提高药效，确保疗效的关键。

中国专利，CN1247855A，2000年公开了采用水提后过树脂法提取丹参中酚酸的方法，因水提物杂质多，致使树脂再生率低，提取物酚酸含量低。在此基础上，中国专利，CN1384090A，2002年公开了改进的水提后醇沉再过树脂的提取方法，增加了醇沉工艺，提高了提取物中酚酸的含量，改善了树脂得再生率问题，但其提取物中占含量50％以上的成分为丹参酚酸B，活性最强的丹参酚酸A则含量极微。中国专利，CN1425659A，2003年公开了从丹参酚酸中提取丹酚酸B的方法，也存在上述的缺陷，丹参酚酸中活性最强的有效成分丹参酚酸A亦未能分离。中国专利，CN1513848A，2004年公开了采用水提、超滤、酸化后乙酸酯类萃取，再过反相柱的方法提取丹参中酚酸个组分的方法，所采用的提取及萃取方法文献中已有报道，过反相柱分离的方法在专利CN1425659A中已有提及，该方法没有说明如何具体分离到丹参中的酚酸各组分，对所分到的酚酸各组分的含量如何亦没有说明及相应的资料及数据证明。

此外，需要说明的是上述各方法均以丹参药材所含的酚酸类成分中含量最高的丹参酚酸B为指标对酚酸类成分的提取及分离纯化工艺进行考察及说明，而未提及如何提取和保留丹参中活性最强，但相对含量较低的成分丹参酚酸A。

由于丹参中丹参酚酸B含量极高，极大地干扰丹酚酸A的分离纯化，中国专利，CN200610012615.1，2006年公开了将丹参药材用水或醇提取，提取浓缩液后，采用高温高压反应，过柱色谱纯化丹酚酸A，再经调pH值，用有机溶剂萃取，浓缩干燥，制备含量80％以上丹酚酸A提取物的方法，该方法将提取液进行高温高压反应，目的是破坏丹参酚酸B，但是众多研究报道丹参酚酸类成分不稳定，易氧化降解、聚合，失去活性，在高温高压条件会促进氧化反应，所以该方法破坏丹参酚酸B的同时亦破坏了丹参酚酸A。同时，该专利萃取步骤采用酸调PH2～6，经氯仿或乙醚类有机溶剂萃取，弃去有机溶剂相除去脂溶性杂质，但在该条件下，丹参酚酸A亦处于脂溶性状态，被氯仿或乙醚类有机溶剂大量萃取除去，损失极大，存在严重缺陷。

中国专利CN1397276A，2003年公开了采用水醇提取后过柱(大孔吸附树脂、离子交换树脂或聚酰胺)除杂，再通过硅胶柱色谱梯度洗脱的方式制备丹参酚酸A，但该方法由于采用硅胶进行分离，存在死吸附较大、残留杂质较多、硅胶不能再生使用、使用氯仿等有机溶剂等缺点。

因此，优化丹参酚酸A提取工艺，寻找更经济合理的分离、纯化方法，是从丹参药材中提取活性最强组分丹参酚酸A，将其与含量很高的丹参酚酸B分离，从而得到高纯度的丹参酚酸A的关键。

我们通过研究发现，丹参酚酸A和丹参酚酸B虽然同属于酚酸类成分但其在理化性质方面却存在很大的不同。究其原因，可从分子结构方面来解释，虽然丹参酚酸A分子结构中较丹参酚酸B仅少了一个丹参素片段，但是，其极性较丹参酚酸B降低很大，在醇类、酮类及酯类等中等极性的溶剂中的溶解性变化很大，其水溶性较丹参酚酸B明显降低，此外，由于丹参酚酸A分子结构中较丹参酚酸B增加了一个两个苯环间的反式共轭双键，其化学稳定性较丹参酚酸B亦发生很大变化。

             丹参酚酸A(Sal-A)                                                    丹参酚酸B(Sal-B)

据此，我们以丹参酚酸A为指标，经过了大量、细致的工艺条件考察，对提取、除杂、分离、纯化、精制等工艺过程进行了深入研究，提出了丹参酚酸A的制备方法，制得了90％以上的丹参酚酸A提取物。该提取物经精制，可将丹参酚酸A纯化至95％以上，最优至98％以上。该方法将丹参酚酸A与丹参酚酸B高度分离，且工艺条件温和，最大程度地保留了丹参酚酸A与丹参酚酸B。在工艺过程不仅得到了高纯度的丹参酚酸A，还可得到较高纯度的丹参酚酸B。具体发明内容如下。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的缺陷，以丹参酚酸A为指标，提供一种丹参水溶性成分的有效制备方法，尤其是丹参酚酸A的制备方法。

本发明提供一种丹参酚酸A的制备方法，其工艺步骤为：

步骤1、丹参药材的提取

步骤2、提取液过滤、自然沉降或离心除去提取液中的固体杂质。

步骤3、除杂后的提取液水沉和/或醇沉

步骤4、分离丹参酚酸A

步骤5、丹参酚酸A的精制；

步骤6、精制的丹参酚酸A浓缩，干燥；

步骤7、一步或多步重结晶制备高纯度丹参酚酸A。

其中步骤1是将丹参饮片或丹参药材粗粉，在0～99℃温度下，用溶媒提取其中的酚酸类成分。所用提取溶媒可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂，其中优选的提取溶媒为0～60％乙醇。所用提取方法可以是加热回流、煎煮、浸渍、渗漉、超声提取、微波提取或高压提取等，其中优选方法是加热回流。

提取方法中，所述加热回流方法是可以为一次加热回流提取也可以为多次，所用溶媒可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂。现以50％乙醇两次加热回流的方法为例进行说明。

取丹参饮片或丹参药材粗粉，加50％乙醇适量，40℃以下浸泡0.5～3小时，然后加热至80～100℃回流提取1～3小时，分离第一次提取液，再50％乙醇适量，加热至80～100℃回流提取1～3小时，分离第二次提取液。两次提取溶媒用量分别为药材量的4～15倍。推荐方案为：第一次加10倍量溶媒，室温浸泡2小时，加热回流提取2小时，第二次加8倍量溶媒，加热回流提取1.5小时。合并两次提取液，采用过滤、自然沉降或离心法除去提取液中的固体杂质。

提取方法中，所述煎煮方法是指水煎煮提取，可以为一次提取也可以多次。现以三次提取的方法为例进行说明。

取丹参饮片或丹参药材粗粉，加水适量，40℃以下浸泡0.5～3小时，然后加热煎煮提取1～3小时，分离第一次提取液，再水适量，加热煎煮提取1～3小时，分离第二次提取液，再加水适量，加热煎煮提取1～3小时，分离第三次提取液。三次提取溶媒用量分别为药材量的4～15倍。推荐方案为：第一次加10倍量溶媒，室温以下浸泡2小时，煎煮提取2小时，第二次加8倍量溶媒，煎煮提取1.5小时，第三次加8倍量溶媒，煎煮提取1.5小时。合并三次提取液，采用过滤、自然沉降或离心法除去提取液中的固体杂质。

提取方法中，所述浸渍方法是可以为一次浸渍提取也可以为多次，所用提取溶媒可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂。提取温度根据所用溶媒性质，适当选用，采取加热或不加热的方式进行控制。现以50％乙醇两次浸渍提取的方法为例进行说明。

取丹参饮片或丹参药材粗粉，加50％乙醇适量，40℃以下浸泡小时，然后加热至40～70℃保温浸泡，分离第一次提取液，再加50％乙醇适量，加热至40～70℃保温浸泡，分离第二次提取液。两次提取溶媒用量分别为药材量的4～15倍。推荐方案为第一次加10倍量溶媒，室温浸泡0.5～3小时，再加热至40～70℃保温浸泡2～6小时，第二次加8倍量溶媒，加热至40～70℃保温浸泡2～6小时。合并两次提取液，采用过滤、自然沉降或离心法除去提取液中的固体杂质。

提取方法中，所述渗漉法具体方法是将丹参饮片或丹参药材粗粉，装入渗漉柱或桶中，边装边适当压实，渗漉柱或桶上部留出适当的体积，加入所用溶媒浸没所有药材，静置，浸泡2～6小时。打开渗漉柱或桶下端阀门，使渗漉液慢慢流出，每小时流出量为药材量的1～3倍，同时不断向渗漉柱或桶上端注入所用溶媒，保持浸没药材，以TLC法，三氯化铁显色观察渗滤液中酚酸类成分的含量，至显色反应较弱时停止渗漉。渗漉所用溶媒可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂。

提取方法中，所述超声提取具体方法是在浸渍法的基础上，提取过程在超声波下完成。

提取方法中，所述微波提取具体方法是在浸渍法的基础上，提取过程在微波下完成。

提取方法中，所述高压提取具体方法是在浸渍法的基础上，提取过程在高压下完成。

其中步骤2是采用过滤、自然沉降或离心除去提取液中的固体杂质。

其中步骤3是将提取液常压或减压浓缩，浓缩液采用水沉法和/或醇沉法除杂。沉淀的目的是：醇沉除去蛋白质、多糖等大分子物质，水沉除去树脂、粘液质等杂质。

(1)水沉：将提取液常压或减压浓缩，冷却后加入2～10倍药材量的去离子水，冷藏，静置，过滤得滤液。

(2)醇沉：将提取液或水沉滤液常压或减压浓缩，冷却后加入2～6倍药材量的无水乙醇，调解醇浓度为60～85％进行醇沉，静置，取上清液，减压浓缩。

其中步骤4是采用以下方法

溶剂萃取法与柱色谱法的组合；

或液-液逆流分配色谱法与柱色谱法的组合；

也可以直接采用柱色谱法。

所述溶剂萃取法，具体操作为取提取步骤中得到的提取液、沉淀步骤中得到水沉滤液、醇沉浓缩液中的一种，适当浓缩后用适量水分散，加酸碱调节pH＝0～8，接着用乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、氯仿，或这些溶剂的组合物萃取，有机部分回收溶剂，即得萃取物，可以采用一步或多步萃取的方法，该方法的优势在于可以高收率的将丹参酚酸A萃取出来，与其他大极性成分高度分离。其中有机溶媒优选的是乙酸乙酯，或乙酸乙酯-乙醇适当比例混合溶剂。

所述液-液逆流分配色谱法，其处理的对象是上述提取步骤所获得的产物，是先将提取物混悬于水中，加酸碱调节pH＝0～8，接着用乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、氯仿，或这些溶剂的组合物进行逆流分配，有机部分回收溶剂，即得萃取物。其中有机溶媒优选的是乙酸乙酯。

所述柱色谱法，所采用填料为聚酰胺类、非极性至中等极性大孔树脂(如：HPD100、HPD200、HPD300、D101、AB-8等/或类似型号)、离子交换树脂类、反相键合相(C8、C18)色谱柱填料，葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20、Sephadex G-10、Sephadex G-25)、MCIGEL-CHP-20P中的一种。所要处理的样品为上述提取步骤所获得的产物，或上述沉淀步骤的产物，或上述溶剂萃取法，或上述液-液逆流分配色谱法初步纯化后的产物中的一种。具体操作，包含以下步骤：

a、采用填料制备色谱柱；

b、所用色谱柱的活化；

c、除杂：样品溶液加至色谱柱，用水、醇或稀醇水溶液或丙酮-水溶液洗脱，除去杂质：

d、洗脱：除杂后的色谱柱用醇类、丙酮、乙腈或适当比例的醇-水溶液、丙酮-水溶液或乙腈-水溶液洗脱，得到高纯度的丹参酚酸A溶液。

所述柱色谱法步骤b、色谱柱的活化，方法为采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等任意一种溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂进行活化。

所述柱色谱法步骤c中，洗脱用水中可含微量的酸或无机盐。

所述柱色谱法步骤c中，可以单用水洗脱除杂质，或单用稀醇水溶液或低浓度的丙酮-水的混合溶剂洗脱除杂质；也可先用水洗脱然后再用稀醇水溶液或低浓度的丙酮-水的混合溶剂洗脱除杂质。

所述柱色谱法步骤c中，稀醇水溶液等溶剂可以为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等醇的水溶液，也可采用乙腈的水溶液，或它们的混合溶剂。

所述柱色谱法步骤c中，稀醇水溶液等溶剂的浓度一般在50％以下，常用为5％～40％，最好用10～30％的浓度，低浓度的丙酮-水溶液常用丙酮含量一般在60％以下，常用为10～50％，最好用15～25％的浓度。

所述柱色谱法步骤d中，适当比例的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有机相所占比例一般大于10％，常用为20％～100％，最好用40％～100％的浓度。

所述柱色谱法步骤c～d的洗脱过程可以采用等度洗脱方式也可以采用梯度洗脱的方式。其中：

等度洗脱为：仅用一种溶剂如醇类、丙酮、乙腈等或其与水的适当比例的混合溶剂洗脱，通过分段收集和TLC或HPLC监测，得到所需部分。优选为40～100％的甲醇或乙醇。

梯度洗脱为：先用水洗除杂，然后用低浓度醇或低浓度的丙酮-水溶液洗脱，再用较高浓度的醇或丙酮溶液等溶剂洗脱，最后用的醇类、丙酮、乙腈等或其与水的适当比例的混合溶剂洗脱。通过逐渐调整提高混合溶中的有机相的比例，使丹参酚酸A与丹参酚酸B及其他成分分离。其中，除杂步骤c中低浓度的醇-水溶液等溶剂的浓度在50％以下，低浓度的丙酮-水溶液丙酮含量在60％以下；最终洗脱步骤d中，适当比例的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有机相所占比例一般大于10％，常用为20％～100％，最好用40％～100％的浓度。

本方法的优势在于：经过了大量、细致的工艺条件考察，根据丹参酚酸A和丹参酚酸B在理化性质方面的区别，充分考察了二者在柱色谱洗脱过程中的时间差和溶剂梯度差，可先洗脱出丹参酚酸B，再进一步洗脱出丹参酚酸A，并结合TLC或HPLC监测跟踪，实现了丹参酚酸A和丹参酚酸B的高度分离。

步骤5、是对步骤4的分离物丹参酚酸A进行精制，精制1-3次。所采用的方法是步骤4中所列柱色谱方法的任意一种，或这些方法的任意组合。所用柱色谱的填料可以与步骤4相同也可以不同。优选为采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、反相键合相(C8、C18)、聚酰胺类色谱柱填料。

精制的目的是得到含量更高，纯度更好的丹参酚酸A。由于丹参原药材中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量相差悬殊，丹参酚酸B的含量在3％以上，而丹参酚酸A的含量经检测仅在0.01％～0.05％，由于丹参酚酸B的干扰，通过一次柱层析很难得到含量大于90％的丹参酚酸A，因此需要对得到丹参酚酸A进行进一步的精制。本发明所采用的方法为柱色谱法，可以为分离、纯化丹参酚酸A所列的柱色谱法中的任意一种方法，或这些方法的任意组合。

步骤6的浓缩采用低温减压浓缩；干燥采用喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥；

由于丹参酚酸类成分对热不稳定，且容易氧化，因此采用低温减压浓缩，喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。

步骤7将步骤4、5所得到的丹参酚酸A采用醇类、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等或其与水的适当比例的混合溶剂，经一步或多步重结晶后，可将丹参酚酸A纯化至95％以上，最优至98％以上。

本发明优选的制备方法如下：

1)、提取

取丹参饮片，加去离子水或0～30％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再加去离子水或0～50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液；合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质；

2)、沉淀

将提取液常压或减压浓缩至相对密度1.05～1.35，冷却后加入2～8倍药材量的去离子水或无水乙醇沉淀，静置，过滤得滤液，减压浓缩得浓缩液。

3)、柱色谱分离、纯化丹参酚酸A

浓缩液上预先处理好的非极性至中等极性大孔吸附树脂柱或聚酰胺柱或反相键合相色谱柱或葡聚糖凝胶柱，上柱样品与填料量之比为1∶5～200，洗脱方法为：

先用去离子水洗脱10～20个柱床体积除杂，继以5～20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约10～50％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B，再后用20～85％的乙醇水溶液洗脱丹参酚酸A，在洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A的过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待丹参酚酸B洗脱完全，再更换溶剂洗脱丹参酚酸A，继续监测，待丹参酚酸A完全洗脱下来，收集洗脱液。

4)、丹参酚酸A的精制

丹参酚酸A洗脱部分，减压回收溶剂，所得物再用制备型ODS柱分离，先用0～30％乙醇洗脱除杂、再以40～70％乙醇洗脱，HPLC监测，收集丹参酚酸A精制洗脱液；

5)、上述丹参酚酸A精制洗脱液、丹参酚酸B洗脱液，分别在60℃下，减压回收溶剂至无醇味，再经冷冻干燥，分别得到的丹参酚酸A提取物、丹参酚酸B提取物。

本发明的制备方法，以丹参酚酸A为指标，对提取、除杂、分离纯化等工艺过程进行了比较及研究，提出了优选的0～60％醇加热回流提取、两步沉淀除杂。然后通过柱色谱等手段，结合TLC检测手段，将丹参中含量很高的成分丹参酚酸B分离，得到纯度较高的丹参酚酸A溶液(丹参酚酸A的含量达到80％以上)，再对得到的丹参酚酸A用柱色谱手段进一步精制——纯化，制得了90％以上的丹参酚酸A提取物。该提取物经过一步或多步重结晶后，可将丹参酚酸A纯化至95％以上，最优至98％以上，可作为丹参酚酸A含量测定等质量控制的对照品。

本发明丹参酚酸A的制备方法，由于经过了大量、细致的工艺条件考察，所以在制备高纯度的丹参酚酸A的过程中，还可得到纯度较高的丹参酚酸B的提取物，利用它们在柱色谱洗脱过程中的时间差、溶剂梯度差，先洗脱出丹参酚酸B，再进一步洗脱出丹参酚酸A，可实现丹参酚酸A和丹参酚酸B的高度分离。在工艺过程中收集丹参酚酸B洗脱液，经过纯化，还可得到丹参酚酸B。

本发明经过比较研究，证明本发明工艺成熟、操作简单，所得产品质量稳定，含量高，可以大规模生产。使丹参中药理活性最强的丹参酚酸A和药理活性次强的丹参酚酸B得到充分分离，还可对丹参酚酸B进行加工利用，对于提高丹参类制剂疗效，充分利用药材资源等具有重要的意义。

附图说明

图1丹参酚酸A对照品的¹H谱

图2丹参酚酸A对照品的¹³C谱

图3丹参酚酸A对照品HPLC标准色谱图

图4按实施1制备的丹参酚酸A样品(丹参酚酸A含量＞80％)的HPLC色谱图

图5按实施1制备的丹参酚酸A样品(丹参酚酸A含量＞90％)的HPLC色谱图

图6丹参酚酸B对照品HPLC标准色谱图

图7按实施1制备的丹参酚酸B样品(丹参酚酸B含量＞80％)的HPLC色谱图

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的实用性，但不作为对本发明的限制。

实施例1：丹参酚酸A的制备方法

具体工艺步骤如下

1、提取(加热回流)：取丹参饮片，加30％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。

2、沉淀

将提取液常压或减压浓缩至相对密度1.06～1.10，冷却后加入8倍药材量的去离子水，冷藏，静置，过滤得滤液，减压浓缩；

3、柱色谱分离、纯化丹参酚酸A

浓缩液上预先处理好的D101大孔吸附树脂柱，上柱样品与树脂量之比为1∶4(W∶W)，先用去离子水洗脱20个柱床体积除杂，继以20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约50％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B，再后用80％的乙醇水溶液洗脱丹参酚酸A，在洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A的过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待丹参酚酸B洗脱完全，再更换溶剂洗脱丹参酚酸A，继续监测，待丹参酚酸A完全洗脱下来，收集洗脱液。

4、丹参酚酸A的精制

丹参酚酸A洗脱部分，减压回收溶剂，所得物再用制备型ODS柱分离，先用30％乙醇洗脱除杂、再以85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱流分。

5、上述丹参酚酸A精制洗脱液、丹参酚酸B洗脱液，分别在60℃下，减压回收溶剂至无醇味，再经冷冻干燥，分别得到丹参酚酸A提取物(其中丹参酚酸A含量为91.3％)、丹参酚酸B提取物(其中丹参酚酸B含量为92.5％)。

6、将步骤5所得到的丹参酚酸A提取物，采用乙醇多步重结晶，得到丹参酚酸A提取物(丹参酚酸A含量为99.1％)。

丹参酚酸A和丹参酚酸B的含量测定方法

(1)丹参酚酸A：用HPLC法测定，检测波长286nm，标准品丹参酚酸A由沈阳药科大学天然药物化学教研室提供，纯度98.1％。

(2)丹参酚酸B：按2005版药典丹参药材项下丹参酚酸B含量测定方法，用HPLC法测定，检测波长286nm，标准品丹参酚酸B购自中国药品生物制品检定所，纯度98.4％。

实施例2：与实施例1基本相同，所不同的是，提取过程为浸渍法，具体方法如下：

取丹参药材粗粉，加50％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至50～60℃保温浸泡4小时，分离第一次提取液，再加50％乙醇8倍量，加热至50～60℃保温2小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。

实施例3：与实施例1基本相同，所不同的是，水提取过程为煎煮法，具体方法如下：

取丹参饮片，加去离子水10倍量，室温浸泡2小时，然后加热煎煮提取2小时，分离第一次提取液，再加8倍量去离子水，加热煎煮提取1.5小时，分离第二次提取液，再加8倍量去离子水，加热煎煮提取1.5小时，分离第三次提取液。合并三次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。

实施例4：与实施例1基本相同，所不同的是，提取过程为渗漉法，具体方法如下：

取丹参药材粗粉，装入渗漉柱或桶中，边装边适当压实，渗漉柱或桶上部留出适当的体积，加入50％乙醇浸没所有药材，静置，浸泡4小时。打开渗漉柱或桶下端阀门，使渗漉液慢慢流出，每小时流出量为药材量的1.5倍，同时不断向渗漉柱或桶上端注入所用溶媒，保持浸没药材，以TLC法，三氯化铁显色观察渗滤液中酚酸类成分的含量，至显色反应较弱时停止渗漉。

实施例5：与实施例1基本相同，所不同的是，提取过程采用超声提取法，超声波能量为0.25W。

实施例6：与实施例1基本相同，所不同的是，提取过程采用微波提取法，微波能量为1W。

实施例7：与实施例1基本相同，所不同的是，提取过程采用高压提取法，压力为0.1KPa。

实施例8：与实施例1基本相同，所不同的是，沉淀过程先采用水沉淀法再采用醇沉淀法。

实施例9：与实施例1基本相同，所不同的是，沉淀过程仅采用醇沉淀法。

实施例10：与实施例1～9基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A和柱色谱精制丹参酚酸A的洗脱过程均采用的是甲醇水溶液。

实施例11：与实施例10基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A和柱色谱精制丹参酚酸A的洗脱过程均采用的是丙醇水溶液。

实施例12：与实施例10基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A和柱色谱精制丹参酚酸A的洗脱过程均采用的是乙腈水溶液。

实施例13：与实施例10基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A和柱色谱精制丹参酚酸A的洗脱过程均采用的是丙酮水溶液。

实施例14：与实施例1基本相同，所不同的是，柱色谱精制丹参酚酸A的过程采用的是C8键合相。

实施例15：与实施例1基本相同，所不同的是，柱色谱精制丹参酚酸A的过程采用的是Sephadex LH-20。

实施例16：与实施例1基本相同，所不同的是，柱色谱精制丹参酚酸A的过程采用的是离子交换树脂。

实施例17：与实施例12基本相同，所不同的是，柱色谱精制丹参酚酸A的过程采用的是MCIGEL-CHP-20P。

实施例18：与实施例14～17基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A的过程采用的均是离子交换树脂。

实施例19：与实施例14～17基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A的过程采用的均是聚酰胺类。

实施例20：与实施例14～17基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A的过程采用的均是葡聚糖凝胶类。

实施例21：与实施例14～17基本相同，所不同的是，柱色谱分离、纯化丹参酚酸A的过程采用的均是反相键合相C8或C18。

实施例22：与实施例1基本相同，所不同的是，分离、纯化丹参酚酸A的过程采用的是先用液-液逆流分配色谱，再用柱色谱分离、纯化。

实施例23：与实施例1基本相同，所不同的是，分离、纯化丹参酚酸A的过程采用的是先进行溶剂萃取，再用柱色谱分离、纯化。

Claims (11)

1、一种丹参酚酸A的制备方法，其特征在于，经过如下步骤：

步骤1、丹参药材的提取；

步骤2、提取液过滤、自然沉降或离心除去提取液中的固体杂质；

步骤3、除杂后的提取液沉淀除杂，采用水沉法和/或醇沉法；

步骤4、分离丹参酚酸A；

步骤5、丹参酚酸A的精制；

步骤6、精制的丹参酚酸A浓缩，干燥；

步骤7、一步或多步重结晶制备高纯度丹参酚酸A。

2、按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

步骤1所述丹参药材的提取是将丹参饮片或丹参药材粗粉，采用加热回流、煎煮、浸渍、渗漉、超声提取、微波提取或高压提取；

步骤3所述除杂后的提取液水沉法和/或醇沉是将提取液常压或减压浓缩，浓缩液采用水沉法和/或醇沉法除杂；

其中，

水沉步骤为：将提取液常压或减压浓缩，冷却后加入2～10倍药材量的去离子水，冷藏，静置，过滤得滤液；

醇沉步骤为：将提取液或水沉滤液常压或减压浓缩，冷却后加入2～6倍药材量的无水乙醇，调解醇浓度为60～85％进行醇沉，静置，取上清液，减压浓缩；

步骤4所述分离丹参酚酸A选自以下方法：

方法1、溶剂萃取法与柱色谱法的组合；

方法2、液-液逆流分配色谱法与柱色谱法的组合；

方法3、柱色谱法；

其中：

(1)溶剂萃取法：取步骤2中得到的提取液、步骤3中得到水沉滤液、醇沉浓缩液中的一种，适当浓缩后用适量水分散，加酸碱调节pH＝0～8，接着用乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、氯仿，或这些溶剂的组合物萃取，有机部分回收溶剂，即得萃取物，可以采用一步或多步萃取的方法；其中有机溶媒优选的是乙酸乙酯，或乙酸乙酯-乙醇适当比例混合物；

(2)液-液逆流分配色谱法：取步骤2中得到的提取液、步骤3中得到水沉滤液、醇沉浓缩液中的一种，适当浓缩后用适量水分散，加酸碱调节pH＝0～8，接着用乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、氯仿，或这些溶剂的组合物进行逆流分配，有机部分回收溶剂，即得萃取物；其中有机溶媒优选的是乙酸乙酯；

(3)柱色谱法：所采用填料为大孔吸附树脂类，离子交换树脂类、聚酰胺类、反相键合相色谱柱填料，葡聚糖凝胶、MCIGEL-CHP-20P中的一种；所要处理的样品为步骤3的产物，或上述溶剂萃取法，或上述液-液逆流分配色谱法初步纯化后的产物；柱色谱法的具体操作步骤如下：

a、采用填料制备色谱柱；

b、所用色谱柱的活化；

c、除杂：加至色谱柱，用水、醇或醇-水溶液或丙酮-水溶液洗脱，除去杂质；

d、洗脱：用醇类、丙酮、乙腈、醇水溶液、丙酮-水溶液或乙腈-水溶液洗脱，得到高纯度的丹参酚酸A溶液；

步骤5所述丹参酚酸A的精制是用柱色谱法进行精制，精制1-3次；

步骤7将步骤4、5所得到的丹参酚酸A采用醇类、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等或其与水的适当比例的混合溶剂，经一步或多步重结晶后，可将丹参酚酸A纯化至95％以上，最优至98％以上。

3、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述丹参药材的提取，所用提取溶媒选自水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或由这些溶剂按一定比例配成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂，其中优选结果为0～60％乙醇，提取方法选自煎煮、加热回流、浸渍渗漉、超声提取、微波提取或高压提取，其中优选方法是加热回流。

4、按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述沉淀中水沉除杂和醇沉除杂两种方法，可以同时采用或仅采用其中一种。

5、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述分离丹参酚酸A是溶剂萃取法或液-液逆流分配色谱法与柱色谱法的联合使用，先进行溶剂萃取或液-液逆流分配再用柱色谱法分离纯化。

6、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述分离丹参酚酸A是直接采用柱色谱法，用非极性至中等极性大孔树脂、离子交换树脂类、聚酰胺类、反相键合相色谱柱填料，葡聚糖凝胶、MCIGEL-CHP-20P中的一种。

7、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述柱色谱法的具体操作步骤c～d的洗脱过程可以用采用等度洗脱的方式也可以采用梯度洗脱的方式；

其中：

等度洗脱为：仅用一种溶剂如醇类、丙酮、乙腈等或其与水的适当比例的混合溶剂洗脱，通过分段收集和TLC监测，得到所需部分；优选为40～100％的甲醇或乙醇；

梯度洗脱为：先用水洗除杂，然后用低浓度醇或低浓度的丙酮-水溶液洗脱，再用较高浓度的醇或丙酮溶液等溶剂洗脱，最后用的醇类、丙酮、乙腈等或其与水的适当比例的混合溶剂洗脱；通过逐渐调整提高混合溶中的有机相的比例，使丹参酚酸A与丹参酚酸B及其他成分分离；其中，除杂步骤c中低浓度的醇-水溶液等溶剂的浓度在50％以下，低浓度的丙酮-水溶液丙酮含量在60％以下；最终洗脱步骤d中，适当比例的醇-水、丙酮-水或乙腈-水溶液中，有机相所占比例一般大于10％，常用为20％～100％，最好用40％～100％的浓度。

8、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5是在步骤4得到的丹参酚酸A含量低于90％时，对所得到的丹参酚酸A进行的精制，所采用的方法是步骤4中所列柱色谱方法的任意一种，或这些方法的任意组合；所用柱色谱的填料可以与步骤4相同也可以不同；优选为采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、反相键合相色谱柱填料。

9、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述柱色谱法步骤c中，可以得到富含的丹参酚酸B的洗脱部分，其丹参酚酸B的含量大于80％；步骤d中，可以得到富含的丹参酚酸A的洗脱部分，其丹参酚酸A的含量大于80％。

10、按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该方法得到的丹参酚酸A，其含量大于90％。

11、按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体工艺步骤如下

1)、提取

取丹参饮片，加去离子水或0～30％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再加去离子水或0～50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液；合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质；

2)、沉淀

将提取液常压或减压浓缩至相对密度1.05～1.35，冷却后加入2～8倍药材量的去离子水或无水乙醇沉淀，静置，过滤得滤液，减压浓缩得浓缩液；

3)、柱色谱分离、纯化丹参酚酸A

浓缩液上预先处理好的非极性至中等极性大孔吸附树脂柱或聚酰胺柱或反相键合相色谱柱或葡聚糖凝胶柱，上柱样品与填料量之比为1∶5～200，洗脱方法为：

先用去离子水洗脱10～20个柱床体积除杂，继以5～20％乙醇水溶液洗脱20个柱床体积除杂，再用约10～50％乙醇水溶液洗脱丹参酚酸B，再后用20～85％的乙醇水溶液洗脱丹参酚酸A，在洗脱丹参酚酸B和丹参酚酸A的过程中以TLC监测洗脱液中丹参酚酸B和丹参酚酸A的含量变化，结合HPLC监测，待丹参酚酸B洗脱完全，再更换溶剂洗脱丹参酚酸A，继续监测，待丹参酚酸A完全洗脱下来，收集洗脱液；

4)、丹参酚酸A的精制

丹参酚酸A洗脱部分，减压回收溶剂，所得物再用制备型ODS柱分离，先用0～30％乙醇洗脱除杂、再以40～70％乙醇洗脱，HPLC监测，收集丹参酚酸A精制洗脱液；

5)、上述丹参酚酸A精制洗脱液、丹参酚酸B洗脱液，分别在60℃下，减压回收溶剂至无醇味，再经冷冻干燥，分别得到的丹参酚酸A提取物、丹参酚酸B提取物。

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